新疆北疆部分地区鸡球虫病病原调查及分类鉴定

[目的]调查新疆北疆部分地区鸡球虫病病原分布情况,明确近年来新疆北疆地区鸡球虫病的致病种类情况.[方法]采用定点采样法,从沙湾、石河子、玛纳斯和昌吉等地采集病死禽的肠道直接进行粪便处理和病原学检查,收集新鲜粪样进行鸡球虫卵卵囊分离,进行孢子化卵囊培养和形态学观察,对鸡球虫进行虫种鉴定.[结果]鸡球虫的感染率为100;,共检出6种艾美耳球虫,分别为柔嫩艾美耳球虫(Etenella)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、哈氏艾美耳球虫(E.hagani)、布氏艾美耳球虫(E.Brunetti).其中柔嫩艾美尔球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫为新疆北疆地区鸡球虫病病原的优势虫种.[结论]研究对新疆部分北疆地区的鸡球虫原分布及其构成进行了初步确定,了解其病原水平,从而为该病防治中抗球虫药物的选择及代化用药方案提供必要数据,今后北疆地区预防和控制该病提供依据.     

鸡球虫共同抗原UCE免疫原性分析及其对多种球虫感染的免疫保护效果评估

[目的]在前期研究中,筛选到了存在于多种鸡球虫间的共同抗原泛素缀合酶结构域蛋白(UCE),本研究进一步分析其免疫原性,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[方法]提取纯化的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增堆型艾美耳球虫UCE基因(EaUCE),插入pVAX1质粒,构建真核表达质粒pVAX-EaUCE,通过RT-PCR和Western blot检测pVAX-EaUCE在鸡体内的转录和表达情况。经流式细胞术和间接ELISA法检测pVAX-EaUCE免疫后鸡体细胞免疫和体液免疫水平变化,分析其免疫原性。分别采用柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫及三者的混合卵囊人工感染雏鸡,观察感染前、后雏鸡体质量变化和排出卵囊减少量,评估其对多种球虫感染的免疫保护效果。[结果]EaUCE基因开放阅读框为444 bp,编码148个氨基酸,BLAST分析显示,柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫UCE氨基酸序列同源性均大于95%。pVAX-EaUCE能够在鸡体内成功转录和表达。pVAX-EaUCE免疫后,鸡体的CD_4~+/CD_3~+和CD_8~+/CD_3~+细胞比例显著升高,IFN-γ、IL-2、IL-4、TNFSF15、IL-17D、TGF-β4 mRNA和IgY抗体水平显著升高,表明免疫该质粒能诱导细胞和体液产生免疫反应(P0.05)。pVAX-EaUCE免疫后,与对照组相比,免疫组鸡体质量显著增加,卵囊产量明显下降,肠道损伤也相应减轻。[结论]鸡球虫共同抗原UCE具有良好的免疫原性,可对多种球虫感染提供部分免疫保护力,有望成为抵抗多种球虫感染的候选抗原。     

鸡堆型艾美耳球虫生物学方法鉴定

[目的]确定单卵囊分离获得的鸡球虫种类.[方法]采用生物学方法,测定该鸡球虫寄生部位、最短孢子化时间、潜伏期、孢子化卵囊和孢子囊大小等生物学特征.[结果]该鸡球虫主要寄生于十二指肠,卵囊呈卵圆形,囊壁光滑分为2层,囊内有1～3个折光性颗粒,未见卵囊残体;测100个孢子化卵囊大小为(13 ～22) μm×(11 ～ 16) μm,平均为16.96 μm×12.96 μm,形状指数1.31;测60个孢子囊大小为(8～ 13) μm×(5～8) μm,平均11.22 μm ×6.83 μm;最短孢子化时间为17 h,潜伏期为99 h.[结论]根据该鸡球虫的生物学特征及参考国内外文献,鉴定该鸡球虫为堆形艾美耳球虫(Eimeria acervulina).     

安徽部分地区鸡球虫种类及感染情况调查

为了解安徽省部分地区鸡球虫种类及感染情况,采用群体采样法分别从肥西县、长丰县和凤台县采集鸡新鲜粪样,用饱和盐水漂浮法检查。阳性粪样采用饱和盐水漂浮和离心沉淀法进行卵囊分离。显微镜下观察卵囊进行虫种鉴定,并统计各调查点的鸡球虫感染率和感染强度等。结果表明,鸡球虫感染率为93.3%(84/90);共检获7种球虫,即:柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、早熟艾美耳球虫(E.prae-cox)。     

鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株的分离与鉴定

[目的]鉴定鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株。[方法]采用单卵囊分离技术从西宁当地鸡粪便中获得1株纯种球虫,经鸡体传代增殖,对该虫体的寄生部位、潜伏期、孢子化时间、形态结构等指标进行观察和测定。[结果]该虫株寄生于鸡的盲肠,卵形指数为1．22,最短孢子化时间为18h,潜伏期为114h。卵囊为卵圆形,卵囊壁光滑,呈黄绿色,孢子化卵囊未见卵膜孔和卵囊残体;孢子化卵囊平均为20．08μm×16．55μm。孢子囊纺锤形,有一斯氏体,其平均大小为8．65μm×4．90μm。综合鉴定该球虫为柔嫩艾美耳球虫,并暂命名为柔嫩史美耳球虫西宁株。[结论]该研究为进一步研究球虫的致病性和药物效应奠定了基础。     

鸡球虫的分离与感染试验

[目的]为探讨长期有效的鸡球虫病防控方法奠定基础.[方法]分离并培养鸡球虫卵囊,通过感染雏鸡试验研究其卵囊发育和感染的过程.[结果]分离到的球虫卵囊大多形态饱满,为宽椭圆形,少数为卵圆形,壁光滑,中间明显可见1个圆形核,原生质呈淡褐色,卵囊大小约为18.5～25.5 μm× 16.7～22.5 μm.正常的孢子化卵囊多能见到分化明显的4个孢子,18 h可看到部分卵囊孢子化,36h孢子化达80％.接种后发病雏鸡的体重缓慢增加,血便明显,死亡率较高,同时解剖可见盲肠病变明显,肠壁增厚,严重者因充满大量血液而盲肠肿大.[结论]根据卵囊的形态、发病鸡的临床表现、卵囊寄生部位和盲肠病理变化等特征,初步判断分离的球虫主要为柔嫩艾美耳球虫.     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子体外脱囊试验

堆型艾美耳球虫早熟减毒株子孢子体外脱囊条件为0.75％胰酶,5％鸡胆汁,在38—40℃水浴箱内孵育2小时,脱囊率为94％。     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株细胞培养卵囊最佳收获时间的测定

堆型艾美耳球虫早熟减毒株在鸡胚小肠上皮细胞上培育,卵囊最佳收获时间为120小时。     

杭州地区鸡球虫种类研究

对杭州地区的杭州市区、桐庐及建德等地的大型鸡场及个体养鸡场球虫感染情况进行了调查，通过对球虫卵囊的分离、培养，孢子生殖阶段虫体的形态观察，卵囊、孢子囊大小及卵囊孢子化时间的测定，初步将卵囊分为A型、B型、C型三种类型。分别用这三种卵囊接种雏鸡纯繁后，收集的卵囊人工感染15日龄的小鸡，观察并记录接种后的发病时间，症状及病理变化等，参照有关文献，鉴定球虫种类。经分析判定，杭州地区主要存在3个种，它们分别是柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella)，毒害艾美耳球虫（E.necatrix)和巨型艾美耳球虫（E.maxima)。     

海口市文昌鸡球虫病流行调查

为了解海南省海口市文昌鸡球虫病的流行情况,采用群体采样法分别从该市文昌鸡主要养殖地区采集新鲜鸡粪,检查粪样。对阳性粪样采用饱和盐水漂浮和离心沉淀法进行卵囊分离,以质量分数为2.5%的重铬酸钾培养保存。显微镜下观察卵囊,进行虫种鉴定,并统计各调查点的鸡球虫种类、感染率和感染强度。检查雏鸡(15~42日龄)、中鸡(43~84日龄)和大鸡(85~130日龄)粪样各120份。结果显示,鸡球虫的感染率分别为75.8%、78.3%和26.7%。共检出7种球虫,均属艾美耳属,分别为毒害艾美耳球虫(Eimeria neca-trix)、堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)、巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)、柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)、和缓艾美耳球虫(Eimeria mitis)、哈氏艾美耳球虫(Eimeria hagani)和早熟艾美耳球虫(Eimeriapraecox)。结果表明,鸡球虫在海口市文昌鸡主要养殖地区普遍存在,有的调查点感染强度很高,养殖户的科学防治意识不强。     

菜豆荚斑驳病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆菜豆荚斑驳病毒(BPMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆BPMV CP基因,将其连接至pMD19-T Simple载体后对阳性克隆进行测序,检测其与已知病毒外壳蛋白基因序列的同源性;将CP基因定向插入双酶切的pET30a,构建其原核表达载体并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验克隆得到的CP基因大小为1 122 bp,与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;试验成功构建了原核表达载体pET30a-BPMV CP,发现重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导4 h条件下表达量最高。[结论]该研究为BPMV抗血清的制备与液相芯片检测方法的建立奠定了基础。     

Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备

[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒（FMDV）的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a（＋）质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5120。[结论]该研究结果为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

侧金盏花CBF转录激活因子基因片段的克隆

[目的]探索CBF转录激活因子基因在侧金盏花中是否存在。[方法]以侧金盏花基因组DNA为模板,根据拟南芥CBF基因序列的保守区设计1对特异性引物,通过PCR扩增获得1个DNA片段,将其克隆到pUCm-T载体中,转化大肠杆菌TG1,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]测序结果显示通过PCR扩增获得的基因片段长448 bp。在GenBank中检索,该序列与从拟南芥和其他作物中克隆的CBF同源基因序列同源性较低,说明是一个新的基因片段,初步认定该片段是侧金盏花CBF基因片段。[结论]该研究为进一步克隆侧金盏花CBF转录激活因子基因全长序列、鉴定其生物学意义奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子抗原的制备

[目的]为进一步研究柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）的单克隆抗体奠定基础。[方法]给肉鸡雏接种E．tenella纯种孢子化卵囊：第5～10天收集鸡的粪便并标记、粗提，经卵囊孢子化、纯化孢予化的卵囊、计数卵囊后，最终制备出子孢子抗原。[结果]该方法制备E．tenella子孢子抗原较其他方法简单易行，不需太多专门仪器和培养液，一般实验室均可进行，效果良好。但所用时间较长。[结论]该试验成功分离提纯出了鸡的E．tenella卵囊，并获得了蛋白浓度较高的抗原，为单克隆抗体的制备提供了有力保障。     

编码结构域Tt APuX25基因片段的分离与克隆

[目的]将Tt apux25基因片段克隆到表达载体pET21a(t)中。[方法]以热产硫化氢高温厌氧杆菌菌液为模板,根据编码结构域Tt APuX25的基因片段Tt apux25设计1对特异引物进行PCR扩增。将Tt apux25克隆到表达载体pET21a(+)中,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增获得一个250～500bp的扩增片段。对获得的阳性克隆进行筛选和测序鉴定,发现所得阳性克隆为表达载体pET21a(+)中插入有序列正确的Tt apux25片段。阳性克隆中的重组质粒被命名为pEX25,并将其转化进表达宿主菌大肠杆菌Tuner感受态细胞中。[结论]该方法直接将Tt apux25基因片段克隆到表达载体pET21a(+)中,操作简便并取得了较好的效果。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)(1354-1802)的原核表达及抗血清制备

[目的]制备人组织型纤溶酶原激活剂t-PA(1354-1802)抗血清,并测定其效价,为深入研究t-PA基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得t-PA(1354-1802)催化域基因片段,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,进行鉴定及序列分析;将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导、蛋白纯化及免疫兔试验。[结果]SDS-PAGE结果显示,37 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备t-PA蛋白抗血清,Western blot分析表明,抗血清可与标准品t-PA蛋白特异性结合,间接ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶12 800。[结论]成功制备了t-PA(1354-1802)抗血清,为t-PA基因功能的深入研究奠定了基础。     

鸡新城疫病毒F基因部分片段克隆表达及其抗体制备

[目的]为进一步研究新城疫病毒的分子结构和基因疫苗奠定基础。[方法]用自行设计的l对引物,通过RT-PCR从接毒的SPF鸡胚的尿囊液中克隆了新城疫病毒F基因部分片段,将该基因片段插入含谷胱甘肽(GST)基因的质粒pGEX-4T-1,构建了重组质粒,对提取的融合蛋白进行亲和层析纯化和琼扩、ELISA及W estern-blot检测。[结果]通过克隆和PCR扩增获得新城疫病毒F基因的部分片段,大小为509 bp;对构建的重组质粒pGEX-4T-1-F509经诱导表达,获得分子大小约为44 000 bp的融合蛋白,其中F基因的部分片段大小约18 000 bp;经亲和层析,获得纯化GST-F509融合蛋白,进一步用该蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗鸡新城疫病毒F蛋白抗体。[结论]琼脂扩散试验、ELISA及W estern-blot检测表明,该融合蛋白中的F片段具有良好的抗原性。     

淡紫拟青霉丝氨酸蛋白酶基因克隆表达及抗血清的制备

[目的]探索利用大肠杆菌进行丝氨酸蛋白酶PL基因的克隆与表达及抗血清制备的方法。[方法]根据报道的PL蛋白基因序列设计1对引物,通过RT-PCR扩增获得PL基因片段,对重组载体进行构建、鉴定和序列分析,用表达的特异蛋白条带制备抗原,免疫家兔制备抗血清。[结果]通过RT-PCR扩增得到长约850 bp的PL基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,获得的重组子pET-22b-PL转化E.coliBL21(DE3),经最终浓度为1 mmol/L IPTG诱导37℃培养4 h,获得约31 kDa大小的重组蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明,该蛋白表达量占菌体总蛋白的60%,说明该蛋白得到了高效表达。用表达的特异蛋白条带制备的免疫家兔制备抗血清,经ELISA测定效价为1/10 000。[结论]通过基因重组可获得PL基因在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性。     

中药方剂孢囊净对鸡球虫病的防治效果研究

[目的]筛选和探讨有效防治鸡球虫病的中药方剂。[方法]首先使用球虫孢子化抑制试验对常用的抗鸡球虫中药进行筛选,结合出血抑制试验筛选出常用的止血中药,并组成中药方剂＂孢囊净＂。选择120只15日龄海兰灰蛋雏鸡随机分为6组,阴性对照组饲喂正常饲料,不接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,其他5组均同时接种感染柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊1.0×104个/只,阳性对照组饲料中不添加任何药物,3个中药组分别按质量分数为0.5%、1.0%和1.5%孢囊净添加于饲料当中,西药组添加质量分数为0.01%磺胺喹啉钠饮水作为治疗对照,测定各组理化指标和抗球虫指数。[结果]1.0%和1.5%中药组均能明显减少红细胞的损失,与阳性对照组比较差异极显著（P〈0.01）,与西药组比较,差异显著（P〈0.05）;1.0%和1.5%中药组白细胞数量明显低于阳性对照组,差异极显著（P〈0.01）,凝血时间明显缩短,与阳性对照组相比差异显著（P〈0.05）;1.5%中药组抗球虫指数达到了193.53,为高效抗球虫中药。[结论]中药方剂孢囊净通过抑制球虫孢子化、杀灭球虫、减少出血等途径对鸡球虫病进行防治,达到良好的效果。     

6株肠艾美耳球虫繁殖力的比较研究

[目的]为肠艾美耳球虫的早熟选育及兔球虫疫苗的研制提供理论依据。[方法]采用6个不同地区肠艾美耳球虫的孢子化卵囊经口接种45日龄无球虫兔,接种剂量为1×104个卵囊/只,并对6株肠艾美耳球虫的繁殖力进行比较。[结果]衡水株排卵量最多,张家口株次之,胶南株排卵量最少。睢宁株的排卵量接近胶南株,如皋株、通江株相近,在感染后第8.5～9天均有排卵,各虫株的排卵高峰期相似,第13天排卵量达到峰值,第21天接近0。[结论]不同地理株肠艾美耳球虫的排卵量不同,但排卵高峰相一致。