酵母菌原生质体融合技术

介绍了原生质体融合技术在酵母菌选育中的应用研究概况,对原生质体的制备、再生、融合和筛选等步骤的操作要点、操作方法和技术参数作了详尽的叙述.原生质体融合技术为发酵工业开辟了更加广阔的发展前景.     

高效代谢木糖产乙醇酵母菌株的选育

采用原生质体融合,EMS与LiCl复合诱变,紫外照射与LiCl复合诱变,紫外、EMS及LiCl复合诱变等方法对季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和休哈塔假丝酵母(Candida shehatea)进行育种,以期得到能代谢木糖提高乙醇生产能力的突变菌株.结果表明:通过以上育种方式得到五个乙醇产量较高的菌株XX2,X1,X4,X12和X13,物理化学联合诱变后得到的X1,X4,X12,X13的乙醇产量分别比对照提高了30.9;,15.7;,84.9;,47.1;,融合子XX2与对照相比,乙醇产量提高了37.7;.高产突变株均来自出发菌株Candida shehatea,Candida shehatea选育后没有得到高产乙醇的突变菌株.     

不同虫生曲霉原生质体融合选育松墨天牛高毒力菌株

采用紫外或加热方法分别对虫生曲霉天牛生葡萄曲霉（Aspergillus vitis）和叶甲生烟曲霉（Aspergillus fumigatus var fumigatus）的原生质体分别进行灭活,然后对灭活双亲用PEG6000作融合剂进行原生质体融合。将融合子第2、第4、第6和第8代的菌落和分生孢子梗特征进行比较后,选出5株生长速度快、生产孢子多的融合株进行胞外蛋白酶的检测和松墨天牛幼虫毒力测试。结果发现,融合株U4-2对松墨天牛幼虫的死亡百分率为73.3%,和2个亲本相比较显著增强了毒力。     

双亲灭活原生质体电诱导融合法选育高漆酶活性菌株

以杏鲍菇和平菇为亲本菌株,采用双亲灭活原生质体融合技术选育高漆酶活性且遗传稳定的融合菌株。结果表明:杏鲍菇原生质体采用紫外灭活,在30 W紫外灯、照射距离30 cm条件下处理20 min,灭活率达100%。平菇原生质体采用热灭活,65℃处理30 min,灭活率达100%。两菌株按1∶1混合,施加1 MHz、250 V/cm的成串脉冲电压,5.5 kV/cm的融合脉冲电压的电场诱导下使其电融合,原生质体成对率达到70%,融合率为3.2×10-3。从147株融合菌株中筛选出1株高漆酶活性菌株F49,其漆酶和TTC-脱氢酶酶活比双亲分别提高20.6%和25.3%,遗传稳定性分别达到92.0%和92.7%以上。从菌落特征、菌丝形态、菌丝生长量、拮抗试验等方面对融合子进行鉴定,证实为具有双亲性状的融合株。     

原生质体融合选育高产多糖的罗尔阿太菌菌株

【目的】选育罗尔阿太菌多糖高产、草酸低产的优良罗尔阿太菌菌株.【方法】采用原生质体融合技术,以罗尔阿太菌菌株AY6657741为原始菌株,以紫外和亚硝基胍复合诱变的2株多糖高产的诱变株Ar-1和Ar-2为双亲菌株;通过正交试验优化原生质体的制备条件.【结果和结论】5.56 mmol·L^-1 的β-巯基乙醇处理菌悬液,0.4 mol·L^-1的 KCl作为渗透压稳定剂, 3.1 mg·mL^-1 的复合酶液（纤维素酶φ为2%、蜗牛酶φ为2%、溶壁酶φ为4%）,pH 5.5,32 ℃酶解55 min,原生质体形成率93.534%,再生率18.921%.0.4 g·mL^-1 的聚乙二醇6000在30 ℃条件下融合25 min,选育出1株多糖高产、草酸低产的菌株,命名为AY-3.菌株AY-3多糖产量达24.673 g·L^-1,比原始菌株AY6657741的产糖量提高了54.42%,草酸质量浓度降低至0.281 g·L^-1,比原始菌株草酸的质量浓度降低了43.57%.     

聚乙二醇法诱导烟草原生质体融合的条件优化

采用聚乙二醇(PEG)法诱导烟草原生质体融合,对融合时PEG的浓度、用量、融合时间及融合温度进行优化,以期得到一种融合率较高的方法。结果表明:以40%的PEG融合的二元融合率最高;PEG与原生质体悬浮液体积比为3∶5,在0.5～0.6 mol/L甘露醇为渗透压时,25～30℃下融合20～25 min的融合效果最佳,融合率始终保持在20%左右,甚至可达25%。     

灵芝原生质体融合HH系列菌株的选育研究

以灵芝菌株韩芝和红芝为亲本,进行原生质体融合,获得125株再生菌株,其中有锁状联合的菌株103株。与亲本的拮抗结果显示,在与双亲均有拮抗的20株中,10株能正常形成子实体,但菌株间性状差异显著,其中HH55、HH58和HH87具有突出的农艺性状,具有进一步开发应用的价值。     

用原生质体融合技术选育谷氨酸高产菌株

用适当方法制得枯草杆菌BR151(Trp~-,Lys~-,Met~-)和黄色短杆菌ZAU89101(Bio~-)的原生质体,在DNase存在条件下,用40％聚乙二醇(PEG)做助融剂,进行两菌株的原生质体融合。融合率为2.69×10~(-5)～3.6×10~(-6)。随机挑选10株融合子进行生化及谷氨酸发酵实验,证实了融合子的杂种性质。融合子的细胞、菌落形态和大小、形成芽孢能力及谷氨酸发酵能力等性状均较亲本有不同程度的变异。通过摇瓶发酵实验获得一株谷氨酸产率为7.29％以上的融合子。经长时间培养,此菌株仍保持了稳定性,因而具有应用前景。     

原生质体融合技术及其在嗜酸乳杆菌菌种选育中的应用

嗜酸乳杆菌是目前乳酸菌家族中极为重视研究与开发的益生菌之一,优质嗜酸乳杆菌对于其产品的产量、质量、生产效率等方面都有决定性的作用.本文论述了一种新兴的嗜酸乳杆菌育种技术--原生质体融合技术的原理及在嗜酸乳杆菌菌种选育中的应用和发展方向.     

原生质体融合选育耐高温耐盐红螺菌的研究

为选育耐高温耐盐红螺菌用于其粉状制剂研制,以降解水产养殖水体亚硝基氮功能达90%以上的耐盐红螺菌与能在60～70 ℃下生长的嗜热脂肪芽孢杆菌为出发菌株,通过正交试验探讨2种菌株的原生质体融合条件。分别对融合子进行温度、生长盐度和净化水质等功能测定,检出性能较优的融合子,同时采用电镜、细胞色素吸收光谱等方法,将融合子优良株与2种亲株进行比较鉴别。实验结果表明,2种菌株原生质体融合的最优条件为温度37 ℃,作用时间3 h,聚乙二醇（PEG）浓度为40%。在该优化条件下原生质体融合率为1.536%,筛选获得3株能在30～50 ℃良好生长的融合子（a、b、c）。融合子生长耐受温度较耐盐红螺菌亲株提高66%,但耐受盐度、降解养殖水体氨氮与亚硝基氮功能均与耐盐红螺菌亲株相近。其中融合子a菌株具有生长更快、性能更稳定的特点,其细胞形态特征、革兰氏染色属性、色素吸收峰等均与耐盐红螺菌相似。     

气相色谱法测定白酒中甲醇含量测量结果不确定度的评定

[目的]建立气相色谱法测定白酒中甲醇含量的测量不确定度评定的数学模型。[方法]从测量程序各步骤评定不确定度的各项来源,对该方法所得结果的已识别来源的不确定度影响进行评价。[结果]测量结果不确定度主要来源于甲醇标准溶液、气相色谱仪定量重复性。当白酒中甲醇含量为0.072 g/L时,其扩展不确定度为0.006 6 g/L(K=2)。[结论]该研究可为评定白酒中甲醇含量的测量结果质量提供科学依据。     

刺槐愈伤组织原生质体的分离和 PEG 融合1）

以刺槐未成熟合子胚的愈伤组织为材料,试验通过正交试验设计,对酶液质量分数（纤维素酶R－10、果胶酶Y－23、离析酶R－10）、分离时间和分离液渗透压（即甘露醇质量分数）3个影响因素分析,并采用蔗糖等密度离心法中的上浮法纯化后,得到分离最佳条件：纤维素酶R－10质量分数为2．5％,果胶酶Y－23质量分数0．6％和离析酶R－10质量分数1％,甘露醇质量分数11％,酶解时间10 h。在此条件下,原生质体产量达22．4×106个/mL,活力为92．13％,原生质体净得率为2．06×106个/mL。在此基础上,采用PEG诱导法,对原生质体的融合时间和融合剂PEG6000质量分数等相关影响因素进行了相关探讨,结果表明最佳融合条件为25％的PEG6000诱导下,融合30 min,融合率达到10．97％。     

甘蓝与大白菜的原生质体融合

[目的]研究两种近缘物种原生质体的最佳融合条件。[方法]利用培养好的甘蓝与白菜的幼苗在果胶酶与纤维素酶的作用下分离出原生质体,再利用PEG融合液将这2种原生质体融合。[结果]用6％甘露醇＋8％纤维素酶＋2％果胶酶处理材料,酶解4h后,可以获得大量的游离原生质体,大部分原生质体呈圆形,散乱地游离在原生质体溶液各处。利用30％PEG融合液及0．1mol／LCaCI：溶液（含9％甘露醇,pH值9．5）将这两种原生质体融合可以获得稳定的、可育的细胞杂种植株,可以直接作为育种的种质材料。[结论]该研究为远缘杂交和进一步研究原生质体的培养及再生奠定了基础。     

侧耳菌原生质体融合子的子实体发育及遗传重组

通过原生质体融合技术得到侧耳菌亲和与非亲和菌种的融合产物,亲和菌种间体细胞杂交得到异核体,而非亲和菌种杂交得到保留有双亲基因的结合体（核）。结合核子实体发育受光照、温度、营养及培养基的物理状态等因素影响。结合体不能形成初始融合菌落,但大多数成熟的子实体中存在锁状联合,与异核体相比,结合体具生长速率缓慢,有丝分裂阶段形成锁状联合及子实体发育不同步等特点。体细胞杂交后代可以分离到四种遗传型菌落：原养型、一种亲本营养缺陷型、另一亲本营养缺陷型及重组子营养缺陷型。一些结合体具备异常等位基因,说明在受体细胞染色体重排中有大片段随机整合位点。     

利用原生质体融合技术构建梨孢属融合子的研究方法初探

鉴于有性世代形成能高的稻瘟病菌菌株有限,稻瘟病菌间的杂交组合难于获得,从而很难对一些重要基因,如无毒基因,抗药性基因等进行遗传分析及深入研究.本研究利用原生质体融合技术获得梨孢菌的杂合子,从而评价该体系用于遗传研究的可行性.首先,利用转基因技术获得稻瘟病菌Y93-164a-1跟蟋蟀草病菌SA98-4的抗药性转化子,然后将两个菌的稳定转化子的原生质体进行融合,之后进行连续5次的继代培养,最后进行3次单孢分离来挑选稳定的融合子.结果表明,利用原生质体融合技术在两个不同致病型的梨孢菌之间能获得稳定的融合子,初步表明利用原生质体融合技术组建梨孢菌的融合子群体用于遗传分析在技术上是可行的.

Abstract：

The genetic analysis of important genes, e. g. avirulence genes, antibiotic resistant genes in Magnaporthe oryzae pathogens had been limited because of the difficulty of getting highly fertile strains for genetic cross, especially in Oryza pathotype strains. In the present study, an alternative method for the genetic study of this fungus was tried by using the protoplast fusion system. Firstly, drug-resistant transformants were generated from the Oryza strain Y93-164a-1 and Eleusine pathotype strain SA98-4, then protoplasts of both selected transformants were fused by protoplast fusion technique. Stable fusants were selected after at least five subcultures and three single-spored isolations on the selective medium. Results suggested that the stable fusants can be easily obtained by protoplast fusion system, showing the protoplast fusion system could be usable for genetic analysis of M. oryzae pathogens.     

灵武长枣果酒酿酒酵母与红酵母原生质体融合的研究

筛选酿酒酵母菌,并将其原生质体与红酵母原生质体进行融合,以期获得优良融合子.首先,从灵武长枣果皮上筛选分离出一株性能优良的酿酒酵母(YLLJ),然后用溶菌酶与蜗牛酶对其与红酵母菌的细胞壁进行酶解,制成原生质体,将两亲本原生质体按数量比1:1混合后,在促融合剂PEG作用下进行融合,融合子在高渗培养基上培养呈现黄色,既有酿酒能力又能产类胡萝卜素.     

甲醇提取柑橘皮总黄酮的工艺优化

[目的]优化柑橘皮总黄酮的提取工艺。[方法]比较甲醇和乙醇对柑橘皮总黄酮的提取效果,并通过单因素及正交试验考察提取液pH值,料液比、提取时间、提取温度对总黄酮得率的影响,进一步确定柑橘皮总黄酮的最佳提取工艺。[结果]甲醇对柑橘皮总黄酮的提取效果明显好于乙醇,各因素对总黄酮得率的影响依次为：提取液pH值〉料液比〉提取温度〉提取时间;甲醇提取柑橘皮总黄酮的最佳工艺条件为：提取液pH值8.0,料液比1∶30,提取时间3h,提取温度60℃,此条件下所得提取液中总黄酮的含量为8.84mg/g。[结论]该研究确定了甲醇提取柑橘皮总黄酮的最佳工艺。     

原生质体融合提高非致病性尖镰孢Fo47抗药性

选择紫外灭活和热灭活亲本原生质体为遗传标记,以非致病性尖镰孢Fo47和对西瓜枯萎菌有抑制作用的植物内生放线菌SG2、生长较快并对尖孢镰孢萎蔫专化型有抑制作用的重寄生链霉菌PR进行跨界原生质体融合,经筛选获得4株融合子F-8、F-9、F-10和F-12,皿内测定结果表明,72 h后融合子生长速率显著快于亲本Fo47(P=0.05);抗多菌灵的临界质量浓度分别达到3、9、6、6 mg/L,均高于Fo47的2 mg/L。     

平菇种内原生质体分离与融合杂交育种技术及应用

将PDY液体培养的16个平菇资源品种的菌丝体,在25℃、pH5.8～6.0环境下,分别用1.5%溶菌酶 0.6mol/LKCl稳渗剂溶解其细胞壁2h,原生质体数得量最高;将获得的原生质体两两配对成39个组合,在30℃、pH9.0、0.6mol/LKCl稳渗剂、不加融合促进剂CaCl2和PEG6000的融合条件下,得到种内杂交融合子5株。其中有4株融合子再生出菌丝体和子实体;同皿接种实验显示,新菌株与其双亲具明显的拮抗性。经栽培试验与生产示范,新育的"优生1号"品系表现适应性强,优质、丰产、抗杂、耐热。