马病毒性动脉炎的研究进展

马病毒性动脉炎的研究进展连云港动植物检疫局朱其太马病毒性动脉炎（Ｅｑｕｉｎｅｙｉｒｕｓａｒｔｅｒ－ｉｉｓ，ＥＶＡ）是由马动脉炎病毒（Ｅｑｕｉｎｅａｒｔｅｒ－ｔｉｔｉｓｙｉｒｕｓ，ＥＡＶ）引起马的一种急性传染病，该病曾被称为“流行性蜂窝织炎火腿”或“马...     

马的病毒性动脉炎

马的病毒性动脉炎四川省养猪研究所（６３２４６０）黄正才马的病毒性动脉炎（ＥＶＡ）是以危害生殖器和呼吸道为主要特征的马特有的传染病。本病自１９５３年由美国Ｄｏｌ等从马流产死胎体内最初分离病毒以来，到目前为止本病毒仍是导致马流产的主要病因之一。本病的重要...     

马病毒性动脉炎

马病毒性动脉炎由动脉炎病毒引起,对养马产业引起严重的经济损失。该病的临床表现和损伤类似于某些其他疾病,结合免疫组化的病理学检查、病毒分离和血清学检测可进行直接和准确的诊断。文章综合近年来的研究资料,着重对该病的临床损伤、发病机理及鉴别诊断做了简要叙述。     

马病毒性动脉炎诊断技术研究进展

马病毒性动脉炎(EVA)是马属动物之间通过呼吸道或生殖器官传播的传染病,是危害养马业及赛马比赛的重要疾病之一,应用各种诊断技术对该病做出准确的诊断是预防和控制该病的前提.EVA的诊断技术包括检测病毒,检测血清抗体,涉及的技术和方法包括病毒的分离及中和试验、血凝及血凝抑制试验、免疫荧光试验以及酶联免疫吸附试验等.每种诊断技术都有其各自的优势和局限性,应根据目的及工作条件等综合情况予以选择,论文就各种诊断技术的原理、方法及特点进行了概述和比较,并对今后的应用前景和发展趋势进行了展望.     

马病毒性动脉炎的流行与诊断

1流行病学本病的病原为动脉炎病毒属中的马动脉炎病毒。本病仅马属动物有易感性,发病呈散发,一般不致死亡。但妊娠母马或幼驹人工接种病毒后可引起约50%死亡,妊娠母马有50%~60%流产。康复马血清内有中和抗体和补体结合抗体,并有免疫性,对再传染或人工接种有抵抗力,一般可维持1年以上。病马的眼分泌液、鼻液、唾液、精液、血液、流产胎儿的胎液和各种组织内均含有病毒,病毒由粪便、尿、鼻液、眼泪排出,通过饲料、饮水、环境传染于易感马,或通过气雾,被易感马吸入后引起传染,配种也能传染。     

实时定量RT-PCR检测马动脉炎病毒

选取马动脉炎病毒(EAV)基因组中高度保守的开放阅读框7(ORF7)序列，设计了特异性引物和TaqMan探针，利用一步法的实时定量RT-PCR来定量检测EAV。使用含有选定检测序列的克隆标准品做标准曲线，证明该方法可以检测出含有5(4．77)个RNA分子，即可从组织培养液(TCF)中检出一般含有5PFU／μL病毒拷贝。对猪生殖呼吸道综合征病毒、马疱疹病毒无交叉反应，特异性好。用疫苗用种毒(Bucyrus标准株)肌肉注射于马驹后，定量RT-PCR比病毒分离试验更能灵敏地检出呼吸道排出的病毒。对456份临床鼻腔分泌物样品检测，定量RT—PCR检出6份阳性，而病毒分离只检出2份阳性。一步法实时定量RT—PCR检测样品中的EAV，在快捷、准确、方便和高通量方面优于细胞培养病毒分离的检测方法，可以作为检测马病毒性动脉炎(EVA)病毒的快速方法。     

马病毒性动脉炎血凝及血凝抑制试验研究与应用

在RK-13细胞上培的马动脉炎病毒在4℃、室温和37℃条件下，用各种动物的红细胞进行血凝试验，证实病毒在不同温度下均可凝集小鼠和鸡的红细胞，但不能凝集牛、绵羊、山羊、马、猪、豚鼠、仓鼠、兔及鹅红细胞，病毒用吐温-80和乙醚处理后，血凝活力会显著增强，其血凝滴度比未经处理的病毒高4-8倍，且血凝像更加清晰，最适处理条件是病毒在冰、浴状态下用终浓度0.06%-0.125%(V/V)二温-80振荡处理15min-60min，再加50%（V/V）乙醚振荡作用5min-15min。用EAV免疫SPF豚鼠，4周后采血做HI和NT试验，显示HI抗体和NT抗体产物成正相关，对550份来自新西兰、吉尔吉斯、内蒙古、新疆的马血清做EAV的抗体检测，比较两个试验，二者符合率为97.8%，血凝抑制抗体与中和抗体效价呈显著的正相关，但抗体效价略低于后者。     

马病毒性动脉炎的研究现状

马病毒性动脉炎(Equine viral arteritis,EVA)又叫马传染性动脉炎,是由马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)引起的,在马属动物之间通过呼吸道和生殖器官传播的一种急性传染病.该病曾被笼统的包括在"马流感"之内[2].1953年,首先在美国俄亥俄州发现本病,Doll等人从马流产胎儿中分离出病毒,并定为Bucyrus株.本病目前在世界许多国家存在.已报道分离出病毒的国家有瑞士、波兰、奥地利、加拿大,其抗原性均与Bucyrus株一致.还有一些国家如英国、日本、法国、西班牙、爱尔兰、葡萄牙、前南斯拉夫、埃及、埃塞俄比亚、摩洛哥、墨西哥、前苏联、德国、瑞士、伊朗、丹麦、荷兰、澳大利亚、新西兰、意大利等国经血清学调查证实有本病存在[4～9]. EVA为二类传染病[10],世界各国在马匹的进出口检疫中十分重视.我国尚未见有本病的报道[1],但我国出口到韩国的马匹,被对方的检疫机关检出EAV抗体阳性[15].     

马病毒性动脉炎病毒中和试验的建立以及与ELISA方法的比较研究

参照世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断与疫苗手册》,建立了马病毒性动脉炎病毒中和试验,并采用马病毒性动脉炎病毒中和试验(Virus Neutralization Test,VNT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)两种方法,对广东省部分地区马场共182匹马血清和7份标准阴阳性血清进行马病毒性动脉炎抗体的检测,并对两种方法进行比较分析,结果两种方法的阳性符合率和阴性符合率分别为43.48%和96.34%,总符合率为93.12%;以我们建立的VNT作为马病毒性动脉炎抗体检测的"金标准",试验中所用的ELISA方法的敏感性和特异性分别为71.43%和93.96%。因此,我们认为在马病毒性动脉炎抗体检测中,ELISA的敏感性以及与VNT的阳性符合率较低,不适合作为VNT的替代方法。     

马动脉炎病毒的血凝性研究

在RK－13细胞上培养的马动脉炎病毒（Equine viral arteritis,EAV)在4℃、室温和37℃条件下，用多种动物的红细胞进行血凝试验，病毒在不同温度下均可凝集小鼠和鸡的红细胞，但不能凝集牛、绵羊、山羊、马、猪、豚鼠、仓鼠、兔及鹅的红细胞。将病毒用吐温－80和乙醚处理后，血凝活力会显著增强，其HA效价比未经处理的病毒高4－8倍，且血凝像更加清晰。处理病毒的最适条件是在冰浴状态下用终浓度0．6－1．25mL/L吐温－80振荡处理15－60min，再加1／2体积的乙醚振荡作用5－15min.     

抗马动脉炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备

为制备抗马动脉炎病毒(EAV)衣壳蛋白(N)的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达重组N蛋白,纯化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,细胞融合后经间接ELISA筛选获得两株能够稳定分泌抗EAV N蛋白的杂交瘤细胞株,MAbs亚型鉴定为IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示,这两株杂交瘤细胞分泌的MAb均能够识别EAV。EAV N蛋白MAb的制备,为EAV血清学检测方法的建立奠定了基础。     

马动脉炎病毒进化分析及DNA条形码的确定

从GenBank数据库下载马动脉炎病毒所有基因组全序列和同属的其他病毒基因组序列,对其进行多重比对,绘制系统进化树,并根据序列比对筛选保守序列作为马动脉炎病毒的DNA条形码。结界发现马动脉炎病毒分为两个分枝,即欧洲型和美洲型,两者同源性在85%以上,而与同属其他病毒同源性低于40%,亲缘关系较远;对马动脉炎病毒基因组序列进行分析,筛选出9条基因序列作为马动脉炎病毒的DNA条形码,可用于马动脉炎病毒的鉴别诊断。     

定量检测马动脉炎病毒方法的建立

为建立快速、敏感、准确的马动脉炎病毒检测方法,笔者选取病毒基因组中高度保守的ORF7序列设计引物和TaqMan探针,分别使用马动脉炎病毒的总RNA和含有选定检测序列的克隆标准品进行一步法实时定量RT-PCR,绘制扩增曲线,两曲线斜率之差小于0.1,证明两者的扩增效率相同,可用选定检测序列的克隆标准品对马动脉炎病毒进行定量检测。     

含马动脉炎病毒N基因的病毒样颗粒的制备

为了构建易于纯化且耐RNase酶的含有马动脉炎病毒N基因的病毒样颗粒,通过RT-RCR扩增马病毒性动脉炎病毒的N基因,将其克隆至含有组氨酸标签的pNH-MS2his载体中,构建重组原核表达载体pNH-MS2his-N。将重组质粒pNH-MS2his-N转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3),1 mmol/L IPTG诱导表达、纯化。对病毒样颗粒进行鉴定及稳定性实验。结果表明该病毒样颗粒含马病毒性动脉炎病毒N基因,并且稳定性良好,构建的病毒样颗粒可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品使用。     

马动脉炎病毒血凝抑制试验研究及其应用

用马动脉炎病毒（EAV）免疫SPF豚鼠，4周后采血做血凝抑制试验（HI），其抗血清可以抑制血凝抗原对小鼠红细胞的凝集反应，抗原和抗血清在4℃感作24h后可以检测到最高的HI抗体效价，同时结果显示HI抗体与中和抗体产物呈正相关。对561份来自新西兰、吉尔吉斯、沙特阿拉伯及内蒙古、新疆的马血清用HI试验和微量血清中和试验（NT）进行EAV抗体检测，HI和NT阳性符合率为94．7％，血凝抑制抗体与中和抗体效价呈显著的正相关。