des-pGLU1-Bra基因的人工合成及其在大肠杆菌中的重组表达

根据从西非植物Pentadiplandra brazzeana Baillion果实中分离的甜蛋白Brazzein的成熟区氨基酸序列，按照大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好人工合成了4对末端具粘合位点的寡聚核苷酸序列，经连接和PCR扩增后得到了179bp的Brazzein类似物的编码序列，插入pET30a载体构建成重组表达载体pET-Bra。诱导表达后得到了与预计分子量相同的蛋白，约占细菌可溶性蛋白的12．8％，分离纯化的des-pGLU1-Brazzein甜度约是同等重量蔗糖的600倍。     

鸡β-防御素基因的克隆与结构分析

通过RT-PCR扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的部分cDNA序列，大小分别为198、195和297bp。利用PCR技术扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因组DNA部分序列，大小分别为1176、1053和2454bp。经分析发现，2个内含子将鸡-β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的编码区分成3个外显子部分。第1个外显子编码绝大部分信号肽序列；第2个外显子编码信号肽羧基端极小部分序列、原片段序列与大部分成熟肽序列；第3个外显子编码小部分成熟肽序列。扩增到的鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的两个内含子长度，分别为482和496bp，183和675bp，980和1280bp。鸡β-防御素基因编码区结构的这种组成与哺乳动物的β-防御素基因的不同，在哺乳动物中为1个内含子将β-防御素基因编码区分成2个外显子部分。Blast比较发现，鸡β-防御素Ga1-1和Ga1-2基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．182上，并且这2个基因转录方向相反。Ga1-3基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．181和Contig42．182上，转录方向与Ga1-1基因相同。     

bar因在大肠杆菌中的高效表达及其表达产物的分离和纯化

bar基因来源于P3301质粒载体,通过构建PB813测序载体对bar基因进行了测序,与GenBank中bar基因全编码区比较发现：在DNA上有两个碱基不同,但在蛋白质水平上完全相同。用PCR方法从P3301载体上克隆了552碱基的bar基因全长序列插入到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET30a( )中,构建了pET30a-bar融合表达载体并转人大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-bar融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了膦丝菌素乙酰转移酶(PAT),并通过金属鏊和层析一步纯化了目的蛋白。用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了PAT纯品。     

绞股蓝抗TMV蛋白的分离及编码基因的序列分析*

以半叶法测定抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)活性为监控手段，采用(NH4）2SO4分级沉淀、阳离子交换及亲和层析等方法，从绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)中分离到一种抗TMV蛋白，其分子量约为27kD，N端19个氨基酸残基为DINFSLAGADGQTYNTFIA(SWISS—PROT登录号为P83206)。N端序列分析表明，它是一种新的核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins，RIPs)，命名为gynostemmin。gynostemmin与其它植物RIPs的N端同源性介于10％-73％之间，其中Y14F17构成植物RIPsN端的“钉子”位点；gynostemmin与葫芦科植物RIPs的同源性为31％～73％，其中F4L6A9Y14F17I18,6个残基为葫芦科植物RIPsN端“钉子”位点。根据N端序列和葫芦科植物RIPs下游保守氨基酸序列设计简并引物，采用PCR扩增并克隆了编码gynostemmin的基因，包含609个碱基，推导出的203个氨基酸残基约占成熟蛋白的75％，软件分析表明，它含有核糖体失活蛋白的活性位点区。     

胡须鸡β-防御素Gal-1-Gal-13基因克隆、序列分析及其在组织中分布

用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1(Gal-1)～Gallinacin-13(Gal-13)共13个基因编码区全长片段.通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,GenBank登陆号为:DQ858311～DQ858323.比较分析胡须鸡13种β-防御素Gal-1(a)～Gal-13,Gal-1基因与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性.均在96.5%～100%之间.利用Clustax软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果显示Gal-1、Gal-1(a)、Gal-2、Gal-3、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7、Gal-8、Gal-12和Gal-13在同一大的分支上;Gal-9和Gal-10在同一分支;Gal-11独在一分支上.用RT-PCR方法分析胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布,结果发现:Gal-1、Gal-2、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7和Gal-10的表达分布非常广泛,Gal-3、Gal-8、Gal-9、Gal-11、Gal-12和Gal-13的分布少.     

人Irisin基因的克隆、原核表达及重组蛋白的纯化

鸢尾素(Irisin)是新发现的一种肌肉因子,其前体是Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectin typeⅢdomain-containing protein 5,FNDCS).为实现人(Homo sapiens) Irisin的原核表达,通过反转录PCR得到人肌肉组织总RNA的cDNA,并以特异性引物扩增得到人FNDC5基因的cDNA序列.以特异性引物扩增将人Irisin基因序列引入NdeⅠ和Xho Ⅰ酶切位点,经双酶切后插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒并转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3) pLysS.通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)检测,用镍柱纯化目的蛋白,并用Western blot方法鉴定.DNA序列分析结果显示,克隆的人Irisin基因序列和NCBI公布的序列一致,并成功构建了pET-30a-Irisin重组表达载体;SDS-PAGE电泳检测和Western blot结果表明,表达蛋白分子量约为14kD,与预期大小一致;实现了人Irisin的可溶性表达,得到了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究人Irisin蛋白的结构、功能及应用提供了理论依据.     

猫白介素-18基因的克隆、序列分析及其表达

用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白基因在原核系统中的高效表达

从兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)中国早期流行株NJ85中成功地克隆出衣壳蛋白(VP60)基因。序列分析表明该基因长度为1740nt，编码579aa，与已报道的另2个RHDV中国毒株WX84和TP的VP60基因的同源性分别为92．7％和97．2％。构建了NJ85株VP60基因原核表达质粒pET—VP60，用SDS—PAGE分析，重组VP60蛋白的表达量占菌体总蛋白的40％，分子量约62kD，在菌体内以包涵体形式存在。免疫印迹实验表明，重组VP60蛋白与RHDV抗体反应形成1条带，证明它具有抗原性。     

重组马槟榔甜蛋白MabinlinⅡ在大肠杆菌中的表达

MabinlinⅡ是我国所特有且唯一的植物甜蛋白，在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物。本文根据己知马槟榔甜蛋白的序列设计引物克隆MabinlinⅡ基因，对基因进行剪切重组。将重组基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a（＋）中，构建了3个重组表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），得到三株表达重组马槟榔甜蛋白的大肠杆菌工程菌。经IPTG诱导，3个重组MabinlinⅡ基因可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达。     

潮霉素磷酸转移酶（hpt）基因的原核表达、蛋白纯化及其抗体制备

从转基因玉米(Zea mays)基因组上成功地克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接,成功构建了pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中进行蛋白表达.在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了HPT蛋白,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白.用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔制备了特异性强、灵敏度高的多克隆抗体.     

绵羊β2-肾上腺素能受体基因(β2-AR)的克隆及其第二细胞外环在大肠杆菌中的表达

本研究以β2-肾上腺素能受体(β2-adrenergic receptor,β2-AR)基因的保守序列设计了1对PCR引物,通过PCR技术首次获得了萨福克、小尾寒羊和中国美利奴(新疆型)3个绵羊(Ovis aries)品种的β2-AR基因(GenBank登录号分别为EU707939、EU707940和EU707941),该基因含一个1 257 bp的开放阅读框(ORF),编码418个氨基酸残基.核苷酸序列分析显示,绵羊β2-AR基因与牛、猪、大鼠和人的相似性分别为98.4%、88.5%、84.2%和80.5%.通过基因合成技术合成了双拷贝的绵羊β2-AR第二细胞外环编码区DNA,并将其与pET32C(+)重组.重组菌以1 mmol/L IPTG诱导,通过SDS-PAGE和Western blot分析,绵羊β2-AR第二细胞外环融合蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达,表达产物分子量约为26 kD,表达水平最高占菌体总蛋白的40.3%.     

指导外源基因在动物乳腺特异性表达载体的构建

为了实现外源蛋白质在动物乳腺中特异性表达,采用PCR法扩增了BLG 3'端含第6,7外显子及poly(A)加尾信号下游约200 bp的0.87 kb片断.以山羊BLG 5'的3.2 kb(含第1,2外显子)启动子,山羊BLG 3' 0.87 kb序列,鸡 -珠蛋白基因簇基因上游的 2.4~ 5.3 kb HindⅢ序列,绿色荧光蛋白GFP及原核载体pGEM-7zf构建了pGEM-7zf-GFP-MAR-5' BLG-3' BLG的乳腺特异性表达载体,将外源基因插入BLG 5'端EcoRⅠ位点,或许可能实现其在乳腺中位置独立性表达.     

胡须鸡β-防御素Ga1-1－Ga1-13基因克隆、序列分析及其在组织中分布术

用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1（Ga1-1）-Gallinacin-13（Ga1-13）共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,GenBank登陆号为：DQ858311-DQ858323。比较分析胡须鸡13种β-防御素Ga1-1（a）-Ga1-13,Ga1-1基因与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性,均在96．5％-100％之间。利用Clustax软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果显示Ga1-1、Ga1-1（a）、Ga1-2、Ga1-3、Ga1-4、Ga1-5、Ga1-6、Ga1-7、Ga1-8、Ga1-12和Ga1-13在同一大的分支上;Ga1-9和Ga1-10在同一分支;Ga1-11独在一分支上。用RT-PCR方法分析胡须鸡β-防御素Ga1-1－Ga1-13基因在不同组织中的分布,结果发现：Ga1-1、Ga1-2、Ga1-4、Ga1-5、Ga1-6、Ga1-7和Ga1-10的表达分布非常广泛,Ga1-3、Ga1-8、Ga1-9、Ga1-11、Ga1-12和Ga1-13的分布少。     

潮霉素磷酸转移酶的原核表达纯化及其抗体制备

本研究从转基因玉米基因组上成功克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamHⅠ和Hind III 双酶切作用,将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接成功构建pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌BL21中进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3) 菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了潮霉素磷酸转移酶（HPT）,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白。用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔子制备了特异性强的多克隆抗体。     

犬白细胞介素-2 基因(IL-2 )的克隆与表达

根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)IL-2基因序列，设计了1对引物。采用RT-PCR技术，以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料，从总RNA中扩增出犬IL-2基因。琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为550bp。分离纯化片段，克隆入pMD18-T载体，经酶切鉴定，测序结果显示，克隆的犬IL-2基因与GenBank上发表的序列一致，生物软件分析结果表明该序列与牛、羊和鹿的亲源性更近。构建表达质粒pET28-CaIL-2，转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21，IPTG诱导表达，SDS—PAGE电泳显示21．8kD左右的表达条带。MTT比色法测定活性结果表明：表达的重组犬IL-2蛋白具有极显著的体外增殖活化淋巴细胞的活性。     

地衣芽孢杆菌GXN151的纤维素酶基因cel12A的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

地衣芽孢杆菌菌株GXNl51的cell2A基因为783bp,可编码含261个氨基酸的羧甲基纤维素酶Cel12A,Cel12A的N-末端第1～28氨基酸具典型的信号肽特征、第9～31氨基酸具跨膜功能域特征、第104～261氨基酸形成家族12糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。将编码其第73-261氨基酸的DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET一30a( )得表达质粒pGXNl2A,用1mmol／IPTG诱导处理JMl09(DE3)／pGXNl2A的培养液6h pGXNl2A的表达量达到最高,在JMl09(DE3)和BL21(DE3)pLysS中该表达蛋白质可分别占菌体胞内总蛋白的54．3％和20．9％。在含羧甲基纤维素的LA平板上JMl09(DE3)／pGXNl2A和BL21(DE3)pLysS／pGXNl2A表现有较弱的羧甲基纤维素酶活性,说明重组的Cell2A的催化功能域具有独立的催化活性。包含体检测表明pGXNl2A在JMl09(DE3)中的表达产物大部分形成不溶性包含体。     

内生解淀粉芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的克隆与表达及酶学特性分析

β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶普遍存在于植物内生芽胞杆菌中,为了探讨其功能,以内生解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TB2菌株基因组为模板,克隆了β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因(bglS).测序结果表明,该基因的ORF全长732 bp,编码一条243个氨基酸的蛋白,理论分子量约为27.33 kD,等电点约为6.89,其ORF序列已登录GenBank(Accession No.EU368224).Blast同源性分析结果表明,该基因的ORF序列与植物互作生防解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens FZB42,GenBank Accession No.CP000560)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列的一致性达97.3%,氨基酸序列的一致性达97.1%.将β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因全长克隆至pUC18载体上,利用基因自身的启动子构建重组表达载体pUC-bglS,并导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达.SDS-PAGE分析表明,BL21::pUC-bglS菌株表达了27 kD左右的蛋白;该酶的最适反应温度为55℃,在50℃以下保温60 min后残余80%以上酶活;最适反应pH为6.2,在pH4.4～6.8 4℃保温30 min残余85%以上的酶活;Ca2+和Fe肛可提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性,而Cu2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+对其活性具有显著的抑制作用.实验结果为进一步研究植物内生解淀粉芽胞杆菌TB2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能和应用打下了基础.     

甜橙β-胡萝卜素羟化酶cDNA克隆及其瞬间反义表达*

根据已报道的温州蜜柑(Citrus unshiu)β-胡萝卜素羟化酶(BCH)cDNA序列(AF296158)，设计1对引物，以华盛顿脐橙(C.sinensis)成熟果实cDNA为模板，采用PCR扩增出1条长为1057bp的cDNA片段，将此片段克隆入pUCm—T载体，测序结果表明，所得序列与已报道序列同源99．62％，表明所获得的基因是BCH基因。将该基因反义插入到pBI121中构建成反义植物表达载体，其正确性得到测序的鉴定。含有该植物表达载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)在脐橙白皮层中诱导了β-胡萝卜素积累。     

水牛α-干扰素基因的克隆与表达及其抗病毒活性

从福安和富钟水牛(water buffalo，WB)基因组中克隆了其α-干扰素基因Fa-WBIFN-α,和Fz—WBIFN-α,，并分别与pQE30表达载体连接、测序后用IPTG诱导表达。结果表明，水牛IFN—α基因全长498个核苷酸，编码166个氨基酸的成熟蛋白，与已报道的牛α-干扰素(BoIFN—α)8个亚型氨基酸序列同源性为91．6％～94．2％，均为BoIFN—α的新亚型。SDS-PAGE和Western blot分析表明，表达产物分子量约为20kD，表达量占菌体总蛋白的25％，表达产物以包涵体形式存在。经包涵体提取、尿素变性和复性后，重组水牛α-干扰素(rWBIFN—α)在CEF／VSV和MDBK／VSV细胞系上的活性分别为10^5U／mg和10^6U／mg。并且，rWBIFN-α对传染性牛鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus IBRV)感染有抑制作用。     

玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因的克隆与表达

玉米大斑病菌（Setosphearia turcica）属半知菌亚门丝状真菌，是严重威胁玉米生产的重要植物病原真菌。本研究克隆了玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1。Stgb-1基因全长1296bp，由5个外显子和4个内含子组成；开放阅读框（ORF）为1056bp，编码351个氨基酸，蛋白质计算分子量为39.081kDa。STGB1蛋白推导氨基酸序列与Cochliobolus heterostrophus（100%）、Cryphonectria parasitica（80%）、Aspergillus fumigatus（81%）等丝状真菌的G蛋白β亚基编码基因均具有较高的同源性。同时，利用RACE技术和Genomic Walking技术获得了Stgb-1基因3’-末端cDNA和DNA的3’端侧翼序列，BlastN结果表明其cDNA 3’-UTR为136bp，poly(A)由9个A构成。此外，构建了pET28a-Stgb-1原核表达载体，SDS-PAGE检测和Western blot鉴定结果表明，目的蛋白在E.coli BL21菌株中已成功实现了诱导表达，为进一步研究蛋白结构与功能的关系奠定了基础。