油菜抗除草剂性状的遗传及利用

以抗草甘膦油菜“Q3”和MICMS保持系“宁B6”、“宁B7”及恢复系“宁R1”、“宁R3”为亲本材料,配制杂交组合,研究抗性遗传。结果表明,油菜对草甘膦的抗性为显性性状,由1对基因控制,抗草甘膦基因在F_2和BC_1群体遵循孟德尔分离规律。因此,应用杂交、回交育种方法将CP_4 gox双价基因转育到油菜推广品种中是可行的。     

M342抗除草剂基因CAPS标记的开发与应用

M342是利用EMS诱变定向选育获得的甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂新种质。通过M342抗性基因与敏感型油菜的ALS基因序列分析结果表明,M342的BnALS3基因存在1处SNP突变,导致编码的蛋白质第556位色氨酸突变为亮氨酸,该突变导致基因序列对BsrD I内切酶消化的差异。为此设计了8条引物,从中筛选到引物对SU54F/SU58R在不同油菜品种中可以特异性扩增出目的片段,该片段经BsrD I酶切分型正确,从而开发了检测M342中抗性基因BnALS3R的CAPS标记。运用该标记对除草剂敏感型油菜、纯合抗性油菜及杂合抗性油菜BnALS3的基因型进行验证,并应用该标记对F_2、BC_1分离群体进行检测。结果表明,该标记验证的基因型结果与测序结果一致。F_2分离群体有Als3Als3、Als3als3、als3als3 3种基因型,BC_1分离群体有Als3als3、als3als3 2种基因型,与表型鉴定结果一致,遵循单基因遗传分离规律,表明该标记可以应用于抗性基因的检测。CAPS标记的获得为抗除草剂油菜的分子标记辅助选择育种奠定了基础。     

聚合回交法选育抗褐飞虱水稻恢复系

【目的】挖掘和利用稻飞虱抗性基因,选育抗褐飞虱水稻恢复系。【方法】利用高抗褐飞虱的抗源材料HS204作抗源供体,以恢复系明恢65作轮回亲本,通过回交,进行苗期群体鉴定和成株期农艺性状选择。【结果】抗褐飞虱材料HS204的抗性基因为显性。经聚合回交选育,抗褐飞虱显性基因被成功转育到轮回亲本中,从11个回交组合后代中选择获得4份配合力高、高抗褐飞虱纯合恢复系,其中M204-8-2-3-6-5、M204-8-8-14-9-9均来源于M204-8株系,其新配的7个组合抗性都在3级以上,并具有较强的恢复力。【结论】采用聚合回交法,通过抗性筛选,用抗性纯合的株系与轮回亲本回交,可加快选育目标性状纯合株系。     

芥菜型油菜黄化突变体L638-y的遗传及黄化基因gr1的分子标记

【目的】研究芥菜型油菜黄化突变体L638-y黄化性状的遗传规律,并初步定位黄化基因gr1。【方法】以芥菜型油菜黄化突变体L638-y分别与正常绿色的渭源大黄芥、2598进行杂交,根据杂交F1、F2和BC1材料单株的叶色调查结果进行遗传分析;以从L638-y与2598杂交后代选育得到的近等基因系(Near-isogenic line,NIL)为材料,选用SRAP、SSR、RAPD和AFLP分子标记,采用BSA(Bulk segregant analysis)法,初步定位黄化基因gr1。【结果】芥菜型油菜黄化突变体L638-y的黄化性状受2对隐性核基因控制,将其分别命名为gr1、gr2。将黄化基因gr1初步定位在2个AFLP分子标记EA4TG4和EA7MC1之间,其与2个标记间的遗传距离分别为33.6与21.5cM。【结论】芥菜型油菜黄化突变体L638-y的黄化性状受2对隐性核基因控制,且黄化基因gr1初步定位在EA4TG4和EA7MC1之间。     

油菜抗草丁膦性状的遗传与利用

以抗草丁膦油菜HCN-19的自交分离选系和MICMS保持系宁B6，宁B7，恢复系宁R1，宁R3以及油菜品系1003，1072为亲本材料，配制根本交组合，研究油菜的抗草丁膦性状遗传。结果表明，油菜的草丁膦抗性为显性性状，受一对基因控制，抗草丁膦的bar基因在F2和BC1群体遵循盂德尔分离规律。因此，应用杂交，回交等常规育种方法就可将bar基因导入目标品种。     

黑腹果蝇fat2新突变体的鉴定

【目的】研究突变品系MI3266的生殖能力和生殖系统形态学变化,鉴定突变品系MI3266影响的基因。【方法】通过遗传杂交检测突变品系MI3266是否可育以及MI3266雌蝇和雄蝇的育性;解剖MI3266成虫生殖系统,经DAPI染料染色观察生殖系统形态学变化;利用反向PCR方法鉴定突变品系MI3266影响的基因。【结果】突变品系MI3266不可育,其雌蝇也不可育;突变品系MI3266雌蝇卵巢形态异常,14阶段卵室变圆,背侧肢异常短小;突变品系MI3266影响的基因是fat2。【结论】本研究鉴定了1个fat2新突变体,突变体雌蝇不可育,为研究fat2基因功能提供了新的突变体。     

棉花T—DNA标签雄性不育突变体的遗传分析

利用农杆菌介导T—DNA插入得到棉花雄性不育突变体,与野生型陆地棉（Gossypium hirsutum L）Coker 312杂交得到F1代。F1代植株出现了不育与可育两种性状的分离,分离比是1：1。对F1代进行形态学观察、卡那霉素和除草剂抗性鉴定、PCR扩增检测以及遗传学分析,证实雄性不育突变性状的表现与T—DNA插入共分离,从而认为突变是由T—DNA插入引起的显性杂合突变,这为利用T—DNA标签法进行雄性不育有关基因的克隆奠定了基础。     

甘蓝型油菜显性核不育基因及与恢复基因的等位性分析

 【目的】弄清2个不同来源的甘蓝型油菜显性核不育系609AB和Rs1046AB显性核不育的遗传模式及其不育基因的等位性。【方法】采用临保系测验法和不育系可育株与临保系的杂交回交，分析恢复基因与不育基因和2个不育基因的等位关系。【结果】筛选得到28个甘蓝型油菜恢复系，确认其中15个恢复系恢复基因与609A不育基因等位，进一步证实了甘蓝型油显性核不育的复等位基因遗传，原来视为2对显性基因遗传的纯合型不育系Rs1046AB，其可育株携带的恢复基因与不育基因等位，Rs1046B的恢复基因与609A的不育基因等位。【结论】Rs1046AB和609AB均符合复等位基因遗传模式，2个不育基因等位，不育系不育株的基因型为MsMs，可育株的基因型是MsMf。     

斜纹夜蛾P450基因CYP4M14和CYP4S9的克隆与mRNA表达水平研究

【目的】研究斜纹夜蛾对溴氰菊酯抗性的分子机制。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆CYP4M14和CYP4S9 cDNA全长序列,采用实时定量PCR技术分析这两个基因在斜纹夜蛾抗、感品系6龄幼虫中肠和脂肪体中mRNA 的表达水平。【结果】克隆得到斜纹夜蛾细胞色素P450基因CYP4M14和CYP4S9的cDNA全长序列,序列分析表明,CYP4M14编码区长1 512 bp,编码 504个氨基酸;CYP4S9编码区长1 473 bp,编码 491个氨基酸;实时定量PCR分析结果表明,在中肠中,CYP4M14和CYP4S9在抗性品系中的mRNA表达量分别是敏感品系中的4.85和18.63倍;在脂肪体中分别是在敏感品系中的75.14和6.07倍。【结论】斜纹夜蛾对溴氰菊酯的高水平抗性可能与CYP4M14和CYP4S9的过量表达有关。     

甘蓝型油菜ADP-核糖基化因子基因全长cDNA克隆及表达分析

 【目的】克隆甘蓝型油菜（Brassica napus L.）矮化突变体“NDF-1”和野生型近等基因系亲本“3529”中ADP-核糖基化因子（ADP-ribosylation factor,ARF）基因全长cDNA,分析矮化突变体中该基因在不同组织中的表达水平,探讨矮化突变体中该基因在甘蓝型油菜茎杆发育过程中的作用。【方法】采用SSH（suppression subtractive hybridization）、RACE（rapid-amplification of cDNA ends）和RT-PCR技术,克隆甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”和野生型“3529”中的ARF基因的全长cDNA序列。分别采集甘蓝型油菜野生型和矮化突变型苗期子叶、薹期根、茎尖和真叶,采用相对定量PCR方法检测矮化突变体中该基因的表达。【结果】获得了甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”和野生型“3529”的ARF基因的全长cDNA,分别命名为BnARF和BnARF-h。序列分析表明：这两个基因长度分别为837和802 bp,都含有546 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码181个氨基酸,与其它植物、动物和酵母的ARF基因有很高的相似性。BnARF基因在野生型和矮化突变体的根、子叶、茎尖和真叶中均有表达,其中在子叶中表达量最高,真叶中次之,根和茎尖中的表达量最少。同时BnARF在矮化突变体的根、子叶和茎尖中的表达量都显著低于野生型,但在真叶中表达量相近。【结论】克隆了甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”和野生型“3529”中ADP-核糖基化因子基因的全长cDNA,这两个ARF基因的序列上有两处碱基存在差异,其中一处是错义突变,推测这一突变可能与植株矮化有关。而BnARF基因在野生型和矮化突变体的根、子叶和茎尖的表达存在显著性差异,可能参与了甘蓝型油菜的矮秆发育过程。     

山东省小麦田大穗看麦娘抗性水平、靶标抗性机理及田间防除效果测定

【背景】大穗看麦娘（Alopecurus myosuroides）是我国大陆近几年新发展蔓延的一种恶性禾本科杂草,目前已在山东、河南、河北、安徽等省有分布,且分布面积不断扩大。【目的】明确山东省冬小麦田大穗看麦娘对常用除草剂的抗性水平及部分种群产生抗性的机理,并评价不同除草剂对其田间防除效果,为制定小麦田大穗看麦娘防控技术规程提供理论依据。【方法】室内采用整株生物测定法测定9个大穗看麦娘种群对乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂除草剂啶磺草胺、甲基二磺隆以及乙酰辅酶A羧化酶（ACC）抑制剂除草剂唑啉草酯、炔草酯、精噁唑禾草灵共5种除草剂的抗性水平,并对产生抗性的种群进行靶标基因检测,同时分别在冬前和冬后开展田间试验,评价不同除草剂对大穗看麦娘的田间防除效果。【结果】室内测定结果表明,种群8（JN2）对啶磺草胺和甲基二磺隆产生明显抗性,相对抗性指数分别达到47.32、15.97,靶标基因检测显示,该种群内植株ALS基因编码的第197位点氨基酸发生由脯氨酸（CCC）到苏氨酸（ACC）的突变;所有种群对唑啉草酯、炔草酯和精噁唑禾草灵均表现敏感。田间试验结果表明,冬前使用除草剂对大穗看麦娘的防除效果优于冬后使用除草剂的效果,冬前唑啉草酯对大穗看麦娘鲜重防效为98.6%,而冬后处理为89.1%;冬前使用啶磺草胺、甲基二磺隆对大穗看麦娘的株防效和鲜重防效在72.2%—89.3%,冬后使用则为68.6%—83.2%;唑啉草酯、炔草酯和精噁唑禾草灵对大穗看麦娘均表现出很好的防除效果,冬前使用的株防效和鲜重防效均在96.2%以上,冬后使用在82.6%—92.2%。【结论】供试的9个大穗看麦娘种群中,发现1个种群对甲基二磺隆、啶磺草胺产生较高抗性,但未发现对唑啉草酯等产生抗性的种群,室内试验和田间试验结果具有一致性。     

抗苄嘧磺隆雨久花ALS基因突变研究

 【目的】近年来,中国东北水稻田抗药性雨久花发生严重,部分地区用苄嘧磺隆已无法有效控制该杂草的危害。为明确该杂草抗药性发生的根本原因,本试验从分子水平上研究了稻田杂草雨久花（Monochoria korsakowii）对苄嘧磺隆的抗药性机理,以确定导致抗药性产生的乙酰乳酸合成酶（ALS）氨基酸突变位点。【方法】利用PCR技术,通过对抗药性雨久花生物型和敏感性雨久花生物型ALS片段进行扩增和基因克隆,最后对DNA序列进行测序比对。【结果】与敏感性的雨久花ALS相比,抗药性雨久花生物型的ALS共有3处发生突变,即第197位脯氨酸突变为组氨酸,第200位蛋氨酸突变为缬氨酸,第388位精氨酸突变为组氨酸,其中第197位突变与诸多文献报道相符。【结论】抗药性雨久花ALS第197位的突变可能是雨久花对苄嘧磺隆产生抗药性的主要原因。其它2个氨基酸突变是否也导致杂草对苄嘧磺隆产生抗药性未见相关报道,有待进一步研究。     

山东省小麦田播娘蒿对双氟磺草胺抗性水平及靶标抗性机理

【背景】播娘蒿（Descurainia sophia）是一种冬小麦田分布广泛且危害严重的阔叶杂草,双氟磺草胺则是目前冬小麦田防除阔叶杂草应用面积最大的一种ALS抑制剂类除草剂。双氟磺草胺经多年应用后,对部分区域冬小麦田播娘蒿防治效果下降,可能与当地播娘蒿对双氟磺草胺产生抗药性有关。【目的】明确山东省冬小麦田播娘蒿对双氟磺草胺的抗性水平和抗性机理,为制定小麦田播娘蒿等阔叶杂草精准区域防控提供理论依据。【方法】以播娘蒿为研究对象,在温室内采用整株生物测定法测定40个播娘蒿种群对双氟磺草胺和对比药剂苯磺隆、2甲4氯共3种除草剂的抗性水平,同时根据播娘蒿ALS基因序列,设计引物,提取对双氟磺草胺高抗的播娘蒿单株基因组DNA,测序获得序列与敏感型基因进行比对,查找突变位点,明确靶标抗性机理。【结果】抗性水平测定结果表明,40个播娘蒿种群中有32个对双氟磺草胺敏感,占80.00%,低抗、中抗和高抗种群分别有3、3和2个,JN-1、JNI-2、LY-2为低抗种群,LC-3、LY-4、YT-1为中抗种群,相对抗性指数（RI）分别为49.00、26.44、21.09,BZ-1和DZ-3属于高抗种群,RI分别为52.00和194.00。对BZ-1和DZ-3进行的ALS基因检测结果表明,BZ-1种群ALS基因第197位氨基酸发生CCT（Pro）到TCT（Ser）或CTT（Leu）突变,DZ-3种群ALS基因第574位氨基酸发生TGG（Trp)到TTG（Leu）突变。另外,40个种群中对对比药剂苯磺隆产生抗性的种群有19个,占总样点数的47.50%,低抗种群有11个,中抗种群有6个,RI分别为38.05、13.55、11.54、10.45、11.50、11.02,高抗种群为DZ-3和LY-4,RI分别为244.75和68.50;40个播娘蒿种群对另一种对比药剂2甲4氯没有产生抗药性。【结论】山东省小麦田采集的40个播娘蒿种群中已有20.00%的种群对双氟磺草胺产生抗性,且高抗双氟磺草胺的播娘蒿种群发生不同位置氨基酸取代。播娘蒿对苯磺隆的抗性仍很严重,但对激素类除草剂2甲4氯未产生抗药性。针对播娘蒿发生区域,不能单一使用双氟磺草胺,应推广多种作用机理的除草剂交替、混和使用,从而延缓和控制杂草产生抗药性,同时扩大杀草谱、降低除草剂使用量。     

日本看麦娘对精噁唑禾草灵和甲基二磺隆的抗性机制

为明确抗性日本看麦娘种群对精噁唑禾草灵和甲基二磺隆的抗性机制,研究了乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACCase)和乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase,ALS)基因在抗性和敏感日本看麦娘种群内的差异,以及谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)的活性差异,同时测定了抗性种群AFT对不同的ACCase和ALS抑制剂类除草剂的交互抗性。结果显示:与敏感种群AH-7相比,抗性种群AFT的ACCase基因CT区的2027位氨基酸和ALS基因的574位氨基酸发生突变;AFT种群的GSTs活性经过精噁唑禾草灵和甲基二磺隆处理后明显增强,且显著强于敏感种群AH-7;抗性种群AFT对炔草酯、烯草酮、氟唑磺隆的抗性倍数分别为27.90、34.43、10.30,表现出高水平的抗性,对唑啉草酯、甲咪唑烟酸、双草醚的抗性倍数分别为5.49、6.42、5.01,表现出中等水平的抗性。经除草剂诱导后,植株体内基于GSTs代谢酶介导的代谢反应水平升高,加快植株对除草剂的代谢解毒反应;抗性种群AFT的ACCase基因和ALS基因中发生的氨基酸突变和GSTs活性的增强可能是其产生抗药性的重要原因。     

人工合成高抗菌核病甘蓝型油菜几种关键酶编码基因的表达与其抗性的关系

【目的】研究人工合成高抗菌核病甘蓝型油菜RB165的几种关键酶编码基因与菌核病抗性的关系。【方法】以RB165及其野生甘蓝抗病亲本BP（Brassica incana）和耐、感病甘蓝型油菜为试材,离体鉴定叶、茎菌核病抗性,并用qRT-PCR对4个病程相关基因（OXO、Cu/Zn SOD、PR2和PR3）在叶片接种0、6、12、24、36 h的表达进行检测。【结果】参试材料叶片和茎杆的抗病性达到极显著正相关（r = 0.93）; RB165的抗病性低于RP,但极显著高于耐、感病品（种）系;接种核盘菌后,OXO的表达被抑制,Cu/Zn SOD的表达则先下降后上升,PR2的表达出现2次峰值,PR3的表达被剧烈诱导,4个基因在不同材料间的相对表达量差异极显著,但变化规律相似。【结论】RB165的抗病性强于耐病甘蓝型油菜,但几种酶编码基因受核盘菌的诱导表达与菌核病抗性没有直接关系。     

一个谷子新抗锈基因的AFLP标记

【目的】研究谷子抗源的抗锈遗传规律,寻找和定位与谷子抗锈基因连锁的分子标记,为谷子抗锈病基因的定位、克隆和抗病育种等研究奠定基础。【方法】用谷子锈菌单胞菌系93-5接种十里香和豫谷1号及杂交后代F1、F2进行抗锈鉴定,并根据鉴定结果构建抗、感基因池;利用AFLP技术筛选128对EcoRⅠ/MseⅠ引物组合,从中寻找和定位与谷子抗锈基因连锁的分子标记;根据AFLP分析结果进行抗锈基因连锁分析并进行SCAR标记转化。【结果】根据十里香×豫谷1号杂交后代F2群体(131株)抗感谷锈病分离比例,确定十里香抗锈性由显性单基因控制。筛选获得3个与谷子抗锈基因Rusi1(暂命名)连锁的AFLP分子标记,经计算标记与该抗锈基因的遗传距离分别为7.4、9.2和27.4cM。将3个标记片段回收、克隆和测序,成功地将AFLP标记E+CTT/M+TAC-256转化为SCAR标记。初步构建了谷子抗锈基因Rusi1的遗传连锁图谱。【结论】谷子十里香抗锈性由显性单基因控制,Rusi1是一个新发现的谷子抗锈基因。     

利用野生甘蓝改良油菜Ogu CMS恢复材料的菌核病抗性

【目的】 油菜生产受菌核病危害严重,但油菜中缺乏抗源,严重限制了油菜抗菌核病育种进程。萝卜胞质不育系（Ogu cytoplasmic male sterility,Ogu CMS）是生产油菜杂交种最好利用的授粉控制系统之一,但目前还没有抗菌核病油菜Ogu CMS恢复系选育的报道。野生甘蓝中存在高抗菌核病的资源,以抗病野生甘蓝为抗源,拟将野生甘蓝的菌核病抗病遗传成分转入Ogu CMS材料中,发展优质抗菌核病的油菜Ogu CMS恢复材料,为进一步发展抗菌核病的油菜Ogu CMS恢复系提供资源。【方法】 首先采用抗菌核病野生甘蓝Brassica incana与白菜种间杂交,经胚挽救及染色体加倍技术发展人工合成甘蓝型油菜;然后将人工合成甘蓝型油菜与含Ogu CMS的油菜杂交,后代自交,并利用与甘蓝抗病QTL连锁的marker进行分子标记辅助选择（marker-assisted selection,MAS）,筛选携带主效抗病位点C1-QTL和C9-QTL的材料;MAS选中的材料通过侧枝离体接种鉴定评价其菌核病抗性,选择相对感病度S（susceptibility）显著低于甘蓝型油菜中双9号（耐病对照）的材料进行籽粒硫苷和芥酸含量测定,选择籽粒品质相对较好的材料进行恢保测定,筛选含抗病位点、抗菌核病、且结实率较好的Ogu CMS恢复材料。【结果】 成功获得抗病甘蓝与白菜杂交发展的人工合成甘蓝型油菜AC1-4,其菌核病抗性显著高于甘蓝型油菜中双9号;AC1-4与Ogu CMS甘蓝型油菜4Q292杂交产生了146个F₁单株,从中选择到含有甘蓝C1-QTL和C9-QTL、结实正常、相对感病度S分别为0.66和0.40的2个单株4C99和4C115发展F₂世代;并从124个F₂植株中筛选出8份材料自交发展了982个F_2:3单株,并从中筛选到50株含有抗病位点C1-QTL和C9-QTL的植株,其相对感病度S介于0.34—0.89;其中有2份籽粒品质接近单低的材料5X82-2（硫苷含量为45.38 μmol·g^-1饼粕）和5X82-7（芥酸含量为6.5%）。【结论】 改良了油菜Ogu CMS恢复材料的菌核病抗性。