中国对虾近交两代的DNA随机扩增多态性及其遗传规律分析

为评估DNA随机扩增多态性标记在中国对虾遗传连锁图谱构建中的应用前景,利用中国对虾单对交配亲本及其子二代材料,对RAPD标记及其遗传规律进行了研究。22条RAPD随机引物扩增结果的统计分析表明,标记在中国对虾F2的遗传规律可归为不分离标记和分离标记：不分离标记,指在亲本和后代中均不分离的标记,占总位点的54.1%;分离标记占总位点的45.9%。其中,分离标记又包括符合孟德尔遗传分离的标记、偏离孟德尔遗传分离标记和异常分离标记。符合孟德尔分离的标记中,分离比例为3:1的标记占分离标记的14.7%;总的1:1标记占分离标记的64.7%;偏离孟德尔分离和异常分离的标记分别占分离标记的11.7%和8.9%。在这些分离的标记中,有76.5%的位点在“双假测交理论”的策略中适合构建中国对虾的遗传连锁图谱,这为以中国对虾F2为作图群体,并利用RAPD标记构建中国对虾遗传连锁图谱提供了理论支持。     

中国对虾抗病性状遗传标记筛选及遗传多样性分析

对人工选育的29个中国对虾半同胞家系进行人工感染WSSV后,选取存活时间最长和存活时间最短各29个个体,组成抗病群体和感病群体。用400个随机引物进行RAPD分析,得到与抗病正相关的特异性遗传标记5个,与抗病负相关的特异性遗传标记两个。15个随机引物在两个群体的扩增位点进行统计,共得到82个位点,其中多态位点34个,占41.46%,两个群体的多态位点比例分别为40.24%和37.8%。Shannon′s多样性指数估算两个群体的平均遗传多态度为0.2177,SLT群体的遗传多态度为0.2190略高于SST群体0.2163;群体内的遗传变异（HPOP/HSP）0.9645,可见96.45%的遗传变异来自于群体内,3.55%的变异来源于群体间。统计各座位的基因频率计算出两个群体的遗传分化指数为0.0294,表明两个群体并没有发生明显的遗传分化。     

微卫星DNA标记用于中国对虾亲子关系的鉴定

在水产养殖中应用微卫星标记来确定亲缘关系已经得到认同和广泛使用。本研究通过控制交尾,利用微卫星标记确定中国对虾后代的亲缘关系,对微卫星标记应用于中国对虾的家系识别进行初步探讨。作者以4个谱系清晰的家系为基础,检测两对微卫星标记EN0033和RS062在中国对虾家系鉴别中的应用。结果表明,利用两对微卫星引物产生的DNA指纹图谱,能够有效地区分中国对虾4个家系。根据微卫星数据计算各家系之间的遗传距离,构建UPGMA图,得到的结果与各家系来源情况一致,进一步证明了微卫星技术在进行家系间的遗传分析中的可行性。EN0033和RS062两对微卫星标记的累积个体识别率高达0.989,属于高识别力的遗传标记系统,可以利用它们进行中国对虾的亲缘关系鉴定。     

对虾抗病性状遗传标记的RAPD分析

对人工选育的第3代中国对虾和选育的第1代凡纳对虾进行个体人工感染WSSV后，选取感染WSSV十余天但仍健康的对虾为实验材料，用220个随机引物进行RAPD分析，得到抗病性状相关的特异性遗传标记99个。其中中国对虾抗病组特异性片段出现了18个，片段大小在460－2305bp之间；凡纳对虾抗病组特异性片段产生81个，片段大小在435－2287bp。77个引物在两种对虾的抗病组扩增出特异性遗传标记，其中有4个引物各获得了三个特异性片段，有13个引物各获得了两个特异性片段，其余61个引物各获得了1个特异性片段。     

中国对虾生长性状相关遗传标记的筛选与克隆

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,对中国对虾“黄海1号”快速生长的第6代群体同一养殖池中生长性状发生分离的两个极端群体、海捕的中国对虾对照群体,进行生长相关遗传标记的筛选。采用240个RAPD引物,共产生标记数2156个。筛选出与生长性状相关的遗传标记65个,其中正相关标记55个,负相关标记10个。依据这些标记在群体中出现的频率和变化规律,筛选出9个特异性标记,其中正相关标记7个,负相关标记两个。对这些特异性标记进行序列测定,获得了6个完整的DNA序列(Genebank注册号DQ185932-DQ185937),并将测序结果进行BLAST分析,发现测得DNA的序列与数据库中已注册序列的相似性较低,未能找到同源性较高的功能基因。根据每一序列重新设计引物,已有两个RAPD标记成功转化为稳定的SCAR标记。     

中国明对虾第一代和第六代人工选育群体的遗传结构分析

采用RAPD技术对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)第一代和第六代人工选育群体的遗传结构及其分化进行了分析。在20个10bp随机引物中筛选出16个引物,共扩增出89条DNA片段,其中多态性片段分别为34和30条,多态位点比例分别为38．2％5和33．71％。对2群体的遗传学参数计算结果表明：2群体间遗传分化指数为0．1408,属中等程度分化;群体间的遗传变异平均为0．197,由此可见,80％的遗传变异来自于群体内,而近20％的变异则是来自于群体间;第六代群体的多态位点比例和遗传多态度均低于第一代群体,这可能与人工定向选育过程中注重经济性状有关。     

适合中国对虾群体遗传多样性和系统进化分析的DNA分子标记技术

中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）是我国海水养殖业中最具代表性的一项产业,优良种质和抗病力已成为对虾养殖业中迫切需要解决的问题。在遗传育种中若能筛选到与抗病、生长等数量性状紧密连锁的遗传标记,将为开展标记辅助育种工作和实现良种化奠定基础。对虾种质资源以及种群遗传学已成为研究热点,种群保护也已提到议事日程。这些研究工作的开展将为对虾良种选育提供理论依据,相信随着研究工作的继续深入,人们会更好、更有效地利用对虾资源。本文对目前已经在对虾遗传多样性和系统进化研究中进行应用的DNA标记技术方法进行分析总结,拟对今后其他物种开展相关工作提供借鉴。     

花鲈养殖群体随机扩增DNA多态性分析

利用RAPD技术检测了象山港养殖花鲈种群内的基因组DNA的多态性。从100个10bp随机引物中筛选出25个随机引物,共扩增了165个位点,平均每条随机引物能够扩增出6.6个位点。165个位点中有80个位点表现出多态性,多态位点比率为48.48%。遗传相似度为0.8815,遗传距离为0.1185。表明目前象山港养殖花鲈种群内具有较高遗传多样性,花鲈的人工养殖具有很大的发展前景。     

中国对虾遗传连锁图谱的构建

利用RAPD、SSR和AFLP三种标记技术结合"拟测交"策略,以中国对虾"黄海1号"雌虾与野生雄虾作为亲本进行单对杂交产生的F1家系为作图群体,初步构建了中国对虾雌、雄性遗传连锁图谱.对460个RAPD引物和44对SSR引物进行筛选,共选出61个.RAPD和20对SSR引物,结合88对AFLP引物组合对父母本和82个F1个体进行了遗传分析.共得到783个分离标记(RAPD标记237个,微卫星标记45个,AFLP标记501个),761个标记用于连锁分析.雌性图谱包括40个连锁群和15个三联体,20个连锁对,标记间平均间隔为12.5 cM,图谱共覆盖2835.5 cM,覆盖率为73.5%;雄性图谱包括41个连锁群和6个三联体,12个连锁对,标记间平均间隔为11.9 cM,图谱共覆盖2776.7 cM,覆盖率为73.3%.中国对虾遗传图谱的构建为其分子标记辅助育种、比较基因组作图及数量性状位点(QTL)的定位与克隆奠定了基础.     

中国对虾家系水平遗传多样性的AFLP分析

采用扩增片段长度多态性分子标记技术对中国对虾的40个家系共200个样品进行了家系水平的遗传多样性分析。利用10对引物共产生307个表达清晰可用于分析的标记,其中189个标记表现为多态性,占总标记数的61.56%;中国对虾各个家系多态位点百分率在12.7%～34.2%之间;各个家系基因多样性指数在0.0494～0.122之间,Shannon指数的范围在0.0725～0.182之间(家系水平为0.1975)。对40个家系的AMOVA分析结果显示,家系间的基因分化系数Gst=0.4713,即总的遗传变异中有47.13%的变异存在于家系间,家系内的遗传变异占总遗传变异的52.87%。采用UPGMA法对中国对虾的40个家系进行了聚类分析,确定了各个家系之间的遗传亲缘关系;并且对200个个体进行了聚类分析。结果表明,90%同一家系的子代个体能完全聚类在一起。通过家系间的遗传分化系数Gst对中国对虾的40个家系间的基因流进行了估测,结果显示,Nm=0.5609,表明基因流处于较低水平。     

中国对虾5个地理群体的RAPD分析

采用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对取自辽东湾、渤海湾、海州湾、乳山湾及海洋岛5个群体的中国对虾共95个个体的遗传多样性进行分析。14个随机引物共检测出103个位点(200～2500bp),各群体的多态位点比例在31．07％～34．95％之间。遗传距离显示中国对虾群体间有一定遗传分化,其中辽东湾和乳山湾群体问的遗传距离最大(0．0742),而辽东湾和渤海湾群体间的遗传距离最小(为0．0243),群体间的遗传分化系数为0．2083。整体来看,中国对虾的遗传变异水平较低,遗传多态度为0．1621。用UPGMA对5个群体进行聚类分析,构建谱系关系图。     

利用中国明对虾单对杂交亲本及其F↓（2）群体构建RAPD遗传连锁图谱

由中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)单对杂交亲本(G♀和G♂)及其F2为作图群体,构建了中国明对虾RAPD分子标记的遗传连锁图谱。109个引物共产生284个符合孟德尔分离规律的位点,符合1∶1孟德尔分离类型的位点共234个,符合3∶1孟德尔分离类型的位点50个。利用拟测交理论分别构建中国明对虾雌虾、雄虾的遗传连锁图谱。107个1∶1分离标记分布于雌虾连锁图谱中,包括31个连锁群,图谱总长度为1 406.1 cM,所有标记间的平均间隔为18.5 cM;91个1∶1分离标记分布于雄虾连锁图谱中,包括26个连锁群,图谱总长度为1 187.7 cM,所有标记间的平均间隔为18.27 cM;利用F2自交模型构建了雌虾和雄虾共同的分子标记,35个3∶1分离标记分布于雌雄共有的连锁图谱中,包括10个连锁群,图谱总长度为432.9 cM,所有标记间的平均间隔为17.3 cM。     

Polymorphic analysis of microsatellite DNA in wild populations of Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis)

Primers were designed for eight microsatellite loci from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis. Microsatellites were used to characterize three wild populations from the China coast of the Yellow and Bohai Seas (HB), and the west coast (KX) and south coast of the Korean Peninsula (KN). A total of sixty‐one alleles were obtained, and the average observed heterozygosity ranged from 0.660 to 0.756. Six of the 24 population‐locus cases showed a significant departure from the Hardy–Weinberg equilibrium, three of them from population KN, two from KX and one from HB. The F_st values indicated that genetic variation was greater within populations than between populations. Analysis using unweighted pair group method with arithmetic mean showed that the relationship between populations HB and KX was closer than between KN and the other two populations. Polymorphic information contents of the eight microsatellites ranged from 0.598 to 0.918. These results indicated that all eight microsatellite loci would be useful for the analysis of genetic variation in Chinese shrimp (F. chinensis) populations.     

磺胺甲基异噁唑在中国明对虾体内的残留和消除规律

在(20±2)℃水温条件下,研究磺胺甲基异唑在中国明对虾肌肉、血淋巴和肝胰脏3种组织中的残留及消除规律。药物在对虾肌肉、血淋巴、肝胰脏中的残留用二氯甲烷提取,反相高效液相色谱法检测,最低检测限可达0.01μg/mL,平均回收率为80%~90%。研究结果表明:磺胺甲基异唑在中国明对虾血淋巴中的残留量最小,在肝胰脏中的残留量最大且消除较慢,差异明显。建议把对虾的肝胰脏作为该药残留监控的靶组织,相应的休药期至少为20 d。     

中国明对虾抗白斑综合症病毒分子标记的筛选

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对经过连续4代选育的抗白斑综合症病毒(WSSV)中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)(174)及未经选育的与174来源相同的中国明对虾野生群体(HB)进行分析,以期筛选出与抗病性状相关的分子遗传标记,为进一步的基因定位以及中国对虾的种质资源保护和分子标记辅助育种提供有力的技术支撑和理论依据。共进行220个RAPI)单引物和114对双引物的检测,产生标记数目共计2439个。依据标记在群体中出现的频率和变化规律,共筛选出5个可能与抗病相关的特异性标记,对这些特异性标记进行测序并将测序结果进行BLAST分析,发现测得片段的序列与数据库中序列的相似性较低,未能找到与所测序列同源性较高的功能基因。这与利用AFIP技术分析的结果一致。由于选育过程施加人工选择,推论这些特异性标记虽不是抗WSSV分子标记,但可能与抗病性状密切相关。     

微卫星DNA技术用于中国对虾家系构建中的系谱认证

用6个微卫星标记对中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）的5个家系进行系谱鉴别和遗传多样性研究。6个微卫星位点中有5个位点是多态的，并在所有家系中都显示了高度的遗传差异。5个家系中，5个多态微卫星位点共发现了30个等位基因，每个位点的等位基因数在5～8之间。实验中共发现了4个家系特异性等位基因：2^#家系及4^#家系各1个，5^#家系2个。根据已知亲本及子代基因型，可推断出5个家系中全部亲本的基因型，据此鉴别各家系。在EN0033位点，可将5#家系与其他4个家系相区别；在RS0859位点，可将3^#和4^#家系与其他3个家系相区分。因此，EN0033和RS0859标记可用于鉴别5^#、3^#和4^#家系的家系特异性标记。研究表明，用5个微卫星标记，且最少用2对微卫星标记即可鉴别5个中国对虾家系。     

Vc-2-多聚磷酸酯对中国对虾稚虾生长、免疫及体内Vc含量的影响

用添加不同浓度LAPP的饲料投喂中国对虾30d,每隔5d取对虾血淋巴,测定血清中超氧化物歧化酶活力、溶菌活力、酚氧化酶活力;试验结束时测定盐度突变对中国对虾成活率的影响及其体内维生素C积累量的变化情况。结果显示,高浓度LAPP组对虾较对照组及低浓度组3种酶活力都达到了显著差异(P<0.05),但是酶活力并不是持续升高,一段时间后又有所回落;盐度突变试验结果表明,添加0.3%组显著提高了对虾的成活率;HPLC法测定对虾体内维生素C积累量的变化情况显示,在一定范围内对虾体内的维生素C积累量随着饲料中维生素C添加水平的提高而提高。在本试验条件下,建议中国对虾稚虾饲料LAPP的适宜添加量为3000mg/kg。     

丁鱥雌核发育鱼的异源精子诱导及其与亲本的RAPD比较分析

Gynogenesis is thought to be a useful method to generate fully inbred line and to initiate monosex culture in teleost fish. This article presents results of a study of gynogenesis of tench, Tinca tinca L. from Eltrix River of Xinjiang, China, induced by the common carp ( Cyprinus carpio ) sperm inactivated with UV irradiation. When cold shocking method was used to prevent exmasion of the second polar body in order to produce gynogenetic diploids, the optimum treated parameters were screened as cold shocking for 20min at 4℃, 5min after insemination. On this condition, 10.23% of the treated eggs survived at feeding stage. A comparative study between the gynogenesis and their parents was made by RAPD technique. 82 random primers of 10 nucleotide long sequence were used in RAPD analysis. The results showed that each primer gives 3- 12 fragments for each sample with the fragment length 330 - 2 460 bp, and the genetic similarity between gynogenesis and their mother was 97.4 %, while the genetic similarity between gynogenesis and their father was 27.4%, and there were no bands only shared by gynogenesis and their father, the common carp. It revealed that the chromosome of their father, the common carp, did not penetrate into the construction of gynogenetic tench.     

The responsive expression of a caspase gene in Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis against pH stress

Caspases are a family of proteases, which play an important role in apoptosis. To evaluate the relationship between apoptosis and pH stress in crustaceans, a caspase gene (FcCasp) was cloned from the Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis. The full length of FcCasp was 1329 bp with a 972 bp ORF, encoding a polypeptide of 323 amino acids with a calculated molecular weight and pI of 36.0 kDa and 6.27 respectively. The deduced amino acid sequence of FcCasp contained a potential active site (QACRG pentapeptide) conserved in most caspases and two profile hits (p20 and p10 domain profile). Comparison of amino acid sequences revealed that FcCasp had an overall similarity of 76–83% with other penaeid shrimp caspases. The amino acid sequence of recombinant FcCasp protein expressed in Escherichia coli was identified by matrix‐assisted laser desorption/ionization‐time of flight‐mass spectrometer analysis. High‐level expression of FcCasp in six different tissues was detected by real‐time polymerase chain reaction after exposure to pH stress for 96 and 148 h. TUNEL analysis indicated that apoptosis began to appear in F. chinensis hepatopancreas exposed to extreme pH for 12 h. The amount of apoptosis seems positively correlated with the length of exposure to the pH stressor. The results suggested that FcCasp was involved in the response to environmental pH stress.