兔CCR10基因的克隆与序列分析

摘 要：【研究目的】克隆并分析兔CCR10基因;【方法】基于电子延伸序列,设计1对克隆引物,兔盲肠黏膜组织提取总RNA,进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coli JM109感受态细胞、检测阳性克隆、测序并进行序列分析。【结果】克隆的兔CCR10 基因长为723bp,编码由241个氨基酸残基组成的CCR10前体蛋白,三级结构预测表明CCR10具有一个多克隆免疫球蛋白区（PIG-X）。克隆的兔CCR10基因与绵羊、人的同源性分别为89.6%、89.9%,推导的氨基酸序列与绵羊、人的同源性分别为94.2%、93.8%,结构特征与绵羊、人的相一致。【结论】克隆了兔CCR10基因并注册GenBank (Accession. EU348829)。     

绵羊regakine-1基因的克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊regakine-1基因;【方法】肠系膜淋巴结组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化JM109感受态细胞,筛选阳性克隆、测序,并进行序列分析;【结果】克隆的绵羊regakine-1基因与牛的同源性为91%,推测的氨基酸序列信号肽为1~21aa,SCY结构域为29~87aa,结构特征与牛的相一致。【结论】克隆了绵羊regakine-1基因的ORF,并注册GenBank (AccessionEF617337)     

猪Musclin基因片段克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析猪musclin基因；【方法】肌肉组织提取总RNA，利用设计的引物进行RT-PCR，PCR产物与pMD19-T连接后转化E. coli DH5α，检测阳性克隆并测序；【结果】克隆的猪musclin基因片段与人、大鼠、小鼠同源性分别为86%、78%、75%，预测的氨基酸序列含有“KKKR”结构和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域；【结论】克隆了猪musclin基因片段并注册GenBank (Accession.EF369511)。     

猪FcRn基因及其剪接变体序列的克隆与序列

【研究目的】克隆并分析猪FcRn基因;【方法】十二指肠组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化JM109感受态细胞,筛选阳性克隆并测序;【结果】FcRn阳性克隆两条序列在NCBI上比较,显示序列同猪FcRn（AY740682.1）同源性都为99 %。【结论】克隆了猪FcRn基因的序列和其剪接变体序列,其剪接变体序列已在GenBank 上注册（Accession.EU852582）     

小鼠不同组织中催乳素释放肽 受体基因表达的研究

【研究目的】克隆并研究小鼠催乳素释放肽受体基因在妊娠期小鼠不同组织的表达【方法】提取小鼠不同组织总RNA,进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T连接后转化E.coli DH5a,检测阳性克隆并测序【结果】测序结果表明,所得序列与小鼠催乳素释放肽编码区序列的相似性为99.49%【结论】克隆所得序列为小鼠催乳素释放肽受体基因片段,催乳素释放肽在妊娠期小鼠不同组织均有表达     

绵羊BMP15基因FecXL突变的检测

【目的】旨在寻找与产羔数相关的遗传标记,为绵羊高繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。【方法】以控制Lacaune绵羊高繁殖力的骨形态发生蛋白15(bonemorphogenetic protein15,BMP15)基因为候选基因,采用PCR-SSCP方法在绵羊(Ovisaries)高繁殖力品种(小尾寒羊和湖羊)和低繁殖力品种(多赛特、特克塞尔、考力代、杜泊、南非肉用美利奴和中国美利奴绵羊)中检测BMP15基因的FecXL突变,同时研究该基因突变对小尾寒羊和湖羊高繁殖力的影响。【结果】这8个绵羊品种都没有发生与Lacaune绵羊相同的FecXL突变(C53Y)。【结论】BMP15基因中影响Lacaune绵羊高繁殖力的突变位点对小尾寒羊和湖羊的高繁殖力都没有显著影响。     

猪Reg3基因的克隆与序列分析

在猪的肠道组织中克隆Reg3基因,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E.coliJM109,检测阳性克隆、测序并进行序列分析.结果表明:克隆的猪Reg3基因与人、绵羊、马的同源性分别为83.7%,82.3%,82.2%;克隆了猪Reg3全长基因并注册GenBank注册...     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆与过表达载体的构建

【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米（Waxy corn）新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。     

番茄WRKY转录因子基因片段的克隆及序列分析

【研究目的】本研究以番茄苗为实验材料,克隆出番茄WRKY转录因子的一个基因片段并对其核酸序列进行分析。【方法】根据本课题组已经克隆出的番茄特异的WRKY基因片段和番茄EST序列设计特异引物,利用RT-PCR技术获得番茄WRKY转录因子的一个基因片段并连接到pMD19-T载体中,转化DH5α,,筛选阳性克隆,用双酶切分析法对其进行鉴定并进一步对核酸序列进行测序分析。【结果】结果表明,克隆获得的WRKY转录因子基因片段约为680bp,用GenBank中的Blastn程序分析表明,其与CaWRKY（AY789641.1）、WIZZ（wizz mRNA）（AB028022.1）的相似性分别为86％和84％。【结论】WRKY转录因子在番茄中受JA诱导,这为克隆番茄WRKY基因全长,进而为番茄抗病育种奠定基础。     

德州驴生长激素基因的克隆与序列分析

摘要：【研究目的】为了研究德州驴生长激素基因的多态性及其对生长发育的影响,【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果,在线设计引物,应用PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的德州驴GH基因DNA序列及其推定cDNA、氨基酸序列进行分析。【结果】结果表明德州驴GH基因DNA序列约为1928bp,包含完整的5个外显子和4个内含子,德州驴GH基因DNA序列与德宝矮马67、蒙古马、猪、牛、绵羊和人GH基因序列的同源性分别为98.8%、98.2%、79.4%、68.3%、70.9%和68.3%,cDNA编码的氨基酸序列同源性分别为99.5%、98.6%、97.2%、89.8%、88.9%和68.4%。【结论】表明GH基因在进化上非常保守。     

荞麦BTI全长基因的克隆及表达分析

【研究目的】扩增荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)基因,并对其表达特性和氨基酸同源性进行分析。【方法】根据荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,以荞麦cDNA为模板,扩增BTI基因并进行序列及其表达谱分析。【结果】克隆得到了BTI基因。它的cDNA全长为459bp,含有一个216bp的完整阅读框,编码72个氨基酸。同源性分析表明,其蛋白质序列与已报道的荞麦种子提取的BWI-1的氨基酸序列的同源性达96%,与笕属植物ATI、亚麻属植物Luti、马铃薯蛋白酶抑制剂PPI-I的氨基酸序列的同源性分别为65%、59%、48%。RT-PCR分析表明,BTI基因可在不同的组织中进行表达,但经伤害处理后的叶片中其表达量略高于生长各阶段。这可能与逆境情况(如外界损伤)下的应答等生理过程有关。【结论】荞麦BTI基因的获得,可为荞麦胰蛋白酶抑制剂的基础及应用研究奠定基础。     

海岛棉GbWRKY40基因的克隆及特征分析

【目的】WRKY转录因子调控多种生物学进程,包括植物生长发育和应答多种环境胁迫。本研究旨在分析WRKY转录因子在海岛棉纤维发育中的功能。【方法】从海岛棉中克隆了1个WRKY转录因子基因GbWRKY40,进行同源性分析、多序列比对,利用荧光定量聚合酶链式反应分析其表达模式,通过构建酵母表达载体并转化酵母菌株AH109研究其转录激活活性。【结果】该基因c DNA全长1713 bp,5'非编码区长261 bp,3'非编码区长510 bp;开放阅读框长942 bp,编码313个氨基酸,预测相对分子质量约为34.138×103,等电点为8.46,包含5个外显子和4个内含子;其编码蛋白含有1个WRKY保守区(WRKYGQK)和1个锌指基序(C-X5-C-X23-H-X1-H),属于WRKY家族第Ⅱ类a组,包含3个核定位信号区,与陆地棉GhWRKY40同源性最高。GbWRKY40在根和开花后25 d纤维中表达量高,而且不具有转录激活活性。【结论】GbWRKY40可能参与调控棉纤维次生壁发育。     

羊草乙醛脱氢酶（ALDH）基因片段的克隆及表达分析

[研究目的]克隆羊草的乙醛脱氢酶ALDH基因片段,研究该基因在不同条件下的表达情况。[方法]采用RT-PCR技术克隆羊草的ALDH基因片段,并对其核苷酸和氨基酸序列进行分析,采用Real Time RT-PCR 方法研究该基因的表达。[结果]获得了羊草的ALDH基因片段,长度为675 bp,编码225aa。核苷酸序列比较表明,与水稻ALDH1a序列(AB037421)同源性为86%,与玉米RF2C（AF348413）同源性为85%。BLASTp分析,该序列与水稻、玉米、拟南芥的乙醛脱氢酶一致性分别高达87%、86%、60%,含有醛脱氢酶基因家族的保守结构域。Real Time RT-PCR数据表明,在诱导条件下该基因的表达量呈先升高后降低的趋势。总体上来说,该基因对盐的响应要高于干旱和冷冻。[结论]本研究成功获得了羊草ALDH基因片段,并研究了该基因的表达情况,为进一步克隆羊草ALDH全长基因奠定了基础。     

陆地棉NAC转录因子基因GhNAC6的克隆、表达和耐盐性分析

【目的】NAC(NAM-ATAF-CUC)家族是植物细胞内特有的1类转录因子家族,参与植物的抗逆过程。为了研究棉花抗逆的分子机制,本研究从陆地棉TM-1中克隆到1个NAC转录因子基因并研究了其功能。【方法】根据其序列同源性和进化分析结果,将该基因命名为GhNAC6,本文对GhNAC6进行了生物信息学和表达分析,并利用病毒诱导基因沉默技术在棉花中沉默GhNAC6的表达。【结果】GhNAC6全长为1629 bp,包含2个内含子,其中编码区为900 bp,编码1个相对分子质量为33.9×10~3、等电点为6.18的蛋白。GhNAC6启动子区段包含多个与诱导表达和组织特异表达相关的顺式作用元件。转录组数据分析结果表明,GhNAC6在棉花发育的不同时期具有时空表达差异性;实时荧光定量核酸扩增检测结果显示GhNAC6还受到植物激素水杨酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和逆境胁迫低温、高温、高盐、伤口的诱导。干涉GhNAC6基因发现,降低GhNAC6基因的表达能增强棉花对盐胁迫的耐受性。【结论】研究结果表明GhNAC6可能参与了棉花发育、逆境响应和激素信号传导的过程。     

绵羊显性白位点基因（KIT）cDNA的克隆与序列分析

显性白位点基因座位编码一种跨膜蛋白-----肥大细胞生长因子受体,这种受体对黑色素细胞的形成、成熟及增殖迁移有重要作用。本研究克隆了绵羊KIT基因的部分编码序列,首次获得绵羊KIT基因的cDNA序列。并与其它动物相应区域作了同源性比较,结果表明：绵羊KIT基因exon11-19 cDNA长1003bp,编码含331个氨基酸残基的蛋白;蛋白质同源性比较显示,绵羊与牛、羊、猪、人、马等的同源性大于94%;通过对绵羊该蛋白进行结构域及结构分析,为进一步研究KIT基因与绵羊毛毛色的关系奠定了一定的理论基础。     

亚洲棉EST-SNP的挖掘及其在陆地棉中的验证

【目的】随着不同棉种序列数据库的逐步完善以及高通量测序技术的发展,棉花单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)标记开发可利用的公共数据资源逐步增加。【方法】本研究基于陆地棉祖先基因组的现代种亚洲棉表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)数据库,利用CAP3对亚洲棉EST数据库进行拼接。拼接获得7 187个重叠群(Contig),再利用Quality SNP软件进行SNP位点分析。【结果】在807条含有4条以上EST序列的Contig中查找到2 690个SNP位点。通过筛选次要等位基因频率大于30%的位点,获得953个可靠度较高的候选SNP,通过电子筛选,最终获得可用于陆地棉分析的SNP 149个,利用位点特异性聚合酶链式反应以及酶切扩增多态序列验证了EST-SNP的准确性。【结论】本研究证实基于亚洲棉EST数据库挖掘用于陆地棉研究的EST-SNP切实可行,并有望将EST-SNP用于陆地棉遗传图谱构建、重要性状的基因定位以及分子标记辅助育种。     

猪圆环病毒Ⅱ型PCR检测方法的研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5ng/ml。     

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。