柑橘黄龙病菌核酸检测技术研究进展

候选韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter spp.）是一类通过虫媒传播,寄生于韧皮部的革兰氏阴性细菌,引起柑橘上的毁灭性病害——黄龙病（Huanglongbing,HLB）。柑橘感染黄龙病后在3～5年内便会衰亡或丧失结果能力,目前尚无有效防治药剂,果园若不及时在感染初期铲除病树,病害会在柑橘木虱的活动下迅速蔓延至整个果园,乃至摧毁整个地区的柑橘产业,造成不可估量的损失。培育无毒苗木、尽早发现和彻底铲除病树是防控柑橘黄龙病的关键,因此建立快速、精准的检测方法是防控黄龙病的基础。本文主要综述了柑橘黄龙病各种核酸检测方法及其优缺点,以期对建立更加灵敏、准确、高效的检测技术提供参考。     

柑橘黄龙病防治技术研究进展

柑橘黄龙病(huanglongbing,HLB)是世界柑橘产业内最具毁灭性的传染性病害.截近十年来,随着各国政府和科学家重视程度的不断增加,黄龙病的防治研究工作取得了显著进展.本文对国内外近十年来应用于黄龙病防治的诱导抗病技术、转基因等新型防治技术以及针对传统防治方法的改良情况进行了集中综述,分析了目前柑橘黄龙病防治研...     

柑橘黄龙病菌亚洲种菌毛装配蛋白基因(PAP)序列分析、原核表达及抗血清制备

菌毛装配蛋白(Flp pilus assembly protein, PAP)是一种分泌蛋白,参与细菌菌毛的组装,表达量高。本研究以感染柑橘黄龙病的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,用其菌毛装配蛋白基因(PAP)的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段,序列分析表明海南琼海柑橘黄龙病菌PAP基因与柑橘黄龙病菌亚洲种(GenBank登录号:CP001677.5)PAP基因序列一致。功能预测表明它含有两个与分泌功能相关的CpaC和Secretin结构域。PCR产物通过EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切构建重组载体pET32a-PAP。将pET32a-PAP载体转化BL21(DE3)大肠杆菌,经终浓度为1 mmoL/L IPTG诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白经Ni~(2+)-NTA层析柱纯化,并作为抗原腹腔免疫小白鼠,获得效价在1∶500～1∶1 000的多克隆抗血清。Western blot分析表明,PAP多克隆抗血清特异性强;以田间样品总蛋白做抗原时,能特异性检测染病样品。本研究为PAP蛋白功能研究和开发柑橘黄龙病菌的蛋白检测产品提供研究基础。     

基于原噬菌体类型的广西柑橘黄龙病菌种群分析

2016年-2021年, 从广西各柑橘产区采集叶片斑驳?黄化等疑似黄龙病症状的柑橘样品, 利用黄龙病特异引物和基于原噬菌体类型的特异引物对样品进行鉴定及分析, 结果显示, 所采集的3 293份样品中有856份样品为黄龙病阳性样品, 阳性样品的检出率为25.99%, 阳性样品在广西的14个地市均有分布?基于原噬菌体类型的黄龙病菌种群分析发现, 广西存在7种类型的菌株, 分别是type 1菌株?type 2菌株?type 3菌株?type 1+type 2菌株?type 2+type 3菌株?type 1+type 2+type 3菌株及未检出任何类型菌株(none type), 其中, type 2类型原噬菌体菌株为优势种群?     

水稻病毒与植物寄主互作研究新进展

水稻是维持世界一半以上人口生存的主要粮食作物,其产量和品质关系到社会稳定。近年来,水稻病毒引起的病毒病严重影响作物的产量及品质。植物在与病毒长期的互作过程中进化出了多种有效的防御机制来抑制病毒侵染。本文围绕近年来国内外关于水稻抗病毒的研究进展,对植物激素、自噬与水稻病毒的互作关系进行总结,并提出了水稻病毒研究过程中所涉及到的一些问题,以期为开展水稻抗病育种相关研究提供参考。     

田间柑橘植株不同部位黄龙病菌的PCR检测及发病原因分析

［目的］了解黄龙病菌在柑橘植株不同部位的分布,为深入研究病菌在植株体内的扩散情况奠定基础;明确病害的发生原因为有效防控该病害提供借鉴。［方法］ 调查浙江省台州市柑橘黄龙病（huanglongbing, HLB）的发生情况,通过常规和巢式PCR,检测了发病情形不同的两个果园内柑橘病株不同部位及不同植株中的黄龙病菌,并对其发病原因进行分析。［结果］ 发现一果园内病株的无症状叶片、有症状叶片和枝条中均含有黄龙病菌,而其周围植株不含病菌;另一果园内病株的有症状叶片、枝条、主干和砧木中均含有黄龙病菌,而其周围植株也含菌。［结论］分析认为这两种果园内柑橘植株发病原因不同,一种可能为通过携带黄龙病菌的柑橘木虱所感染,另一种可能为嫁接过程中通过带菌的接穗感染。     

广东三个柑橘品种不同生育期的黄龙病菌含量动态变化研究

采用实时荧光定量PCR检测了广东省3个柑橘品种在不同生育期的黄龙病菌含量,探索其动态变化规律,为病害防控提供依据。结果表明,第一年,3个品种春梢期的黄龙病菌平均含量分别为3.52×10~5、4.76×10~5、1.03×10~5拷贝/g,显著低于相应夏梢期(5.50×10~5、9.48×10~5、2.50×10~5拷贝/g)和秋梢期(5.32×10~5、9.84×10~5、2.59×10~5拷贝/g);夏梢期与秋梢期含量又显著低于相应冬梢期(21.60×10~5、17.65×10~5、6.86×10~5拷贝/g)及果实成熟期(14.57×10~5、16.45×10~5、7.96×10~5拷贝/g);砂糖橘全年黄龙病菌含量与贡柑无显著差异,但均显著高于柠檬;第二年的数据与第一年类似,但砂糖橘和贡柑在多个生育期的含菌量比上年均显著升高,而柠檬所有生育期菌量均无显著变化。结果显示:柑橘病树内的黄龙病菌含量在春梢期最低,夏梢、秋梢期次之,冬梢期及果实成熟期最高;‘柠檬’相对耐病,体现为含菌量相对较低、增速较慢。     

广东柑橘黄龙病发生情况与防控对策浅析

近年来,广东柑橘黄龙病为害较严重,威胁本省柑橘产业安全。从工作实践出发,对目前广东省柑橘黄龙病的发生情况及其为害蔓延的主要原因进行了分析,提出了加强柑橘黄龙病防控的对策措施。     

黄龙病菌在柑橘枝条上的分布和多样性分析

 柑橘黄龙病是由“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas)引起的毁灭性病害,在染病植株的叶片和果实上表现出不同症状。但目前还未见在同一植株或枝条上表现不同症状的叶片或果实中的CLas是否存在多样性的报道。本研究分析来自美国佛罗里达与中国广东两地染病柑橘样品,发现佛罗里达的CLas遗传多样性较低。以3对位于CLas短串联重复位点两端的序列为引物,对广东柑橘黄龙病病株的样品进行PCR扩增和PAGE检测,结果发现:同一植株上的CLas多样性高于同一枝条;同一病枝上显不同症状的叶片和果实中的CLas浓度分布不均匀,但成熟病果中CLas的浓度最高。以同一病枝条为一个组,PCR扩增和PAGE检测53个枝条的样品,发现不同组间CLas多样性不一:3对引物扩增条件下分别有4组(7.55%)、7组(13.21%)和11组(20.75%)样品存在组间多样性,推测同一枝条中含有不同的CLas菌株。以上结果说明了CLas在柑橘枝条上的分布规律,为监测我国CLas的多样性提供了科学依据。     

台州市柑橘黄龙病发生与防控实践

本文对台州市柑橘黄龙病历年发生情况进行了概述,对台州市近二十年行之有效的柑橘黄龙病防控经验进行了阐述,即采取“挖治管并重,综合防控”的总方针,坚持推广以春防、夏防和秋冬防相结合的“三防”,把好种苗检疫关、疫情普查关、病株挖除关、健株栽培关、木虱防治关等“五关”为主的综合治理技术,以及加强政府领导、加强目标考核、加强宣传培训、加强工作部署、加强财政投入、加强示范推广、加强工作督查等“七加强”措施,以确保台州市柑橘产业的健康发展。     

基于原噬菌体类型的我国柑橘黄龙病菌种群遗传结构分析

 柑橘黄龙病是柑橘生产上最严重的病害之一,由难培养的候选韧皮部杆菌亚洲种(“Candidatus Liberibacter asiaticus”, CLas)引起。目前,已报道的与CLas相关的原噬菌体有3种,并且不同的CLas样品中可以检测到不同类型的原噬菌体或不同类型的组合。本研究基于原噬菌体类型特异引物对从我国南方8省收集的548个黄龙病样品进行原噬菌体类型的鉴定和分析。结果表明,基于原噬菌体类型,在548个样品中共鉴定了7种类型的菌株,分别为Type 1(7.12%)、Type 2(60.22%)、Type 3(3.83%)、Type 1+Type 2(3.28%)、Type 1+Type 3(17.34%)、Type 1+Type 2+Type 3(3.47%)和None类型(不含上述3种类型原噬菌体)(4.74%),其中只携带Type 2类型原噬菌体菌株为华南地区优势种群。此外,基于遗传多样性和遗传距离对我国南方地区的CLas种群进行种群结构分析发现,我国南方地区的CLas种群可以分为3个组,即I组(广东、江西、广西、福建)、II组(浙江和湖南)以及III组(云南和海南),其中I组和II组又可聚为一大组。该结果可为研究我国柑橘黄龙病流行规律提供一定的理论基础。     

河池市柑橘黄龙病发生情况与防控对策浅析

柑橘是河池市的传统果树。柑橘黄龙病是一种毁灭性病害,是柑橘的癌症。2005-2015年,连续10 a就河池市柑橘黄龙病疫情进行了普查和防控工作,在防控上取得了较大的成绩,并摸索出了一套科学、有效的防治技术。     

利用酵母双杂交筛选与致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586互作的寄主蛋白

 致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的病原菌,其分泌的效应蛋白是侵染寄主的重要毒力因子。本研究在致病疫霉转录组中筛选到一个侵染早期表达的效应蛋白基因PITG_07586(GenBank:XM_002904522.1)。该基因全长447 bp,其编码蛋白包含1个信号肽,1个核定位信号序列(RRRRKRRKKKK)。在本氏烟草中,瞬时表达该基因显著促进病原菌侵染。亚细胞定位表明GFP-PITG_07586定位在细胞核中。利用酵母双杂交技术并以PITG_07586为诱饵筛选马铃薯cDNA文库,最终获得3个靶标蛋白。经序列比对分析,这3个靶标蛋白分别是马铃薯POM30蛋白、电压依赖阴离子通道蛋白VDAC以及SRC2类蛋白。研究结果为致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供重要依据。     

三种PCR方法检测柑橘黄龙病菌的效果比较

为了比较常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR方法在大田检测中对柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)的检测效果, 首先比较了3种检测方法对柑橘黄龙病菌检测的灵敏度, 结果发现：3种检测方法的灵敏度依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。运用3种检测方法对广东5个柑橘品种上的189个黄龙病疑似病样进行检测, 结果发现：黄龙病检出率依次为常规PCR<巢式PCR<实时荧光定量PCR。研究表明：常规PCR适合以较低成本大规模检测黄龙病; 实时荧光定量PCR具有最大的检测灵敏度; 巢式PCR检测技术同时具有前两者的一些优点, 但操作较复杂, 适合技术熟练的研究者使用。     

苹果与炭疽菌互作研究进展

近年来,由炭疽菌引起的苹果炭疽病已成为阻碍苹果产业健康发展的重要病害之一.苹果与炭疽菌的互作研究有助于苹果炭疽病的科学防治和抗病育种.笔者从苹果炭疽病病菌的致病机制、苹果种质资源对炭疽菌的抗性表现和苹果对炭疽菌的抗病机制等方面对苹果与炭疽菌的互作研究进行系统综述,并对炭疽菌的致病机理和苹果抗病基因等研究前景进行了展望.     

柑橘黄龙病菌亚洲种分子检测引物评价及绝对定量PCR体系优化

柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害, 目前没有可用的有效药剂和抗病品种, 分子检测对黄龙病有效防控至关重要。本研究对国内外常用的常规PCR和巢式PCR检测引物进行评价, 针对多拷贝的nrdB和16S rDNA基因, 构建质粒标准品并筛选适用于绝对定量PCR的最佳质粒。结果表明, 使用Es Taq MasterMix对感染 Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas)的柑橘样品进行常规PCR检测时, 在评价的16对引物中, OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877灵敏度最高, 推荐同时使用检测黄龙病菌含量低的样品;各组巢式PCR检测引物有其适用扩增体系, 部分引物用Es Taq MasterMix扩增时出现非特异性扩增, F1/B1→F3/B3则适用Es Taq MasterMix体系, 且最高可稳定特异检出105倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-3 ng/μL）, 是灵敏度最高的引物组, OI1/OI2c→S3/S4在Es Taq MasterMix和Ex Taq DNA聚合酶体系中均可稳定特异检出104倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-2 ng/μL）, 是适用扩增体系最广的引物组;构建的5个绝对定量PCR质粒标准品中, pnrdB83扩增效率最接近100%, 且在2次重复试验中波动最小, 稳定性最强, 并且作为标准品对黄龙病待测样品进行绝对定量时, 各样品在2次重复试验中的拷贝数差值最小, 是本研究筛选的最佳质粒。本研究的结果将为柑橘黄龙病菌的定性和定量分子检测提供参考。     

LncRNA在柑橘木虱与黄龙病病原菌互作中的差异表达分析及验证

为明确柑橘黄龙病的唯一自然传播媒介——柑橘木虱Diaphorina citri的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是否参与调控黄龙病病原菌Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)的侵染及复制,采用生物信息学预测及PCR扩增方法进行lncRNA的预测、特征分析、验证及差异表达分析。结果显示,柑橘木虱的13个转录组RNA-Seq数据中共有10 192个lncRNA基因,对应15 747条lncRNA转录本;与蛋白质编码基因相比,柑橘木虱lncRNA具有更少的外显子数量和更短的转录本长度;随机选取的10条lncRNA基因中,有7条lncRNA基因在无菌柑橘木虱广州品系或赣州品系中有表达,其中1条lncRNA基因TCONS_00034665在无菌广州品系和无菌赣州品系中存在差异表达;带菌和无菌柑橘木虱成虫中预测获得2个差异表达的lncRNA基因TCONS_00096118和TCONS_00234564,实时荧光定量PCR验证发现TCONS_00234564与预测结果一致,在带菌柑橘木虱成虫中高表达。表明lncRNA参与了黄龙病病原菌与寄主柑橘木虱的互作。     

亚洲梨黑星病菌致病性及其寄主抗病机制的研究进展

梨黑星病是亚洲梨的主要病害之一。该病是由纳雪黑星病菌(Venturia nashicola)感染所致。V.nashicola主要寄生在亚洲梨叶片表皮细胞壁的果胶质层中。该菌的感染可能主要与分泌的细胞外分泌物质、角质分解酶、过氧化氢和果胶质分解酶有关。而亚洲梨对V.nashicola的抗性可能主要与多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白、多种病程相关蛋白、富亮氨酸重复类受体蛋白激酶等有关。另外,不具直接杀菌能力的系统抗性诱导剂acibenzolar-S-methyl(ASM)在大田试验中对梨黑星病菌有较好控制效果。这与ASM诱导的植物防御反应,包括多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白和几丁质酶等有关。     

马铃薯与致病疫霉互作研究进展与展望

马铃薯是重要的粮食作物, 由致病疫霉侵染引发的晚疫病长期严重制约马铃薯产业的健康发展, 因此, 国内外均将马铃薯晚疫病列为重大病害。目前, 抗病品种选育栽培、晚疫病预测预报和化学防治等相结合的晚疫病综合防治手段已得到普遍推广, 但晚疫病局部大流行在全世界范围内仍时有发生, 给粮食安全和生态安全带来巨大挑战。本文回顾了我国晚疫病的部分研究历史, 集中关注致病疫霉与寄主的互作机制领域, 梳理了近年来关于致病疫霉侵入机理、效应蛋白毒力功能、病原菌变异规律、马铃薯抗病机理等方面的重要研究结果并展望未来主要的研究方向, 以期为晚疫病基础研究和防治技术革新提供参考。     

柑橘黄龙病菌过氧化物还原酶基因CLasPrx的克隆及功能分析

为解析柑橘黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）逃逸活性氧伤害的机理,通过克隆其过氧化物还原酶（peroxiredoxin,Prx）编码基因的全长序列,对CLasPrx蛋白序列进行生物信息学分析、多重比对及系统发育分析,采用实时荧光定量PCR方法检测CLasPrx基因在柑橘不同组织中的表达模式,并在本氏烟Nicotiana benthamiana叶肉细胞瞬时表达CLasPrx分析其编码蛋白的亚细胞定位,利用碘化钾法测定 CLasPrx 蛋白清除 H₂O₂的活性。结果显示,克隆得到的CLasPrx基因序列全长为534 bp,编码177个氨基酸;CLasPrx蛋白包含1个Redoxin保守结构域;多重比对分析发现CLasPrx蛋白活性位点含有保守基序PGAFTPTC;系统发育分析表明CLasPrx蛋白与近缘物种的同源蛋白聚为一类;CLasPrx基因在感染黄龙病柑橘树秋梢中的表达水平显著高于在春梢中的表达水平;CLasPrx定位于本氏烟叶肉细胞的细胞质基质中;过表达CLasPrx蛋白能够显著降低本氏烟叶肉细胞内H₂O₂的含量。表明CLasPrx可能参与柑橘黄龙病菌清除H₂O₂的过程。