犬细小病毒YBYJ株NS1基因的克隆及序列分析

为了克隆YBYJ株犬细小病毒(CPV)NS1基因,并对其进行序列分析,试验选择Gen Bank中的CPV-NS1基因(登录号为NC_001539)序列设计1对特异性引物,以延边大学预防兽医学实验室分离的CPV YBYJ株为毒株,经PCR扩增得到NS1基因,将其克隆至p MD18-T simple载体,然后进行基因测序和序列分析。结果表明:YBYJ株CPV-NS1基因大小为2 007 bp,编码668个氨基酸,与国内外其他10株CPV-NS1基因的核苷酸同源性为98.0%~99.7%,氨基酸同源性为96.7%~99.7%。提示CPV-NS1基因变异较小,遗传进化相对稳定。     

布鲁氏菌内蒙古分离株omp31基因的克隆与序列分析

对三株布鲁氏菌内蒙古分离株的omp31基因进行克隆与序列分析.参照GenBank中布鲁氏菌的omp31基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增布鲁氏菌omp31基因,对PCR产物进行克隆、测序,将测定序列拼接后与GenBank中获得的参考毒株omp31基因序列进行了比较.结果显示,三株布鲁氏菌分离株的omp31基因开放阅读框核苷酸序列同源性均为100.0%;与Brucella ceti B14/94、Brucella neotomae 5K33、Brucella suis 1330三个参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性最高,为100.0%;与Brucella canis RM6/66、Brucella melitensis 183、Brucella melitensis 16M三个参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性为99.9%;与Brucella melitensis Rev1参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性为99.6%;与Brucella ovis ATCC 25840参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性最低,为98.8%.     

犬细小病毒新2b型分离株的分离鉴定

为了更好的了解我国东北地区犬细小病毒的流行情况,采用F81细胞从来自长春某宠物医院疑似患有肠炎的犬粪便样品中分离出1株病毒,经形态学、血清学、动物回归试验和分子生物学鉴定,分离的病毒为犬细小病毒new CPV-2b型,命名为CPV JL13-1。对该病毒主要结构蛋白VP2基因进行克隆测序和基因进化分析表明,CPV JL13-1分离株VP2基因与GenBank上提交的其他41株犬细小病毒株核苷酸和氨基酸均有较高的同源性,分别为98.6%~99.5%和97.6%~99.5%,其中核苷酸和氨基酸同源性最高的均为B-2004株。本研究为犬细小病毒分子流行病学调查和疫苗的研究奠定基础。     

犬细小病毒山东流行株分离鉴定及其全基因组测序分析

为了解山东地区犬细小病毒的流行及其变异情况,应用F81细胞从山东地区送检的发病犬粪便中分离出4株细小病毒,根据PCR和电镜技术对其进行鉴定,并对分离株的全基因组进行克隆测序与序列分析。结果表明:所分离到的4株病毒均能在F81细胞上产生明显的细胞病变,经PCR及电镜观察鉴定为犬细小病毒,分别命名为QN1/QN2/QN3/QN4株。全基因组分析结果显示,除QN3株的基因组全长为4 756 nt外,其余3株均为4 757 nt;4个分离株之间全序列核苷酸同源性为99.31%,与GenBank登录的10株具有代表性的CPV核苷酸序列比对,同源性为98.2%⁹9.9%;VP2基因的核苷酸序列同源性为98.5%99.9%;VP2基因的核苷酸序列同源性为98.5%⁹9.9%,氨基酸序列同源性为98.1%99.9%,氨基酸序列同源性为98.1%¹00%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,同属于NewCPV-2a亚型。     

猫细小病毒NS部分基因的克隆及序列分析

将疫苗用猫细小病毒(FPV)株提取基因组DNA,针对NS特定片段设计引物,利用PCR扩增出了部分基因并将该基因克隆到pMD18-T Vector中测序.结果表明,该基因长613bp,编码204个氨基酸.分离株基因与犬的细小病毒(CPV)、貂的细小病毒(MEV)毒株核苷酸同源性均为99%.氨基酸同源性达到97%、98%以上,与犬、貂的肠炎病毒有密切的亲缘关系.     

犬细小病毒山东分离株VP2基因的克隆与遗传变异分析

为了解山东省犬细小病毒(CPV)流行毒株的遗传变异情况及其与犬细小病毒病的分子流行病学关系,对2013年分离到的12株山东CPV流行毒株进行了VP2基因克隆测序与同源性分析,绘制系统进化树。结果表明,获得的VP2基因的全长为1 755 bp,编码584个氨基酸残基;各分离毒株之间的核苷酸和氨基酸同源率分别为98.9%~100.0%和98.8%~100.0%,与Gen Bank公布的国内外参考毒株核苷酸和氨基酸同源率在98%以上,分离株VP2基因及其推导的氨基酸的变异主要以点突变为主,关键氨基酸位点未见明显改变。遗传进化分析显示,有8株为New CPV-2a,4株为New CPV-2b,表明目前山东省所流行的CPV主要以New CPV-2a亚型为主。研究结果为山东犬细小病毒病的防控提供了依据。     

新城疫病毒TL1株P基因的克隆及序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒P基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR技术对新城疫病毒内蒙古分离株TL1的P基因进行了扩增。将扩增产物提纯后克隆入pGEM-Teasy载体,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确。测序拼接得出P基因的序列长度为1248bp,该基因的ORF总长为1188bp,编码395个氨基酸。与GenBank下载的12株参考毒株比较P基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株核苷酸的同源性为99.8%,氨基酸的同源性为99.2%;与鹅源新城疫ZJ1株核苷酸的同源性为96.1%,氨基酸的同源性为95.5%,说明TL1株和与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株的同源性极高,它们三者亲缘关系较近,同属于基因VII型新城疫病毒。而与传统疫苗株LaSota核苷酸的同源性为83.4%,氨基酸的同源性81.8%,说明该毒株相对于经典的NDV在P基因上已发生了较大的变异。     

猫细小病毒CC-1株NS1全基因的克隆及序列分析

根据GenBank中收录的猫细小病毒(FPV)CU-4株基因序列设计引物,扩增本实验室分离保存的FPV CC-1株NS1基因,并进行序列测定。结果表明,该毒株NS1基因序列长度约为2.35 kb,该基因的阅读框总长为2007 bp,编码668个氨基酸。该序列与FPV193/70株、PLI-IV株、TU-2株、CU-4株、94-1株和X J-1株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.0%、98.9%、98.8%、98.7%、98.6%、99.4%,氨基酸的同源性分别为98.8%、98.7%、98.5%、98.7%、98.5%、99.3%。该毒株与犬细小病毒(CPV)、貂细小病毒(MEM)、大鼠细小病毒(RPV)、猪细小病毒(PPV)、鹅细小病毒(GPV)、鼠细小病毒(MVM)NS1的进化树分析表明,它与MEM和CPV的亲缘关系比较近,与PPV的亲缘关系较远。     

犬细小病毒北京分离株VP2基因克隆及变异分析

对北京昌平地区分离的9株犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)进行VP2基因克隆测序,并利用生物信息学软件,将克隆的VP2基因与GenBank公布的国内外部分毒株序列相比较,绘制系统进化树,分析9株CPV VP2蛋白亲水性和抗原指数.结果表明,分离毒株与参考毒株核苷酸和氨基酸同源率在97%以上.通过序列比对与分析,确定其中有8株为New CPV-2a,1株为CPV-2,表明该地区目前主要以New CPV-2a流行为主.9株分离株在进化树上都能找到亲缘关系较近的毒株,没有形成新的分支.9株VP2蛋白亲水性高的区域抗原指数相应就高,不同株之间总体差别很小,主峰相同.     

鸽源Ⅰ型禽副黏病毒HN基因序列测定和分析

以分离自云南省的一株鸽源禽I型副黏病毒YN-P1株的基因组RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出HN基因片段,然后将其克隆至T载体中。经PCR鉴定后,对阳性克隆进行核苷酸序列测定。测序后拼接得出HN基因的全序列。测序结果显示,YNP1毒株HN基因为1 716 nt。通过与参考毒株比较HN基因序列,发现所研究毒株YN-P1与TW95核苷酸序列同源性最高为88.3％;与ZJ1／Go氨基酸序列同源性最高为91.6％。     

鸡传染性支气管炎病毒GZ株的分离鉴定及3CL~(pro)基因片段序列分析

从福建某鸡场发病鸡的气管和肾脏组织中分离到1株病毒,通过病毒对SPF鸡胚的致病性特征、血凝特性、电镜观察及RT-PCR鉴定等方面的研究,证实该病毒为鸡传染性支气管炎病毒(IBV),并命名为GZ毒株。通过RT-PCR对该毒株的3CLpro基因片段进行扩增,随后进行克隆与测序。该序列与参考毒株的核苷酸序列分析显示,GZ株的3CLpro基因片段与参考毒株的同源性为85.9%~98.5%,与Beaudette毒株核苷酸序列同源性最高(98.5%),而与H120株同源性为89.7%,与LX4株同源性最低(85.9%)。遗传演化分析显示,GZ分离株与参考株可以划分为3个群,GZ分离株与Beaudette毒株处于同一分支,而与LX4、BJ及Massachusetts毒株亲缘关系较远。     

福建省羊传染性脓疱病毒F1L、B2L和VIR基因的遗传变异分析

为探明2014年-2015年在福建省流行的羊传染性脓疱病毒(ORFV)遗传变异情况,对10株ORFV流行毒株的F1L、B2L和VIR基因进行克隆、测序及分析。结果表明,10株ORFV F1L基因之间的核苷酸序列同源性为97.6%~100%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.8%~99.7%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.3%~97.1%;同NZ2参考株比较,FJ-YT2014缺失2个氨基酸;10株ORFV B2L基因之间核苷酸序列同源性为97.5%~99.9%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.7%~99.5%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.7%~97.7%;10株ORFV VIR基因之间的核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,与国内株的核苷酸序列同源性为94.6%~99.6%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为94.6%~96.4%。基于基因核苷酸序列的遗传进化分析表明,10株ORFV F1L基因与福建省分离株、山西株和新疆株亲缘关系较近;10株ORFV B2L基因与新疆、山西、德国毒株亲缘关系较近;10株ORFV VIR基因与台湾、新疆株亲缘关系较近。结果提示,当前福建省流行的ORFV F1L、B2L和VIR基因尚未出现明显变异,但是其F1L、B2L和VIR基因核苷酸序列之间普遍存在异质性。     

H9N2禽流感病毒分离株NS基因同源性分析

经RT-PCR扩增了三株国内H9N2亚型禽流感病毒(ATV)分离株的非结构(NS)蛋白基因,并把扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体中测序,获得了NS1和NS2蛋白的完整编码序列.经与GenBank中发表的核苷酸序列比较表明,这三株病毒的NS基因之间的同源性为96%～98%;与1994年以来香港、韩国H9N2亚型分离株NS基因的同源性均在90%以上;其NSI蛋白的C-末端都缺失13个氨基酸,不同于香港分离株;在AIV NS基因系统发育进化树中,三者都处于等位基因A类的亚洲禽-猪群分枝.     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.     

犬细小病毒北京分离株的鉴定及其全基因组序列分析

首先对疑似犬细小病毒(CPV)感染的病犬粪便进行特异性PCR扩增,经目的片段测序分析,初步证明为CPV感染。将该病犬粪便处理物接种F81细胞,自第3代起,细胞出现典型CPE。对该株病毒进行电镜观察、理化特性试验、HA-HI及基因型等方面鉴定,证明该分离株为CPV,命名为CPV/BJ-L1株。该分离株的血凝效价为1∶512,其血凝性能被特异性抗体抑制;Reed-Muench法测定分离株病毒TCID_(50)为10-5.15/0.1 mL;电镜观察可见25nm左右的病毒颗粒;动物回归试验显示,攻毒犬能复制出CPV的典型临床症状和病理变化;对分离株的全基因组(包含两端完整的发夹结构序列)进行克隆、测序与分析。结果表明,BJ-L1为CPV-2a亚型,与GenBank中的21株CPV全基因序列核苷酸同源性为98.8%~99.8%,且与国内近期分离毒株高度同源。对2006-2014年北京市CPV分离株VP2基因进行序列分析,结果显示,CPV流行株的变异具有某种时间相关性。     

禽呼肠孤病毒分离株δ3蛋白基因克隆及序列分析

本研究将禽呼肠孤病毒广西两分离株R1、R2和美国分离株Iso1 S1基因中编码σ3蛋白的基因片段进行克隆和鉴定.对克隆片段测序后与参考株S1133、1733、138、176毒株的S1基因相应序列进行比较分析.结果表明,广西分离株R1、R2与美国分离株Iso1以及S1133、1733、176毒株的核苷酸和推导氨基酸的同源性均在95%以上,上参考株138的同源性在81%～85%之间.由此可见,除了与138参考株外,广西分离株R1、R2和美国分离株Iso1与其他比较的毒株的S1基因上存在很大的相关性.     

鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因的分子特征

本研究于2011年8月从山东省某鸡场鸡群中分离一株病毒,通过对分离株进行病毒致鸡胚矮小化试验、RT-PCR、动物回归试验等方法证实分离到鸡传染性支气管炎病毒(AIBV),命名为SDLVS株。根据GenBank上发表的AIBV的S1基因序列,用Oligo6.0设计引物,对分离株SDLVS株S1基因进行序列扩增,测序及序列分析。将分离的AIBV毒株与中国常用疫苗毒株、其他血清型参考毒株分别进行核苷酸和氨基酸系统发生进化关系分析。SDLVS S1基因由1611个核苷酸组成,编码含537个氨基酸残基的多肽。SDLVS株与55株参考毒株的同源性比较,核苷酸同源性在72.4%～99.6%之间,推导氨基酸序列同源性在71.2%～99.3%之间。从进化树分析中SDLVS株与Mass型参考毒株核苷酸同源性最高,特别是与H120核苷酸同源性最高为99.6%,进化亲缘关系最近,提示这2株毒株的存在可能与长期使用Mass血清型AIBV疫苗,从而产生疫苗的免疫压力有关。     

鹅副粘病毒NA-1分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株NA-1经11日龄鸡胚增殖后纯化.提取病毒的基因组RNA,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1.7kb大小相符合的特异条带.将扩增产物提纯后克隆入pMD 18-T载体,经纯化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1 740bp,该基因的ORF总长为1 716 bp,编码571个氨基酸.与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列,发现所测NA-1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为97.3%,与F48E9同源性为84.5%,与La Sota为82.2%.同源性分析表明NA-1相对于NDV在HN基因上发生了较大的变异.     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株膜蛋白基因的克隆及序列分析

本研究选取有代表意义的9株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）国内分离株．利用所设计的一对特异引物，通过RT—PCR的方法成功地扩增了膜蛋白基因即M基因全长片段．通过克隆、序列测定获得了9个分离毒株M基因的全长核苷酸序列。并将各IBV国内分离株与GenBank中注册的一些毒株的M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较、系统进化关系分析发现：IBV中国地方分离毒株大部分属于Mass型；不同毒株间存着重组、缺失、插入及点突变等变异，从ATG至第150bp区段的核苷酸序列变异频率最高；IBV中国地方分离株M基因的变异属于高频率的同义突变；国内的IBV分离株分为两个基因群，1群分离毒株与GenBank中Mass型的毒株亲缘关系较近．毒株间核苷酸序列同源性为95．7%～100％，其相应的氨基酸序列同源性为98．2%～100%；Ⅱ群分离毒株与众多参考毒株的亲缘关系都比较远，毒株间彼此核苷酸序列同源性为89．7％～91．9%，氮基酸序列同源性为92．0-96．0%。     

广西狂犬病野毒株L基因3'端的多态性分析

为了解狂犬病病毒(RV)的变异情况,本研究对广西不同地区的22个RV分离株的L基因3'端片段进行克隆和测序,与国内外发表的RV街毒、固定毒株及类RV株相应部分的多态性进行了比较分析.结果表明.所测定的22个广西RV野毒分离株属于基因I型,可分为3个群即I群、Ⅱ群和Ⅲ群.其中13株属于I群,其核苷酸同源性为96.9%～100.0%,氨基酸同源性为98.2%～100.0%;8株属于Ⅱ群,株核苷酸同源性为96.5%～99.7%.氨基酸同源性为97.8%～100.0%.仅1株属于Ⅲ群.22个RV分离株与RV固定毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为79.5%～86.9%和85.8%～96.5%,与类RV核苷酸和氨基酸的同源性分别为65.7%～70.3%和70.4%～76.5%.