TRV介导的E3泛素连接酶基因NbE3R14沉默对烟草基础免疫及南方根结线虫寄生的影响

[目的]本文旨在研究E3泛素连接酶基因的沉默对植物基础免疫及线虫寄生的影响,为揭示植物寄生线虫侵染寄主的分子机制提供理论依据。[方法]利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术(VIGS)沉默本氏烟E3泛素连接酶基因NbE3R14,用flg22处理基因沉默烟草叶片,RT-qPCR检测PTI(病原相关分子模式触发免疫,PAMPs-triggered immunity)相关基因的表达水平;接种辣椒疫霉于基因沉默烟草叶片,观察叶片病斑症状;采用室内人工接种法测定靶基因的沉默对南方根结线虫寄生的影响。[结果]RT-qPCR检测显示:农杆菌转化的烟草植株中NbE3R14基因已被成功沉默,flg22处理基因沉默烟草叶片激发的PTI相关基因GRAS2、WRKY7及WRKY8表达量分别下降41.3%、63.9%及61.8%,与野生型对照(WT)相比均有显著性差异(P0.05);接种辣椒疫霉36 h后,TRV∷NbE3R14处理烟草叶片的病斑比WT增大28.5%;南方根结线虫在TRV∷NbE3R14处理植株上产生的根结数、雌虫数及卵块数与WT相比分别显著增加22.1%、27.4%和17.2%(P0.05),单卵块卵量则没有差异;而在TRV∷GFP处理植株上产生的根结数、雌虫数、卵块数以及单卵块卵量与WT均无明显差异。[结论]沉默NbE3R14基因能干扰植物基础免疫,从而导致烟草对辣椒疫霉及南方根结线虫的侵染更为感病。     

沉默氧增强蛋白(OEE2)对辣椒疫霉效应因子RxLR19781的免疫功能影响

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)是一种寄生范围广且能够产生大量RxLR效应因子来参与侵染寄主的病原卵菌。资料表明目前对多数辣椒疫霉RxLR效应因子在植物体内如何行使功能积累较少。本研究从辣椒疫霉菌中分离鉴定1个效应分子RxLR19781,为了初步明确RxLR19781的功能特性,本研究借助于烟草脆裂病毒(Tobacco rattlevirus,TRV)介导的基因沉默技术,将RxLR19781的互作蛋白基因NbOEE2在本氏烟中瞬时沉默,通过qRT-PCR验证得到NbOEE2沉默植株,在沉默后的本氏烟植株中接种RxLR19781并验证该RxLR效应因子的功能。结果表明,在NbOEE2沉默植株上,RxLR19781不抑制辣椒疫霉游动孢子侵染。本研究结果表明OEE2可有效调控RxLR19781的功能特性,为进一步深入开展辣椒疫霉效应因子RxLR19781功能机制研究奠定了基础。     

瞬时沉默乙醛脱氢酶对辣椒疫霉效应因子RxLR129113功能的影响

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)产生的效应因子RxLR129113在本氏烟上的功能之一是抑制BAX引起的细胞坏死,而且已经证实乙醛脱氢酶(ALDH)是RxLR129113的互作蛋白。为了探究乙醛脱氢酶(ALDH)是否影响Rx LR129113抑制BAX引起的细胞坏死,本研究利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术,克隆了乙醛脱氢酶(ALDH)基因片段,插入到烟草脆裂病毒载体(TRV)中,构建了pTRV-ALDH的VIGS载体,转入农杆菌侵染本氏烟后qrt-PCR验证成功沉默了ALDH基因。在沉默ALDH基因的本氏烟上瞬时表达RxLR129113,24 h接种BAX。结果表明,在NbALDH沉默植株上,RxLR129113仍然抑制BAX引起的细胞坏死。本研究结果表明RxLR129113与ALDH互作不影响其抑制BAX引起的细胞坏死,为进一步深入开展辣椒疫霉效应因子RxLR129113功能机制研究奠定了基础。     

TRV-GFP载体在麦秆菊上的应用

病毒介导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)对于研究基因功能是一种快速有效的反向遗传学工具。然而,高效的VIGS的技术却只在很少的一些植物中得到应用。为了拓展VIGS技术的应用,探明烟草脆裂病毒(Tobacco Rattle Virus,TRV)是否可以侵染麦秆菊(Helichrysum bracteatum Andr.)。利用以TRV-GFP为载体的VIGS方法成功侵染麦秆菊。由于TRV病毒载体携带有绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的编码序列,所以利用荧光显微镜和手提式紫外灯可以迅速检测到TRV-GFP标记蛋白,利用GFP荧光的检测可以筛选侵染植株。总之,本研究证实以TRV-GFP为载体的VIGS方法为麦秆菊基因功能组的研究提供一个崭新的、潜在的、有价值的工具。     

基于VIGS技术干扰病毒RNA防控烟草黄瓜花叶病毒病

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)引起的花叶病是烟草上的重要病害。本试验通过病毒诱导基因沉默技术(virus induced gene silencing, VIGS)构建靶向沉默CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP和CMV-CP的VIGS载体,测定基因沉默后CMV相对表达量、CMV病毒浓度和TRV相对表达量,并对VIGS载体对CMV的防治效果进行评价。结果表明,试验建立的VIGS载体能够有效导入烟株;沉默CMV-2a的处理CMV相对表达量最低,基因沉默效率最高,为46.25%;接种病毒30 d后CMV-2a处理的病毒浓度最低,仅为对照的72.8%,TRV载体的相对表达量显著高于其他处理;沉默CMV-2a的处理发病时间推迟,病情指数最低,防治效果最好。本研究建立的CMV-2a VIGS体系能够有效沉默外源侵入的CMV基因表达,抑制CMV在烟株内的传播,为防治烟草黄瓜花叶病毒病提供了新的思路与方法。     

沉默囊泡分选蛋白(VPS)对辣椒疫霉效应因子RxLR504功能的影响

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一种重要的病原卵菌,能产生大量的RxLR效应分子帮助病原菌定殖。前期实验证明RxLR504效应分子能够抑制INF1引发的细胞死亡,并证实囊泡分选蛋白(VPS)与其相互作用。本文借助VIGS tool在线工具设计靶标基因沉默片段;利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术(VIGS)沉默本氏烟靶标基因;提取沉默样品叶片组织RNA,构建c DNA文库;利用qRT-PCR检测靶标基因表达水平;在沉默植株叶片上表达RxLR504,24 h后接种INF1,观察病斑症状。结果表明:本氏烟中设计沉默片段长度为300 bp,构建c DNA文库质量较高;荧光定量PCR结果显示,沉默植株中靶标基因表达水平下降86.2%,与对照相比差异性显著;接种实验证明RxLR504在沉默植株与对照植株上均能抑制INF1引发的细胞死亡。RxLR504与VPS互作不影响其抑制INF1引起的细胞坏死,为进一步揭示病原物利用植物靶标基因抑制植物免疫从而促进自身寄生的机制打下基础。     

辣椒上TRV介导的番茄斑萎病毒N基因沉默体系构建及鉴定

【目的】研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)核衣壳蛋白基因(N)对辣椒抗病性的影响。【方法】以易感TSWV的辣椒湘研11为研究对象,采用同源序列克隆获得辣椒CaPDS基因和TSWV N基因;利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术构建辣椒CaPDS基因沉默载体(pTRV2-CaPDS)和TSWV N基因沉默载体(pTRV2-N),农杆菌GV3101注射接种辣椒,通过qRT-PCR检测重组载体沉默效率。【结果】湘研11接种含pTRV2-CaPDS载体菌液3周后,新叶出现白化现象,说明辣椒上的pTRV2-CaPDS沉默载体构建成功。qRT-PCR结果表明:pTRV2-N载体可高效沉默N基因,其表达量仅为6.79%±2.56%,说明沉默N基因后,湘研11不易感染TSWV。【结论】本研究成功构建了pTRV2-N沉默载体,沉默TSWV的N基因后辣椒对入侵的TSWV产生一定的抗性。     

本氏烟组蛋白H4与番茄斑驳花叶病毒外壳蛋白互作调控病毒侵染

以番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus, ToMMV)外壳蛋白(Coat protein, CP)为研究对象,通过荧光素酶互补技术(Luciferase complementation imaging assay, LCI)研究ToMMV CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内的互作情况。亚细胞共定位结果显示,ToMMV CP定位于细胞核和细胞质中,组蛋白H4定位于细胞核中,两者共定位于细胞核中。双分子荧光互补(BiFC)试验结果表明,ToMMV CP与组蛋白H4的互作位置主要在细胞核中。上述2种试验结果证明,烟草花叶病毒CP与本氏烟组蛋白H4在植物体内存在互作。采用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术沉默本氏烟烟草中的H4基因,对沉默H4基因的植株接种ToMMV,接种后第4 d,通过实时荧光定量PCR检测方法检测系统叶的病毒含量,发现病毒含量显著低于对照组,结果表明H4基因的沉默会影响ToMMV在植株中的复制,组蛋白H4可能是ToMMV侵染植株的本氏烟感病因子。病毒编码的CP可能与寄主组蛋白H4在细...     

寄主诱导的基因沉默在改良作物抗病虫性方面的应用

根据RNA干扰(RNA interference,RNAi)原理,在生物体内表达双链RNA(ds RNA)可以高效沉默生物体内基因的表达。在寄主中形成病原真菌和昆虫特异基因的小RNA会进入其体内从而产生寄主诱导的基因沉默(Host-induced gene silencing,HIGS)。病虫害对全球粮食安全构成极大的威胁,利用HIGS技术为提高农作物抗病虫性提供了有效的途径。综述了HIGS技术在提高农作物抗病虫性中的应用,总结了沉默信号在寄主与病虫间的可能的传递方式以及提出该技术存在的优缺点。     

农杆菌介导的pCB302-3载体在本氏烟中瞬时表达条件优化

以GFP为报告基因构建植物表达载体pCB302-3-GFP,采用农杆菌叶片注射法对其在本氏烟叶片中瞬时表达条件进行优化。分析基因沉默抑制子p19、菌液不同浓度以及侵染时间对GFP荧光强度的影响,结果显示,当农杆菌菌液D600为0.8~1.0并与含有p19基因的载体共注射条件下,农杆菌注射3~5d后本氏烟草叶片表现出很强的绿色荧光,实现了GFP在本氏烟草中的高效瞬时表达。     

亚硝基谷胱甘肽还原酶 GSNOR1正调控植物对疫霉菌的抗性

疫霉属（ Phytophthora）卵菌引致马铃薯晚疫病等作物灾难性病害,严重威胁作物的可持续生产。由于病菌毒性变异,导致品种抗病性丧失问题突出。因此,挖掘植物广谱和持久抗病基因,并探索其在抗病育种中的有效利用具有重要的科学意义。亚硝基谷胱甘肽还原酶1（GSNOR1）是植物氮信号通路中高度保守的关键还原酶,其参与调节r基因介导的植物抗性和非寄主抗性。然而, GSNOR1参与抗疫霉菌的免疫功能和作用机理尚不清楚。本研究中,借助拟南芥与寄生疫霉菌互作的模式体系,首先发现拟南芥T-DNA插入突变体 gsnor1-3对寄生疫霉菌呈现感病表型。进一步利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）降低烟草叶片中 GSNOR1同源基因的表达量,在此基础上,通过抗病表型分析以及一系列抗性相关功能的检测,结果表明,沉默本氏烟草 GSNOR1同源基因能够在寄生疫霉菌侵染植物的过程中削弱植物体内的活性氧（ROS）迸发、病程相关基因（PR genes）的诱导表达以及MAPK信号转导,从而增强了植物对疫霉菌的感病性。本研究揭示了植物 GSNOR1对疫霉菌具有高度保守的抗性功能,并初步解析了 GSNOR1正调控植物抗疫霉菌的作用机理,为进一步探索 GSNOR1在马铃薯抗晚疫病中的功能及其在抗病育种中的有效利用奠定了重要的理论 基础。     

马铃薯 StBI-1 基因鉴定及其抗疫霉菌的功能探索

Bax inhibitor 1(BI-1）是真核生物中高度保守的细胞死亡调节因子,在植物响应生物与非生物胁迫中扮演重要角色。为探究BI-1是否参与马铃薯响应疫霉菌侵染的免疫应答,首先以拟南芥AtBI-1蛋白序列为模板在马铃薯蛋白数据库中进行BLAST检索。通过比对分析及构建系统进化树,鉴定到与AtBI-1相似度为77.22%的马铃薯蛋白NP_001305552.1,将编码该蛋白的马铃薯基因命名为 StBI-1 ;蛋白结构预测分析表明, StBI-1 包含7个跨膜域和Bax inhibitor-1-like家族结构域。利用实时定量PCR分析 StBI-1 基因在马铃薯响应致病疫霉菌侵染过程中的表达模式,并借助农杆菌介导的烟草瞬时表达体系初步探索 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能。结果显示, StBI-1 响应致病疫霉菌侵染而诱导上调表达,尤其是在侵染后期。同时,过表达 StBI-1 可显著增强本氏烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性。综合以上结果,本研究对马铃薯 BI-1基因进行鉴定分析及克隆,并初步揭示 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能,为挖掘马铃薯抗晚疫病新型基因资源及深入解析其抗病分子机理奠定了理论基础。     

农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究

通过探究根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的烟草瞬时表达体系的影响因素,确定烟草瞬时表达的最佳条件,为目的基因的功能研究提供技术支持。利用马铃薯晚疫病抗性基因RB和致病疫霉菌效应基因Avrblb 1作为报告基因,采用农杆菌介导的注射渗透法,摸索农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定烟草高效的基因瞬时表达条件。研究结果表明:介导烟草基因瞬时表达的根癌农杆菌菌悬液适宜OD600值为0.3~0.8;在菌悬液OD600值为0.1及以上时,AGL1、GV3101和C58C1介导的报告基因瞬时表达效率相似,均引发较强的叶片坏死反应;在农杆菌菌悬液OD600值小于0.1时,AGL1介导的瞬时表达效率最高。测试的烟草品种都具备较高的瞬时表达效率,苗龄6~8周的烟草适合分析。通过测试农杆菌菌悬液OD600值和菌系(遗传背景)、烟草品种及其生长时期等因素,确定本氏烟和普通烟均可实现基因高效瞬时表达的条件。     

水稻条纹病毒安徽分离物NS3基因的克隆 及其RNA沉默抑制子功能的初步鉴定

采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒（RSV）安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%～99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%～95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。     

土壤中细菌HC5的分离鉴定及抑菌活性测定

为了筛选出对马铃薯晚疫疫霉菌（Phytophthora infestans）有较强拮抗作用的生防细菌,从马铃薯种植地的土壤中分离细菌,并通过平板对峙法,测定分离细菌对马铃薯晚疫疫霉菌的拮抗作用。经大量拮抗实验,筛选出一株细菌HC5,经形态特征观察、生理生化特性测定和16S rRNA基因序列分析,确定该菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。抑菌试验结果表明,HC5菌株对辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、黄瓜尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、马铃薯晚疫疫霉菌、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）均有一定的抑制作用,尤其对马铃薯晚疫疫霉菌的抑菌效果显著,抑菌率达89%。采用PCR方法对菌株HC5进行多种抗生素合成基因的检测,扩增到786 bp的硝吡咯菌素片段和587 bp的氢氰酸片段,表明菌株HC5能够代谢产生这两种抗生素,单一或协同发挥拮抗作用。研究表明,菌株HC5是一株具有开发潜力的生防细菌。     

大豆生育期E1、E2、E3和E4基因的研究与应用

大豆E1～E4基因作为对大豆生育期影响最大的E系列基因,与大豆品种生态类型密切相关。为总结大豆主要生育期基因E1～E4的研究进展和应用现状,促进中国大豆生育期育种模式的形成,本研究综述E1～E4基因不同变异类型、变异类型鉴定方法和调控大豆光周期机理的研究进展及大豆群体E1～E4基因型分析在大豆品种生长适应性研究中的应用,以期为大豆生育期遗传调控机理的全面深入研究提供参考,同时为适应不同生态区域的大豆遗传育种工作提供依据。     

转GhB301基因棉花抗枯萎病机理研究

为了明确棉花AP2/ERF转录因子基因GhB301在抗枯萎病中的功能,以过表达GhB301转基因棉花纯合株系（OE）与野生型对照YZ-1（WT）为材料接种枯萎病菌,研究接菌后不同棉花材料叶片中防御酶活性变化及抗病相关基因的表达差异。结果显示：接菌后0~7 d,随着接菌时间的延长,棉花叶片中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性逐渐增高,均呈先增加后降低的变化趋势,但转基因株系中酶活性提高的更快、峰值更高;接种棉花枯萎病菌24 h后,测定各材料中苯丙烷代谢途径（GhPAL5、GhC4H1、GhC3H1、GhHCT1、GhF5H2、GhCCR1）、JA/ET路径（ GhAOC1、 GhAOS1、GhEIN2、GhERF1、GhJAZ1）、SA路径（GhICS1、GhEDS1、GhPAD4、GhNPR1）、PR基因（GhPR1、GhPR2、GhPR4、GhPR5）等抗病相关基因的相对表达量,除GhERF1、GhJAZ1、GhNPR1外其余均在转基因株系中上调表达。推测在棉花中过表达GhB301基因提高了防御酶活性和抗性基因的表达,从而增强棉花对枯萎病的抗性。     

三七根际耐皂苷木霉菌的分离鉴定及其拮抗促生活性评价

为筛选出三七根际具有拮抗促生活性的耐皂苷木霉菌,通过收集一年生健康三七根际土壤进行木霉菌株的分离,并测定三七根系分泌物对木霉菌孢子萌发的影响以及皂苷对木霉菌菌丝生长的抑制效果,筛选获得耐皂苷的菌株,进一步对其分类鉴定后进行拮抗根腐病病原菌活性测定以及盆栽促生效果、根际定殖能力及其对连作障碍缓解效果的评价。结果表明:试验共分离到6株木霉菌株,其中2株对三七根系分泌物敏感性较低,经过形态学特征和ITS序列比对鉴定为绿色木霉(Trichoderma viride)T3和渐绿木霉(T. viridescens)T20。T3和T20菌株对三七主要根腐病病原菌恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)、毁灭柱孢菌(Cylindrocarpon destructans)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)和雪腐镰刀菌(Monographella cucumerina)均具有较强的拮抗效果,对恶疫霉菌抑制率分别可达到61.76%和70.59%;T3和T20菌株能促进三七植株的生长,将其接种于三七连作土中,在接种20 d后能够在根际较好的定殖,增加三七植株的存苗率,降低根腐病发病率。该研究结果为缓解三七连作障碍提供了重要的生防菌资源。     

Infection of Phytophthora capsici on pepper—Models and affecting factors

Under controlled conditions in a growth chamber, we studied the mortality of pepper seedlings caused by Phytophthora capsici. The results showed that soil temperature and soil water content were important factors affecting their infection with P. capsici and the optimum condition for infection was found to be a soil temperature of 22°C–28°C and a soil water content of 40%. The relationships of pepper seedling mortality caused by P. capsici along with soil temperature, soil water content and their interactions can be described by mathematical models. Field observations suggested that the Gompertz model was the best one for describing the epidemiological dynamics of the disease. The incidence of pepper phytophthora blight was significantly related to the initial incidence of pepper phytophthora blight, soil temperature, soil water content and air temperature. A forecasting model for pepper phytophthora blight in the field was developed. __________ Translated from Chinese Journal of Applied Ecology, 2007, 18(5): 1061–1065 [译自: 应用生态学报]     

二穗短柄草DREB1G基因表达模式分析和在拟南芥中的异源过量表达

CBF/DREB基因是一类植物特异性转录因子,通过调控下游抗逆相关基因的表达,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。为了研究新型的禾本科模式植物二穗短柄草DREB基因的功能,克隆BdDREB1G的cDNA序列,分析该基因在各种非生物胁迫条件下的表达,构建过表达载体,获得转基因拟南芥。结果表明:高温、低温和水杨酸胁迫处理显著诱导BdDREB1G的表达,暗示该基因响应高温和低温胁迫。初步观察结果说明,该与野生型拟南芥相比,转基因植株生长发育迟缓。这些为研究该基因响应非生物胁迫的功能奠定基础。