苏云金芽胞杆菌cry1Ie新基因的克隆、表达与生物活性测定

为获得新的鳞翅目害虫杀虫基因,根据已知cry1I类基因编码区设计简并引物,采用直接克隆法,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BN23-5质粒DNA为模板进行扩增,并对得到的基因进行鉴定和分析。结果表明:克隆得到一个完整的cry1Ie基因,全长2 160 bp,由719个氨基酸组成,该氨基酸序列与已知的4种Cry1Ie蛋白不同,与Cry1Ie2和Cry1Ie3的氨基酸序列同源性最高,为95.4%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为Cry1Ie5(登录号为KJ710646)。将该基因插入表达载体p ET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温诱导成功表达,SDS-PAGE电泳验证其大小为81 k D,与预测的分子量相符合。生物活性测定表明,Cry1Ie5表达的包涵体蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟具有杀虫活性,LC_(50)分别为0.43μg/m L和48.39μg/m L;对棉铃虫的致死率不高,但能明显抑制其生长;对甜菜夜蛾没有杀虫活性。     

不同条件下转cry1Ab基因玉米植株残体中杀虫蛋白降解动态

为明确转cry1Ab基因玉米植株残体中Cry1Ab杀虫蛋白在不同条件下的降解动态,选取转cry1Ab基因玉米MON810和Bt11,采用ELISA方法测定4种条件下秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的残留量。结果表明,在不同条件、不同取样时间,2种玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的残留量差异显著;整株秸秆中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度比粉碎后的慢;秸秆粉碎埋入土壤后播种冬小麦,玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度最快,且可完全降解;在不同条件下,MON810玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度比Bt11玉米慢,MON810和Bt11玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的DT50分别为10.2~207.8、13.6~124.0 d,DT90分别为185.1~368.3、45.2~224.0 d。研究表明,在不同条件下MON810和Bt11玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度不同,依次为秸秆粉碎后埋在土壤后种植冬小麦秸秆粉碎埋在玉米田土壤中秸秆粉碎后放在地表整株秸秆放在地表。     

治理昆虫对转苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白基因植物的抗性

治理昆虫对转苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白基因植物的抗性华中农业大学植保系（４３００７０）李建洪邓望喜华中农业大学生命科学院（４３００７０）喻子牛迄今为止，通过遗传工程的方法，已获得了４０多种表达苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白（ＩＣＰＳ）毒素的植物。美国ＥＰＡ于...     

转cry1Ab/cry2Aj玉米对亚洲玉米螟的抗性评价

为探讨转cry1Ab/cry2Aj玉米对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)的抗性,采用室内生测和田间人工接虫鉴定方法评价了6个转cry1Ab/cry2Aj玉米品系对亚洲玉米螟的杀虫效果,并利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了Cry1Ab蛋白在各品系主要组织的表达水平.结果显示,亚洲玉米螟幼虫取食转基因玉米各品系雄穗、苞叶、花丝和雌穗48 h后死亡率在90％左右,取食心叶的死亡率在70％左右,96h后大部分幼虫死亡,而取食非转基因玉米的死亡率为3.3％～8.7％;春播和夏播田转基因玉米叶片、茎秆、雌穗基本没有被害,而对照玉米叶片、茎秆、雌穗被害严重,春播和夏播玉米平均每株分别有2.9、2.3头幼虫和蛹,2.8、3.4个蛀孔,隧道长度为7.5、14.2 cm,雌穗被害级别为5.3和5.1;6个转基因玉米品系中Cry1Ab蛋白在心叶、雄穗、花丝、苞叶和雌穗中稳定表达.综合评价认为,转基因玉米各品系在整个生育期内对亚洲玉米螟有很好的抗性,其中N50品系抗虫效果最佳,可以作为抗虫转多基因玉米育种的备选材料.     

转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因抗虫耐除草剂玉米的田间抗性评价

为明确转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因的抗虫耐除草剂玉米的抗虫性和对除草剂的耐受性,本文通过田间人工接虫,以食叶级别、存活幼虫数、蛀孔数、隧道长度和雌穗被害级别等分别作为评价玉米心叶期和穗期的抗虫性标准,评价了转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因,具有抗虫耐除草剂复合性状的玉米品种‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’及同型非转基因‘ND6708’、‘ND6515’和当地‘郑单958’品种对亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫的抗虫效果;通过喷施除草剂后调查玉米植株的存活率,评价上述品种对除草剂的耐受性。田间试验结果表明:‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’两个转基因玉米品种对亚洲玉米螟、黏虫及棉铃虫的抗性水平均为高抗,且在4叶期和8叶期喷施草甘膦后其受害率均为0,而同型对照品种和当地对照品种喷施同剂量草甘膦后受害率为100%。综上,聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因,具有抗虫耐除草剂复合性状的玉米品种‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’对亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫具有较强的抗虫效果,对草甘膦具有较好的耐受性。此研究可为将来建立以转Bt基因玉米为主要手段的综合防治技术体系提供依据。     

基于聚合酶链式反应-高通量测序(PCR-HTS)联用的cry2A基因鉴定方法

cry2基因对多种鳞翅目害虫具有高毒力,且与cry1A类基因无交互抗性,具有重要的应用价值。为了提高苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)cry2杀虫基因资源的筛选和鉴定效率,本研究分析了所有已报到的cry2A基因的保守区,设计了4对通用引物,对2000株Bt菌株基因组DNA混合样品进行了PCR扩增,并利用454高通量测序仪对这些混合扩增产物进行了测序。测序总量有280704条Reads,序列分析结果表明,这些Bt菌株中含有已知的所有9类cry2类基因,其中包括cry2Ae和cry2Ai这2类在国内Bt菌株中未见报道的基因;同时,发现了新型cry2类基因的片段;随后设计特异性引物,扩增获得了半长基因片段cry2-1和cry2-2,进一步利用重叠PCR法获得了全长新基因cry2X,该基因的编码区为1902 bp,编码633个氨基酸;其氨基酸序列与Cry2Ab13蛋白的相似性最高,为93%,属于第三等级的模式基因。建立聚合酶链式反应-高通量测序(polymerase chain reaction-high throughput sequencing,PCR-HTS)联用的基因鉴定方法,具有快速、灵敏、准确、高通量、覆盖范围广等优点,不仅可以对Bt菌株中已知杀虫基因进行鉴定,而且能够发现新的基因,将在Bt基因鉴定、发掘中发挥重要的作用。     

生防菌株ZA1的GFP基因标记及其功能稳定性测定

为明确生防莫海威芽胞杆菌Bacillus mojavensis菌株ZA1在作物体内定殖与作物和病原物的作用机理,运用电击转化法将绿色荧光蛋白表达载体pGFP78导入菌株ZA1体内,并采用细菌培养法、继代培养法和平板抑制法检测其功能稳定性。结果表明,质粒pGFP78成功导入菌株ZA1,标记后菌株ZA1-gfp经形态学和分子生物学验证均证明菌株ZA1已成功标记,标记菌株ZA1-gfp与菌株ZA1形态一致,在荧光显微镜下呈现明亮的绿色,并且能够提取导入质粒pGFP78,扩展出质粒所携带的启动子78序列。功能稳定性鉴定结果表明,标记菌株ZA1-gfp遗传稳定性达100%;与菌株ZA1的生长速率差异不显著,且不影响菌株的运动性;菌株ZA1对马铃薯枯萎病菌、马铃薯炭疽病菌和马铃薯坏疽病菌的抑制率分别为64.50%、68.35%和66.55%,标记菌株ZA1-gfp对3种病原真菌的抑制率分别为67.46%、76.56%和66.75%,表明外源质粒的导入,不影响菌株的抑菌能力。     

对蛴螬有活性的苏云金芽胞杆菌菌株的筛选与基因鉴定

为了寻找对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因资源,以实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株为材料,通过杀虫活性测定筛选到43株对蛴螬有活性的菌株,其中菌株C9对3种供试昆虫均有活性.光学及扫描电镜检测发现这些菌株均释放球形晶体.SDS-PAGE分析显示这些菌株均表达约130kD的蛋白.采用3种方法分析43株菌株的杀虫晶体蛋白基因类型,结果显示:其中21株只含cry8Ca;13株同时含cry8Ca和cry8Ea基因;QC4等8株菌株只能用引物HRM8F/HRM8R获得高度保守区域约110bp的扩增产物,说明这些基因的5'端序列与已知基因差异较大.测序结果经BLAST分析显示,产物序列同cry8基因的相似性均在98%以上,但其全长基因类型还需要其它方法确定.菌株QCM的PCR-RFLF图谱不同于已发现的cry8基因,推测其中含有新基因.     

四川盆地部分地区土壤中苏云金芽胞杆菌分离与cry基因鉴定*

［目的］ 对四川盆地土壤中Bt资源进行研究,了解其分布特点,为我国苏云金芽胞杆菌的储备奠定基础。［方法］ 从四川盆地5个地区采集土样,分离苏云金芽胞杆菌野生菌株。利用PCR RFLP及SDS PAGE方法对Bt分离株进行基因型鉴定和蛋白分析,并对其室内杀虫活性进行初步测定。［结果］ 从207份土样中获得26株苏云金芽胞杆菌野生菌株,出菌率为12.56%。油镜观察可看到球形、方形、菱形及不规则形的伴胞晶体。在21株Bt分离株中检测到cry1、cry1I、cry2、cry9四类基因,且多数菌株都是同时含有多个基因类型,有5株Bt分离株未发现已知基因;SDS-PAGE显示有9株菌株只表达了130 ku的蛋白, 2株只表达了124 ku的蛋白,2株只表达了45 ku的蛋白,6株同时表达了130 ku和60 ku的蛋白, 4株同时表达了124 ku和60 ku的蛋白, 2株同时表达了135 ku和60 ku的蛋白, 1株同时表达了130、90 ku及75 ku的蛋白。毒力测定结果表明：9株菌株对小菜蛾具有高毒力,2株对大猿叶虫有一定的杀虫活性。［结论］四川盆地土壤中Bt资源多样性丰富,其中有2株有一定的研究前景。     

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号对田间稻纵卷叶螟和二化螟及其捕食性天敌的影响

为研究转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号对稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis和二化螟Chilo suppressalis及其捕食性天敌的影响,采用剥查法和吸虫法,于2012—2013年在江西省南昌县调查了赣绿1号田间稻纵卷叶螟与二化螟的发生为害情况及其捕食性天敌拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata和拟水狼蛛Pirata subpiraricus的种群动态。结果表明,与非转基因亲本9311水稻相比,在2012和2013年螟虫为害高峰期,赣绿1号田间稻纵卷叶螟百株虫量分别减少57.78头和27.78头,卷叶率分别降低20.46%和6.50%;二化螟百株虫量分别减少24.44头和152.22头,枯心/白穗率分别降低13.02%和14.20%。此外,赣绿1号与9311水稻田间拟环纹豹蛛和拟水狼蛛的种群动态趋势基本一致。研究表明,转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号能有效控制稻纵卷叶螟和二化螟,而对其捕食性天敌拟环纹豹蛛和拟水狼蛛无显著影响。     

转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗虫性评价

为评估转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)和斜纹夜蛾Prodenia litura(Fabricius)的抗虫性,在室内测定了3个转cry1Ab/cry2Aj玉米品系和1个转cry1Ab/vip3DA玉米品系对3种害虫幼虫存活和生长发育的影响,研究了该系列Bt玉米不同组织器官对害虫的杀虫活性和控制效果。结果显示,棉铃虫初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片96h后死亡率为87.50%~90.00%,取食花丝和雌穗的幼虫96h后几乎全部死亡;甜菜夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗168h后死亡率为22.50%~68.33%,幼虫的生长发育受到明显抑制,体重抑制率达85.00%~95.00%;斜纹夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗96 h后死亡率显著高于非转基因亲本对照,168h后幼虫死亡率达90.00%以上。研究表明,转cry1Ab/cry2Aj和cry1Ab/vip3DA玉米品系对棉铃虫和斜纹夜蛾的初孵幼虫表现出较好的抗性,可以作为转多基因抗虫玉米育种的备选材料。     

转cry1Ac玉米对亚洲玉米螟的抗性评价

目标性状的有效性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价研究的重要内容之一。采用酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、室内生测和田间人工接虫鉴定研究了转cry1Ac玉米纯合群体BT-X和分离群体BT-38、BT-181、BT-43、BT-105等转化事件Cry1Ac蛋白的表达量以及对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）的室内杀虫和田间抗虫效果。转cry1Ac玉米鲜组织中Cry1Ac蛋白含量在44.07～438.00 ng/g之间,不同转化事件及不同组织之间差异显著,其中BT-X鲜花丝中Bt蛋白表达量显著低于未展开心叶。室内生测试验中除BT-43与对照没有显著差异外,取食其它转基因玉米心叶的亚洲玉米螟初孵幼虫6或7天的存活率为0～15.3%,显著低于非转基因对照;取食夏播BT-X鲜花丝6天的幼虫存活率为62.5%,显著低于Bt11及非转基因对照。田间心叶期接虫鉴定显示BT-X高抗亚洲玉米螟。说明转cry1Ac玉米BT-X、BT-181、BT-38和BT-105对亚洲玉米螟有很高的杀虫作用,BT-X田间抗虫效果良好。     

甘蔗间作玉米对亚洲玉米螟发生为害的控制作用

为明确甘蔗间作玉米对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)发生和为害的控制作用,于2012—2013年在云南省元江县甘蔗种植区设置甘蔗间作玉米小区,采用目测法和马氏网法系统调查了该生境下亚洲玉米螟卵块密度与卵粒密度、蛀孔密度与百秆虫量、寄生性天敌昆虫种类及其种群动态。结果表明:与甘蔗间作种植的玉米上亚洲玉米螟落卵量、蛀孔密度、百秆虫量均明显低于单作玉米田,2012和2013年,间作玉米上百株卵块数比单作玉米分别减少了29.32%和35.73%,每卵块所含的卵粒数分别减少了34.22%和51.02%,百秆玉米蛀孔数分别减少了42.53%和31.25%,百秆虫量分别降低了58.18%和52.73%。间作田中亚洲玉米螟的3种主要寄生蜂螟蛉绒茧蜂Apanteles ruficrus、黄眶离缘姬蜂Trathala flavoorbitalis和大螟钝唇姬蜂Eriborus terebrans的种群密度显著高于单作玉米田,而数量较少的广大腿小蜂Brachymeria lasus及广黑点瘤姬蜂Xanthopimpla punctata种群密度在间作与单作田间无显著差异。表明甘蔗间作玉米对亚洲玉米螟的发生为害具有明显的控制作用,可用于亚洲玉米螟的生态控制。     

粘虫生物钟timeless基因的克隆及时空和昼夜表达分析

为明确生物钟timeless基因对粘虫Mythimna separata迁飞、交配等周期性活动的调节作用,利用PCR技术克隆了粘虫timeless基因,命名为Mstim,采用生物信息方法分析其序列特征,使用实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同发育阶段、组织及昼夜的表达特征。结果表明,Mstim的c DNA全长为3 132 bp,编码1 043个氨基酸,其预测的蛋白质Ms TIM分子量为117 k D,等电点5.14,具有timeless保守的PIS、NLS等结构域,与甜菜夜蛾Spodoptera exigua及棉铃虫Helicoverpa armigera的氨基酸序列相似性高达97%。荧光定量PCR结果显示成虫期的Mstim表达量最高,卵期和蛹期次之,6龄幼虫的表达量最低;在雌、雄蛾中均以触角及头部中的表达量较高,飞行肌、足及生殖腺中的表达量较低。粘虫雌、雄蛾触角中Mstim的昼夜表达模式相似,均为光期表达量低于暗期,光期5 h的表达量最低,光期末期逐渐升高,至暗期后3 h达到最高值,暗期末期表达量开始下降。说明Mstim基因在粘虫中的表达不仅具有发育时期和组织的时空特异性,而且表现出明显的昼夜特性,推测其可能参与粘虫生长发育和迁飞与生殖等行为、生理节律的调节。     

转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫的抗性

为明确转Bt基因玉米对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的抗性,采用室内玉米离体组织生测法测定取食转Cry1Ab-ma基因抗虫玉米CM8101心叶、花丝和籽粒后草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫存活数量、存活幼虫的体重、蛹重、化蛹和羽化等参数,分析转Cry1Ab-ma基因抗虫玉米CM8101三种组织对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫的抗性。结果显示,转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101心叶可完全杀死草地贪夜蛾1龄幼虫,2龄幼虫有存活,存活率为10.0%,但不能化蛹与羽化;花丝可杀死大部分草地贪夜蛾1龄幼虫,存活率为3.3%,并阻断其生活史,但对2龄幼虫杀伤力弱,存活率为73.3%,存活幼虫化蛹率和羽化率分别为20.0%和13.3%;籽粒可完全杀死草地贪夜蛾1龄幼虫,2龄幼虫有存活,存活率为13.3%,有少量可化蛹,化蛹率为3.3%、有少量羽化,羽化率为3.3%。表明转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101在短期内对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫有良好的控制作用。     

两个转W23基因小麦株系的抗旱性鉴定

以两个T₅代转W23基因小麦株系G19-X59、G19-X61为材料,在水培条件下采用PEG-6000人工模拟干旱胁迫措施对转基因小麦株系的根系发育特点、抗旱相关的光合生理等指标进行了测定。结果表明,干旱胁迫条件下各参试小麦的光合速率(Pn)和蒸腾速率(Tr)均下降,转基因株系降幅较小,且其Pn和Tr值极显著高于受体品种;在正常供水和干旱胁迫两种水分处理下,转基因株系均比受体品种具有较发达的根系,其根总长、根总表面积、根总体积等参数极显著高于受体品种。这一结果说明,转W23基因小麦株系G19-X59、G19-X61在苗期依靠发达的根系维持较强的光合作用,提高其应对干旱胁迫的能力。     

蠋蝽对亚洲玉米螟幼虫的捕食作用

为明确蠋蝽Arma custos对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的捕食能力,在实验室条件下采用捕食功能反应方法测定蠋蝽5龄若虫和雌雄成虫对亚洲玉米螟4龄幼虫的捕食功能反应、搜寻效应和种内干扰效应对其自身捕食能力的影响。结果显示,蠋蝽5龄若虫和雌雄成虫对亚洲玉米螟4龄幼虫的捕食功能反应均符合HollingⅡ型圆盘方程;蠋蝽5龄若虫和雌雄成虫对亚洲玉米螟4龄幼虫的瞬间攻击率分别为0.790、0.849和0.818,处理时间分别为0.041、0.027和0.036 d,日最大捕食量分别为24.390、37.037和27.778头;随着亚洲玉米螟密度的增加,蠋蝽的搜寻效应逐渐降低,雌成虫的搜寻效应明显大于5龄若虫和雄成虫;蠋蝽5龄若虫和雌雄成虫捕食亚洲玉米螟4龄幼虫时均受到种内干扰的影响,干扰常数分别1.372、1.410和1.309。表明蠋蝽5龄若虫和雌雄成虫均对亚洲玉米螟具有较好的控害潜能,且成虫的控害潜能大于5龄若虫。