转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因抗虫耐除草剂玉米的田间抗性评价

为明确转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因的抗虫耐除草剂玉米的抗虫性和对除草剂的耐受性,本文通过田间人工接虫,以食叶级别、存活幼虫数、蛀孔数、隧道长度和雌穗被害级别等分别作为评价玉米心叶期和穗期的抗虫性标准,评价了转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因,具有抗虫耐除草剂复合性状的玉米品种‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’及同型非转基因‘ND6708’、‘ND6515’和当地‘郑单958’品种对亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫的抗虫效果;通过喷施除草剂后调查玉米植株的存活率,评价上述品种对除草剂的耐受性。田间试验结果表明:‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’两个转基因玉米品种对亚洲玉米螟、黏虫及棉铃虫的抗性水平均为高抗,且在4叶期和8叶期喷施草甘膦后其受害率均为0,而同型对照品种和当地对照品种喷施同剂量草甘膦后受害率为100%。综上,聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因,具有抗虫耐除草剂复合性状的玉米品种‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’对亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫具有较强的抗虫效果,对草甘膦具有较好的耐受性。此研究可为将来建立以转Bt基因玉米为主要手段的综合防治技术体系提供依据。     

转cry1Ac玉米对亚洲玉米螟的抗性评价

目标性状的有效性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价研究的重要内容之一。采用酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、室内生测和田间人工接虫鉴定研究了转cry1Ac玉米纯合群体BT-X和分离群体BT-38、BT-181、BT-43、BT-105等转化事件Cry1Ac蛋白的表达量以及对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）的室内杀虫和田间抗虫效果。转cry1Ac玉米鲜组织中Cry1Ac蛋白含量在44.07～438.00 ng/g之间,不同转化事件及不同组织之间差异显著,其中BT-X鲜花丝中Bt蛋白表达量显著低于未展开心叶。室内生测试验中除BT-43与对照没有显著差异外,取食其它转基因玉米心叶的亚洲玉米螟初孵幼虫6或7天的存活率为0～15.3%,显著低于非转基因对照;取食夏播BT-X鲜花丝6天的幼虫存活率为62.5%,显著低于Bt11及非转基因对照。田间心叶期接虫鉴定显示BT-X高抗亚洲玉米螟。说明转cry1Ac玉米BT-X、BT-181、BT-38和BT-105对亚洲玉米螟有很高的杀虫作用,BT-X田间抗虫效果良好。     

转cry1Ab/cry2Aj玉米对亚洲玉米螟的抗性评价

为探讨转cry1Ab/cry2Aj玉米对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)的抗性,采用室内生测和田间人工接虫鉴定方法评价了6个转cry1Ab/cry2Aj玉米品系对亚洲玉米螟的杀虫效果,并利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了Cry1Ab蛋白在各品系主要组织的表达水平.结果显示,亚洲玉米螟幼虫取食转基因玉米各品系雄穗、苞叶、花丝和雌穗48 h后死亡率在90％左右,取食心叶的死亡率在70％左右,96h后大部分幼虫死亡,而取食非转基因玉米的死亡率为3.3％～8.7％;春播和夏播田转基因玉米叶片、茎秆、雌穗基本没有被害,而对照玉米叶片、茎秆、雌穗被害严重,春播和夏播玉米平均每株分别有2.9、2.3头幼虫和蛹,2.8、3.4个蛀孔,隧道长度为7.5、14.2 cm,雌穗被害级别为5.3和5.1;6个转基因玉米品系中Cry1Ab蛋白在心叶、雄穗、花丝、苞叶和雌穗中稳定表达.综合评价认为,转基因玉米各品系在整个生育期内对亚洲玉米螟有很好的抗性,其中N50品系抗虫效果最佳,可以作为抗虫转多基因玉米育种的备选材料.     

大气CO2浓度升高对转基因玉米Bt毒素表达量的影响

大气CO_2浓度升高不仅影响植物营养化学成分的变化,还能够引起植物次生抗虫物质表达量的改变,进而影响作物-害虫的互作关系。本试验利用开顶式气室(OTC)和室内动态气室模拟当前和未来大气CO_2浓度(约390、550、750μL/L)环境,测定了不同大气CO_2浓度下普通玉米‘郑58’和转cry1Ac-m基因玉米的营养物质成分、转cry1Ac-m基因玉米Cry1Ac杀虫蛋白的含量,以及取食不同大气CO_2浓度环境下生长的‘郑58’或转cry1Ac-m基因玉米叶片的亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)初孵幼虫死亡率。结果表明,与对照相比,高大气CO_2浓度(750μL/L)环境下生长的转基因和对照玉米叶片中淀粉、可溶性糖、非结构性碳(TNC)含量及TNC∶N都明显增加,而N含量差异不显著。对照玉米叶片的N含量显著高于转基因玉米,其他营养成分没有显著变化。随着大气CO_2浓度的升高,转基因玉米的Cry1Ac蛋白表达量有下降的趋势,但各处理间差异不显著。亚洲玉米螟取食生长在不同大气CO_2浓度环境下的‘郑58’或转cry1Ac-m基因玉米叶片48h后,死亡率没有显著差异;转cry1Ac-m基因玉米具有显著的杀虫效果。     

转cry1F基因玉米花粉对腰带长体茧蜂存活和繁殖的影响

腰带长体茧蜂（Macrocentrus cingulum）是亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）幼虫的主要寄生蜂,对亚洲玉米螟种群具有重要的控制作用。玉米花粉可以作为腰带长体茧蜂的补充营养。本研究利用转cry1F基因抗虫玉米花粉作为补充食物饲喂腰带长体茧蜂寄生亚洲玉米螟幼虫,研究其对腰带长体茧蜂存活和繁殖的影响,为转基因抗虫玉米的环境安全评价提供科学依据。结果表明,饲喂转cry1F基因抗虫玉米花粉后腰带长体茧蜂的寄生率、茧块重量、每茧块茧数、羽化率与饲喂对照玉米花粉相比无显著差异;在蜂蜜水+ Bt玉米花粉处理中虽然与对照玉米花粉处理相比雌蜂的寿命并没有显著差异,但雄蜂的寿命差异显著;在取食转cry1F基因抗虫玉米花粉的腰带长体茧蜂体内未检测到Bt蛋白成分。说明转cry1F基因抗虫玉米花粉对腰带长体茧蜂的存活和繁殖没有显著影响。     

转Bt基因玉米(瑞丰125、DBN9936、DBN9978)对亚洲玉米螟的抗虫效果研究

评价转Bt基因玉米对靶标生物亚洲玉米螟的杀虫作用是转基因玉米研发的重要一环。本文采用室内生测法对3种转Bt基因抗虫玉米‘瑞丰125’(表达Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白),‘DBN9936’‘DBN9978’(表达Cry1Ab杀虫蛋白)对亚洲玉米螟敏感品系ACB-S及抗Cry1Ab品系ACB-AbR、抗Cry1Ac品系ACB-AcR、抗Cry1F品系ACB-FR、抗Cry1Ah品系ACB-AhR、抗Cry1Ie品系ACB-IeR的杀虫活性进行测定,同时采用心叶期和抽丝期人工接虫法进行田间抗虫效果鉴定。结果表明,取食3种Bt玉米的ACB-S幼虫, 3 d死亡率100%,而取食对照常规玉米3 d存活率100%。取食3种Bt玉米的5个抗性品系幼虫除ACB-AbR和ACB-AcR有2%~6%的个体存活4~5 d, 6 d死亡率也达到了100%,其余品系均在3 d全部死亡,而取食对照玉米5~6 d的死亡率仅为4%~14%,差异显著。田间心叶期食叶级别及穗期活虫数、雌穗被害和茎秆被蛀等为害等级说明3种Bt玉米高抗亚洲玉米螟。明确了‘瑞丰125’‘DBN9936’和‘DBN9978’对亚洲玉米螟有很高的杀虫活性和田间防治效果。5个Bt蛋白抗性亚洲玉米螟品系幼虫在常规玉米上显示一定的适合度劣势。     

转基因抗虫耐除草剂复合性状玉米‘双抗12-5’对亚洲玉米螟的抗性及对草甘膦的耐受性研究

通过田间接虫、室内生测以及田间植株喷施草甘膦试验,在吉林省公主岭市综合评价了转cry1Ab/cry2Aj和G10evo-epsps基因抗虫耐除草剂复合性状玉米‘双抗12-5’对亚洲玉米螟[Ostrinia furnacalis(Guenée)]的抗性以及对草甘膦的耐受性,为‘双抗12-5’在吉林省产业化应用提供基础科学数据。结果表明,与非转基因对照‘郑单958’相比,‘双抗12-5’全生育期对亚洲玉米螟都具有良好的抗性,达到高抗水平;取食‘双抗12-5’心叶、雄穗及花丝等组织7d后的亚洲玉米螟幼虫存活率为4%~12%,而取食‘郑单958’各个组织的亚洲玉米螟幼虫存活率均高于96%。‘双抗12-5’在喷施推荐剂量(1 230g/hm2)及在2倍推荐剂量(2 460g/hm2)草甘膦情况下,4周内均生长正常,受害率为0;对照‘郑单958’植株第一周即表现出明显的药害症状,逐渐枯萎死亡,受害率达到100%。综上所述,‘双抗12-5’在吉林省表现出良好的抗虫性和除草剂耐受性。     

亚洲玉米螟和黏虫幼虫取食Cry1F蛋白后的中肠组织病理变化

为了明确Cry1F杀虫蛋白对亚洲玉米螟和黏虫两种重要玉米害虫的作用机制,本文通过透射电镜观察了亚洲玉米螟和黏虫4龄幼虫取食含Cry1F蛋白人工饲料后的中肠组织病理变化,并与其取食含Cry1Ab蛋白人工饲料后的组织病理变化进行了比较。亚洲玉米螟和黏虫4龄幼虫取食Cry1F蛋白48 h后中肠杯状细胞发生了明显的病变,主要表现为：细胞微绒毛肿胀、脱落;细胞核变形,质膜和核膜界限不清晰;染色质发生固缩、贴近核膜;线粒体拉伸变形数量减少,严重的发生空泡化;内质网肿胀与断裂、数量减少,与取食含Cry1Ab蛋白人工饲料相比,玉米螟和黏虫中肠组织发生的病变程度相似。本研究可为Cry1F作为转基因玉米重要的杀虫蛋白在未来亚洲玉米螟和黏虫防治中更好地发挥作用提供理论依据。     

转Bt基因抗虫玉米对亚洲玉米螟幼虫取食行为的影响

室内研究了转cry1Ab杀虫蛋白基因的Bt抗虫玉米M ON810和Bt11对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)初孵幼虫和3龄幼虫的取食行为、取食选择性和存活率的影响。在48h的非选择性试验中,玉米螟初孵幼虫在M ON810和Bt11玉米心叶组织上的取食率随时间的增加而下降,在对照玉米上的幼虫取     

转cry1Ab基因玉米对粘虫的抗性评价

粘虫Mythimna separata(Walker)是我国玉米上的重要害虫。转Bt基因玉米为防治粘虫提供了新的途径。从室内生测和田间抗性鉴定分别研究了转cry1Ab基因抗虫玉米YieldGard对粘虫的杀虫效果。用4~7叶期转cry1Ab基因玉米心叶室内饲养1~3龄粘虫幼虫3、7和10天的死亡率分别为39.0%~92.0%、96.0%~98.0%和97.0%~100%,第14天全部死亡,而对照的死亡率分别为3.0%~8.0%、6.0%~20.0%和11.0%~28.0%,差异极显著。取食转cry1Ab基因玉米的幼虫不能正常生长发育,存活10天的幼虫其体重仅为取食对照玉米的9.0%。田间玉米4~5叶期,分别接1~6龄粘虫幼虫于转cry1Ab基因和非转基因玉米心叶。转cry1Ab基因玉米上各龄期幼虫平均存活率仅为0.0~6.7%,极显著低于非转基因玉米的8.3%~80.0%。转cry1Ab基因玉米的危害级别0.1~0.7,显著小于非转基因玉米的2.1~7.3。结果说明转cry1Ab基因玉米YieldGard对粘虫各龄幼虫有很高的杀虫作用和田间控制效果,同时能有效保护玉米免受危害。     

中国转基因抗虫玉米的商业化策略

玉米是全球播种面积最大的粮食作物,事关世界粮食安全。鳞翅目和鞘翅目害虫是影响玉米产量和品质的重要因素,长期以来多数国家采取以喷施化学农药为主的防控策略,但存在较高的使用成本和环境风险等问题。作为新一代的害虫防控技术,转基因抗虫玉米于1996年开始在美国商业化种植,并迅速推广到巴西等主要玉米生产国家,成为防控草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda和欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis等重大害虫的核心技术。该文综述了全球转基因抗虫玉米商业化的历史和防控害虫的作用,分析了美国对欧洲玉米螟和草地贪夜蛾等靶标害虫抗性治理的成功经验以及巴西等南美国家草地贪夜蛾对多种转基因抗虫玉米产生抗性的成因与教训。基于中国转基因抗虫玉米转化事件的研发现状、玉米生产模式、玉米害虫的区域发生特点和迁飞生物学等特性,提出在南方和西南山地丘陵玉米区种植包含Vip3A的多基因叠加抗虫玉米从源头防控草地贪夜蛾,在黄淮海夏玉米区种植包含Cry2A的多基因叠加抗虫玉米从源头防控棉铃虫Helicoverpa armigera,在北方春玉米区种植包含Cry1A的多基因叠加抗虫玉米从源头防控亚洲玉米螟Ostr...     

转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫的抗性

为明确转Bt基因玉米对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的抗性,采用室内玉米离体组织生测法测定取食转Cry1Ab-ma基因抗虫玉米CM8101心叶、花丝和籽粒后草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫存活数量、存活幼虫的体重、蛹重、化蛹和羽化等参数,分析转Cry1Ab-ma基因抗虫玉米CM8101三种组织对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫的抗性。结果显示,转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101心叶可完全杀死草地贪夜蛾1龄幼虫,2龄幼虫有存活,存活率为10.0%,但不能化蛹与羽化;花丝可杀死大部分草地贪夜蛾1龄幼虫,存活率为3.3%,并阻断其生活史,但对2龄幼虫杀伤力弱,存活率为73.3%,存活幼虫化蛹率和羽化率分别为20.0%和13.3%;籽粒可完全杀死草地贪夜蛾1龄幼虫,2龄幼虫有存活,存活率为13.3%,有少量可化蛹,化蛹率为3.3%、有少量羽化,羽化率为3.3%。表明转Cry1Ab-ma基因玉米CM8101在短期内对草地贪夜蛾1龄和2龄幼虫有良好的控制作用。     

转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗虫性评价

为评估转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)和斜纹夜蛾Prodenia litura(Fabricius)的抗虫性,在室内测定了3个转cry1Ab/cry2Aj玉米品系和1个转cry1Ab/vip3DA玉米品系对3种害虫幼虫存活和生长发育的影响,研究了该系列Bt玉米不同组织器官对害虫的杀虫活性和控制效果。结果显示,棉铃虫初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片96h后死亡率为87.50%~90.00%,取食花丝和雌穗的幼虫96h后几乎全部死亡;甜菜夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗168h后死亡率为22.50%~68.33%,幼虫的生长发育受到明显抑制,体重抑制率达85.00%~95.00%;斜纹夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗96 h后死亡率显著高于非转基因亲本对照,168h后幼虫死亡率达90.00%以上。研究表明,转cry1Ab/cry2Aj和cry1Ab/vip3DA玉米品系对棉铃虫和斜纹夜蛾的初孵幼虫表现出较好的抗性,可以作为转多基因抗虫玉米育种的备选材料。     

不同条件下转cry1Ab基因玉米植株残体中杀虫蛋白降解动态

为明确转cry1Ab基因玉米植株残体中Cry1Ab杀虫蛋白在不同条件下的降解动态,选取转cry1Ab基因玉米MON810和Bt11,采用ELISA方法测定4种条件下秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的残留量。结果表明,在不同条件、不同取样时间,2种玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的残留量差异显著;整株秸秆中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度比粉碎后的慢;秸秆粉碎埋入土壤后播种冬小麦,玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度最快,且可完全降解;在不同条件下,MON810玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度比Bt11玉米慢,MON810和Bt11玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的DT50分别为10.2~207.8、13.6~124.0 d,DT90分别为185.1~368.3、45.2~224.0 d。研究表明,在不同条件下MON810和Bt11玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度不同,依次为秸秆粉碎后埋在土壤后种植冬小麦秸秆粉碎埋在玉米田土壤中秸秆粉碎后放在地表整株秸秆放在地表。     

甜菜夜蛾中肠碱性磷酸酶alp2基因的克隆、表达及功能分析

为探究甜菜夜蛾Spodoptera exigua中肠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase protein 2,ALP2)是否为Cry1Ac杀虫蛋白的受体,采用同源克隆和RACE技术克隆了编码alp2基因的完整c DNA序列,利用荧光定量PCR比较了甜菜夜蛾幼虫中肠不同龄期ALP2表达量的差异,利用Ligand blot方法检测了中肠ALP2与Cry1Ac杀虫蛋白的结合。结果表明,alp2基因序列全长1 629 bp(Gen Bank序列号为KP420013),编码542个氨基酸,预测在氨基酸序列N端包含1个由21个氨基酸组成的信号肽,在C端存在1个GPI修饰的锚定位点,且在整个氨基酸序列中存在多个糖基化修饰位点。在整个甜菜夜蛾幼虫期均有ALP2表达,但不同龄期的表达量差异显著,1龄幼虫期表达量最低,4龄幼虫期最高。Ligand blot方法检测结果表明原核表达的ALP2片段与活化的Cry1Ac杀虫蛋白可以结合。研究表明,甜菜夜蛾中肠的ALP2可能是Cry1Ac的受体之一。     

转cry1Ac基因抗虫玉米叶片残体降解对土壤动物群落结构的影响

为研究转cry1Ac基因抗虫玉米Bt-799老熟叶片降解过程中对土壤动物群落结构的影响,采用凋落物分解袋法,调查了Bt-799及其对应的非转基因对照郑58和当地主栽常规品种郑单958共3个品种(系)玉米田自然条件下的土壤动物群落组成、类群丰富度和个体数,比较分析了土壤动物群落各特征参数。结果显示,共采集土壤动物42 540头,隶属6纲11目,其中Bt-799田7 481头,隶属4纲8目,郑58田8 994头,隶属5纲8目,郑单958田26 062头,隶属6纲8目,3个品种(系)在土壤动物群落组成上除少数稀有类群存在差异外,其优势类群均为蜱螨目和弹尾纲。Bt-799及其对照郑58的田间土壤动物类群丰富度、多度、Pielou均匀度指数、Simpson优势度指数、ShannonWiener多样性指数分别是3.49、138.54、0.50、0.33、0.76和3.30、166.56、0.46、0.29、0.73,均无显著差异,郑单958田间土壤动物群落各特征参数则分别是2.67、489.46、0.47、0.30、0.68,与Bt-799及其对照郑58相比只有类群丰富度和多度存在显著差异,其它特征参数均无显著差异。初步判定转基因玉米Bt-799叶片残体降解不会对土壤动物群落结构造成影响。     

二化螟Cry1Ac汰选品系对不同Bt蛋白的敏感性

为明确靶标害虫对Bt蛋白的抗性及对不同类型Bt蛋白的交互抗性,采用生物测定法进行了二化螟Chilo suppressalis(Walker)敏感品系和Cry1Ac汰选品系在Cry1Ac毒饲料上的时间-死亡率反应、对不同Bt杀虫蛋白的敏感性及不同Bt蛋白复配组合对二化螟毒力效果的研究。结果表明,二化螟Cry1Ac汰选品系已对36.67μg/mL(LC_(50))的Cry1Ac杀虫蛋白产生了一定的适应性,但对308.69μg/mL(LC90)的Cry1Ac蛋白反应仍较敏感。Cry1Ac敏感品系和汰选品系对Cry1Ab蛋白的LC_(50)分别为1.40μg/mL和3.86μg/mL,二者差异显著,但对Cry1Ca(1.63μg/mL和1.73μg/mL)或Cry2Aa(127.48μg/mL和144.50μg/mL)的LC_(50)差异不显著,即Cry1Ac汰选品系与Cry1Ab存在明显的交互抗性,但与Cry1Ca和Cry2Aa不存在交互抗性。在不同Bt蛋白复配组合中(1∶1复配),Cry1Ab+Cry1Ca、Cry1Ab+Cry2Aa和Cry1Ca+Cry2Aa增效作用最为显著。表明抗虫基因cry1Ca和cry2Aa可作为双价转基因抗虫水稻研发的候选基因。     

转cry1Ac基因抗虫玉米Bt-799种植对土壤动物群落结构的影响

为调查转基因抗虫玉米种植对非靶标土壤动物群落结构的影响,以转cry1Ac基因抗虫玉米Bt-799及其对应的非转基因对照玉米郑58为试验材料,于2014—2015连续2年在东北黑土区采用手捡法和干漏斗法分别调查大型和中小型土壤动物的类群和数量,比较分析转基因与非转基因玉米田中土壤动物群落组成和多样性,并利用冗余分析(redundancy analysis,RDA)各环境因子在土壤动物群落结构形成中的作用。结果表明,郑58和转基因玉米Bt-799田中大型土壤动物总体群落组成相同,各类群多度无显著差异;2种玉米田间所有类群总体多度、物种丰富度、Simpson优势度指数、Shannon-Weiner多样性指数和Pielou均匀度指数均无显著差异,2014年其P值分别为0.949、0.867、0.751、0.998、0.985,2015年其P值分别为0.869、0.406、0.532、0.115、0.410;RDA分析表明玉米品种(系)在大型、中小型土壤动物群落结构形成中几乎没有作用。表明中短期内转基因玉米种植对非靶标土壤动物无显著影响。