猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因变异分析

采用RT-PCR方法对不同省份疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序,获得14个ORF5基因片段.序列分析结果表明,获得的14个ORF5基因序列不存在缺失现象,核苷酸的同源性为98.8%～99.7%,推导编码氨基酸同源性为96.5%～99%.与国内毒株相比,核苷酸同源性为85.2%～100%,氨基酸同源性为84.6%～99%;与中国代表毒株CH-1a、美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别在94.4%～95.2%和86.7%～87.9%之间,与疫苗株MLV的同源性在86.4%～87.6%之间,而与欧洲型代表株LV的同源性在54.1%～55.7%之间,推导编码的氨基酸序列同源性则分别在91.5%～93.5%、86.6%～88.6%、85.6%～87.6%、54.7%～56.2%之间.表明所获得序列的流行毒株均属于美洲型.进一步分析发现与近期国内流行的高致病性猪蓝耳病病毒同源性非常之高,说明这些毒株可能均起源于同一个毒株,通过猪的运输流通等在全国流行.     

2018年广东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因变异分析

为了解广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株ORF5基因遗传变异情况,采用RT-PCR对2018年采自广东部分地区疑似患有PRRS的猪肺组织样品进行PRRSV ORF5基因扩增以及克隆测序,并进行生物信息学分析。结果表明,成功扩增出18株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段。ORF5基因序列分析表明,18株PRRSV流行毒株ORF5基因核苷酸同源性为83.7%~99.8%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性为62.1%~99.8%。基于ORF5基因的遗传进化树分析表明,18株PRRSV流行株均为美洲型毒株。其中,10株与以JXA1为代表的高致病性毒株亲缘较近,2株与新型高致病性毒株FZ16A相似;1株与以NT1为代表的疫苗返强毒株亲缘较近,1株与以R98为代表的疫苗毒株亲缘性较近,4株与广东新报道的GM2和QYYZ毒株亲缘性较近。DNA推导氨基酸序列分析表明,18株流行株的氨基酸序列与国内已报道的代表株相比发生不同程度的变异,GP5抗原表位上存在着差异。研究结果揭示了广东地区PRRSV有新型强毒株、重组毒株以及疫苗返强毒株的流行,提示养殖者谨慎、合理使用疫苗,防止疫苗毒株返强和毒株重组,为该地区防控PRRS提供参考。     

2021—2022年我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因变异分析

为深入了解我国猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的流行和遗传变异情况,2021—2022年,本课题组在我国13个省份约50个养殖场收集了117份临床疑似猪繁殖与呼吸综合征患猪样品,针对PRRSV的ORF5基因进行了遗传变异分析。通过实时荧光定量PCR鉴定PRRSV阳性样品和基因型,应用RT-PCR扩增PRRSV ORF5和ORF7基因,将阳性样本进行测序并开展系统发育学分群和GP5氨基酸突变分析。结果显示,共检出PRRSV-2阳性样品48份(总体阳性率约41%),经测序共获取38条ORF5序列和10条ORF7序列。所有ORF5序列间核苷酸相似性为77.1%～99.8%,ORF7序列间核苷酸相似性为83.3%～98.7%。系统发育学分群显示,谱系1占比60%(29/48,28株NADC30-like毒株,1株NADC34-like毒株),谱系3占比25%(12/48),谱系5.1占比5%(2/48),谱系8.7占比10%(5/48)。GP5氨基酸分析表明,信号肽(aa 1—26)、中...     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5和Nsp2基因变异分析

采用RT-PCR方法对2006-2007年华南地区部分省份的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得13个Nsp2基因的部分序列片段和14个ORF5基因片段。序列分析结果表明,所获得的13个Nsp2基因序列中均有2个区域存在明显缺失,核苷酸的同源性为96.9%～99.1%,与中国代表毒株CH-1a、美洲株代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别为85.1%～86.4%和67.2%～68.9%,与疫苗株MLV的同源性在67.6%～68.9%之间,而与欧洲株代表株LV的同源性在54.1%～55.9%之间;获得的14个ORF5基因序列不存在缺失现象,核苷酸的相似性为同源性为98.8%～99.7%,推导编码氨基酸同源性为96.5%～99%。与国内毒株相比,核苷酸同源性为85.2%～100%,氨基酸同源性为84.6%～99%;与中国代表毒株CH-1a、美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别在94.4%～95.2%和86.7%～87.9%之间,与疫苗株MLV的同源性在86.4%～87.6%之间,而与欧洲型代表株LV的同源性在54.1%～55.7%之间,推导编码的氨基酸序列同源性则分别在91.5%～93.5%,86.6%～88.6%,85.6%～87.6%,54.7%～56.2%之间。结果表明所获得序列的流行毒株均属于美洲型,进一步分析发现这些毒株可能均起源于同一个毒株,通过猪运输流通等途径在全国范围流行扩散。     

抗体免疫压力下猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3和 ORF5基因变异研究

本试验旨在对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在抗体免疫选择压力下分子变异情况进行研究。将HPPRRSV-JXA1株在添加适量抗体或不添加抗体的Marc-145细胞上连续传代各30代,获得毒株JXA1-Abf30和JXA1-f30。对传代前后毒株的ORF3和ORF5基因进行扩增、克隆和序列分析,研究结果显示,JXA1-Abf30和JXA1-f30在ORF3和ORF5基因上核苷酸发生突变位点数累计分别为18和9个,氨基酸发生突变位点数累计分别为15和3个。JXA1-Abf30和JXA1-f30的核苷酸突变速率比为186%,氨基酸突变速率比为500%,非同义突变(NS)与同义突变(S)比值(NS/S)分别为5.0和0.5。此外,抗体压力下传代的毒株ORF5基因有4个碱基位点发生稳定的非同义突变,其中2个(AA31和AA190)与已知抗原表位有关。由研究结果可知,抗体压力下传代的PRRSV的突变速率和非同义突变数目明显高于无抗体压力下的传代毒株;抗体免疫选择压能显著影响PRRSV的ORF5基因变异,并呈现明显的压力选择性突变,对ORF3基因变异的影响小于ORF5基因。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒柳州地方株NSP2和ORF5基因变异分析

为了给广西柳州预防和控制猪繁殖与呼吸综合症提供理论数据,本研究对利用RT-PCR方法扩增了该地区流行株LZ5和LZ6的NSP2和ORF5基因并进行测序分析,然后与GenBank中已发表的PRRSV毒株的NSP2和ORF5基因序列进行比较。结果显示,2株柳州地方流行株均属于美洲型,在NSP2基因第483位和535~563位氨基酸均存在30个氨基酸的不连续缺失,其NSP2和ORF5基因的核苷酸同源性分别为99.5%和99.7%,推导的氨基酸同源性分别为100%和99.5%;与近几年国内流行的高致病性蓝耳病代表性毒株之间的NSP2、ORF5基因核苷酸同源性分别为94.7%~96.2%和97.2%~98.0%,其推导的氨基酸同源性分别为92.0%~95.5%和94.5%~97.0%。序列分析结果表明此次柳州流行的PRRSV与2006年夏高热病引起的基因序列高度同源,在基因序列上并未显示出新的特性,在国内也缺乏明显的地域性差异。     

我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因的遗传变异分析

参考Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PKRSV）ATCC VR-2332的ORF5基因序列，设计并合成了一对引物．对来自福建、浙江、山东等地的PRRSV分离毒株进行RT-PCR扩增．获得约748bp的DNA片断，将其分别克隆入pMD18-T载体中，并进行测序。应用DNAStar软件分析所测序列，并与ATCCVR-2332、CH-1a、MLV、Lv等毒株的ORF5序列进行比较，结果表明：SHDl与F114、MLV、ATCCVR-2332同源性高达98．5％，与CH-1a同源性为91．0％，与其它毒株同源性为86．6％~88．4％；F114与MLV、ATCCVR-2332同源性为99．3％～99．7％．其余分离毒株在遗传关系上和CH-1a又分为明显的两个群．显示近年来各地PRRSV分离毒株与cH-1a株的遗传差异越来越大。     

华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

为了解华东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株变异情况,本研究以RT-PCR技术对山东、福建发病猪场的41份组织样品进行PRRSV检测和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)相关毒株(HP-PRRSVLike)检测,对阳性样品进行PRRSV分离、ORF5基因测序及变异分析。结果显示,福建、山东样品的阳性率分别为56%、74%;共分离到16个美洲型毒株(福建10株、山东6株),分属于Lineage 8、Lineage 5、Lineage 3、Lineage 1四个谱系,其中以Lineage 8为主。这表明PRRSV流行毒株多样化,跨谱系毒株重组值得警惕。     

辽宁省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株ORF5-7基因遗传变异分析

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332全基因序列,设计并合成2对引物,采用RT-PCR技术,对辽宁省站送检的病料进行分离扩增,分别获得相应的目的片段,将其分别克隆入pMD18-T载体中,并送上海生工测序。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCC VR-2332、CH-1a、BJ-4、LV-M96262及疫苗株的ORF567基因进行序列比较,通过核苷酸序列分析表明这5株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性为89.5%～95%,与LV-M96262的同源性为54%～58.3%.氨基酸序列分析表明这5株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性为82.8%～94.7%.     

豫南地区部分猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒检测及ORF5遗传变异分析

为了解豫南地区猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行情况和流行毒株基因的遗传变异规律,本研究对2013年~2014年豫南地区部分发病猪场进行PRRSV检测,同时对分离株ORF5基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,并将其进行序列比对和遗传进化分析。结果表明:本研究检测的275份病料中,检测阳性样本为86份,阳性率为31.3%;测序的13株流行毒株,遗传关系上均属于美洲株;与VR2332毒株序列比对,13株分离株糖基化位点和抗原表位都有不同程度的变异;另外,遗传进化树分析表明,13株分离株中12株与2006年中国高致病PRRSV代表毒株JXA1同属一个亚群,1株与HB-1(sh)/2002毒株同源性较高,表明目前豫南地区以高致病性PRRSV毒株流行为主,同时还有少部分过渡性毒株存在。研究结果为豫南地区PRRS的防治及新型疫苗的研制提供了依据。     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2014-2016年浙江地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）ORF5基因变异情况,试验通过RT-PCR方法对从浙江省各地区采集的PRRSV阳性病料进行ORF5基因扩增,应用DNAStar和Mega 5.1软件对所测序列进行同源性和遗传变异分析。结果显示,54株2014-2016年浙江分离株ORF5序列之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.1%~100%和80.6%~100%,与经典株VR2332核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.8%~90.4%和81.6%~90.0%,与高致病PRRSV毒株JXA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.5%~99.5%和83.1%~99.0%。系统进化分析表明,54个毒株均为美洲型毒株,属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3个不同的基因亚型,其中基因亚型Ⅲ和Ⅳ毒株是浙江省近年来新出现的毒株。氨基酸序列分析结果显示,54个毒株在GP5蛋白的信号肽区域、非中和抗体表位的氨基酸序列变异较大,而在中和表位氨基酸序列变异较小。本研究结果表明,浙江地区PRRSV流行出现了新形势,多种基因亚型共同存在,其中以基因亚型Ⅰ毒株为主。     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2004-2009年猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况,从浙江省各个地区采集了109份临床疑似病料,共检测到61份ORF5基因阳性,经序列测定得到可比序列11 7个.在核苷酸序列分析中,发现2004-2005年PRRSV ORF5序列之间同源性为83.6％～99.3％,2006年同源性最高达98.3～99.2％,2008-2009年同源性又有所降低.在氨基酸主要位点分析中,分离毒株的非中和表位27～～30位点与美洲株相比,2004-2006年大部分毒株的29 aa由A29-V29,而2007-2009年大部分毒株的29 aa又由V29-A29;在表位37～45 aa中,所有39位点处由L39”一I39;在表位80～197 aa中,从2004-2009年185 aa大部分都发生了变异,由V185-A185,第189位点由I189-L189.在蛋白生化特性分析中,发现与参考株VR2332 (AY150564)和CH la(AY032626)相比,浙江省PRRSV-GP5蛋白的第100～106位亲水性、表面可及性明显增加,抗原性指数也有所提高,而与参考毒株JX-06-2-EU480750相似.该试验结果说明随着时间的推移,PRRSV ORF5基因发生明显的变异.     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2014-2016年浙江地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5基因变异情况,试验通过RT-PCR方法对从浙江省各地区采集的PRRSV阳性病料进行ORF5基因扩增,应用DNAStar和Mega 5.1软件对所测序列进行同源性和遗传变异分析。结果显示,54株2014-2016年浙江分离株ORF5序列之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.1%～100%和80.6%～100%,与经典株VR2332核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.8%～90.4%和81.6%～90.0%,与高致病PRRSV毒株JXA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.5%～99.5%和83.1%～99.0%。系统进化分析表明,54个毒株均为美洲型毒株,属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ3个不同的基因亚型,其中基因亚型Ⅲ和Ⅳ毒株是浙江省近年来新出现的毒株。氨基酸序列分析结果显示,54个毒株在GP5蛋白的信号肽区域、非中和抗体表位的氨基酸序列变异较大,而在中和表位氨基酸序列变异较小。本研究结果表明,浙江地区PRRSV流行出现了新形势,多种基因亚型共同存在,其中以基因亚型Ⅰ毒株为主。     

贵州省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

为了调查猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异情况,笔者收集了贵州省16家规模化养殖场153份疑似PRRS的样品,通过RT-PCR检测和ORF5基因序列的测定,结果表明:所有样品之间ORF5基因的同源性为98.7%～100%,氨基酸的同源性为98.5%～100%;与美洲型代表毒株VR-2332、国内标准毒株CH-1a和欧洲型代表毒株LV基因序列的同源性分别为89.2%～90%、94.8%～95.6%、59.7%～60.2%,氨基酸序列同源性分别为88.8%～89.3%、92.7%～94.2%、54.9%～55.3%,遗传衍化关系分析表明流行毒株属于美洲型.ORF5基因发生离散性变异,可以分为3个簇,与中国其他地区分离的高致病性PRRS病毒关系密切,而与早期分离的PRRS毒株关系疏远,说明猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因存在变异现象.     

广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员,主要引起妊娠母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病及免疫抑制和持续性感染,从而导致新生仔猪发生继发感染,生长发育受阻,有时可出现神经症状,死亡率升高.     

2016-2017年江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及ORF5基因变异分析

为了解近年来江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）分子流行病学和其遗传变异情况,本次调查于2016-2017年从江西省各地区规模化猪场采集453份疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病料,采用RT-PCR方法对所有病料进行检测。结果发现,其中321份病料为PRRSV阳性,阳性率为70.86%,各地区的阳性率在19.15%~84.85%之间。挑选14份阳性样品测序后,经ORF5基因序列分析,江西地区各PRRSV毒株ORF5基因的核苷酸同源性为83%~100%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性在59.9%~98.5%之间。基于ORF5基因的进化树分析表明,14个测序毒株均为美洲型毒株,其中有4株为基因亚型Ⅰ,即高致病性毒株（HP-PRRSV）;3株为基因亚型Ⅱ,即经典毒株;3株为基因亚型Ⅲ,即NADC30-like毒株;4株为新出现的基因亚型Ⅳ。氨基酸序列比对分析表明,基因亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ毒株ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸在3个表位及2个重要的抗原相关区域存在较大变异,其中以NADC30毒株为代表的基因亚型Ⅲ毒株和以GD1404毒株为代表的基因亚型Ⅳ毒株均表现出独有的氨基酸变异,这些变异可能会影响GP5蛋白的免疫原性。本次调查结果表明,2016-2017年江西地区PRRSV流行出现了新形势,美洲型毒株出现了多基因亚型共同存在的局面,以高致病性毒株（HP-PRRSV）为主,NADC30-like毒株和新基因亚型等新毒株的比例较高,同时还存在经典毒株;持续实时监测PRRSV的毒株流行和变异情况,可为临床诊断、药物和疫苗开发及PRRS的科学防控提供依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5a/ORF5重叠区的分离

以两个不同基因型的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染性克隆为平台进行反向遗传操作,利用SOE-PCR将I型PRRSV的ORF2～5a替换进II型PRRSV的相应区域,旨在将I型PRRSV的5a从ORF5中独立出来进而研究5a蛋白的功能,同时探讨两型PRRSV的结构蛋白结构与功能关系。研究结果表明,I型PRRSV的ORF2～5a序列能稳定存在于嵌合病毒基因组内,表达的相应蛋白能在II型PRRSV中发挥同样功能。本研究首次将PRRSV的ORF5a序列从ORF5中独立出来,为进一步研究5a蛋白的结构与功能提供了理论依据和基础材料。     

我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析

为了解近年我国猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的分子遗传变异情况,对2019年来自8省的46株PRRSV测序并进行ORF 5基因分析比较.结果表明,送检测序的46株PRRSV均属于北美型,同源性对比结果显示,与欧...     

河北猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株HB-3（cz）株ORF5基因变异分析

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiration Syndrome,PRRS）是近年来新发现的由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种猪传染病。PRRSV属套式病毒目动脉炎病毒科成员,基因组全长约15kb,为单股正链RNA病毒,含9个开放阅读框（ORF）,其中ORF5编码病毒糖基化囊膜蛋白（E蛋白）,E蛋白为PRRSV3个主要结构蛋白之一,参与体液免疫和细胞免疫,具有较高的免疫原性和中和活性。不同国家和地区分离株的ORF5基因差异较大。PRRSV有2种基因型,     

8株猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

本研究拟初步了解中原地区近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况。对2011—2012年间从河南及周边省份发病猪场分离的8株PRRSV毒株Nsp2基因变异区进行RT-PCR扩增,同时对主要结构蛋白GP5基因进行克隆测序并与GenBank中登录的中国历年来流行的PRRSV代表毒株的GP5蛋白序列进行遗传进化分析,对主要氨基酸基序进行比对分析。结果表明,2011—2012年在中原地区分离的8株PRRSV分离株均为Nsp2缺失变异株,GP5基因与2006年中国高致病PRRSV代表毒株JXA1同源性较高。