重庆地区草地贪夜蛾肠道细菌的分离鉴定

为了解入侵重庆地区草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)肠道所携带的细菌组成,以采集自巫溪、巫山地区玉米地里的草地贪夜蛾为材料,运用传统培养方法分离了其肠道优势细菌,并基于16S rDNA测序开展了优势菌的属水平鉴定,共获得了30个细菌分离株,经16S rDNA序列同源性分析,可归于5个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)以及气单胞菌属(Aeromonas);其中,克雷伯氏菌属(Klebsiella)的丰度最高,占所有分离菌株的63%;假单胞属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)菌株仅在巫山地区分离得到,气单胞菌属(Aeromonas)仅在巫溪地区分离得到.实验确定了入侵重庆地区草地贪夜蛾肠道优势细菌的种类及丰度,为后续研究草地贪夜蛾肠道微生物对宿主的生长发育以及迁飞等重要问题奠定了基础.     

重庆地区取食高粱的草地贪夜蛾与玉米粘虫肠道细菌比较

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)于2019年5月被发现已经入侵至重庆地区, 6月底在江津地区的高粱地中也发现了少量的草地贪夜蛾,同时还发现了大量玉米黏虫(Mythimna seperata).通过分离培养同一生境内的草地贪夜蛾和玉米黏虫的肠道细菌,结合16S rDNA测序完成了这两种害虫肠道优势菌属水平的鉴定,共分离得到了19个细菌分离株,其中分离自草地贪夜蛾肠道细菌归为5个属,分别为欧文氏菌属(Erwinia),不动杆菌属(Acinetobacter),肠杆菌属(Enterobacter),肠球菌属(Enterococcus),假单胞菌属(Pseudomonas).分离自玉米黏虫肠道细菌归为6个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella),不动杆菌属(Acinetobacter),寡养单胞菌属(Stenotrophomonas),肠球菌属(Enterococcus),金黄杆菌属(Chryseobacterium),芽孢杆菌属(Bacillus).同时我们也对采自玉米地和高粱地的草地贪夜蛾肠道微生物优势菌进行了比较分析,在江津高粱地中的草地贪夜蛾中没有发现克雷伯氏菌,但该菌在巫山、巫溪玉米地的草地贪夜蛾中大量存在.结论为进一步研究草地贪夜蛾幼虫肠道核心微生物群奠定了基础.     

重庆地区取食高粱的草地贪夜蛾与玉米黏虫肠道细菌比较

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)于2019年5月被发现已经入侵至重庆地区, 6月底在江津地区的高粱地中也发现了少量的草地贪夜蛾,同时还发现了大量玉米黏虫(Mythimna seperata).通过分离培养同一生境内的草地贪夜蛾和玉米黏虫的肠道细菌,结合16S rDNA测序完成了这两种害虫肠道优势菌属水平的鉴定,共分离得到了19个细菌分离株,其中分离自草地贪夜蛾肠道细菌归为5个属,分别为欧文氏菌属(Erwinia),不动杆菌属(Acinetobacter),肠杆菌属(Enterobacter),肠球菌属(Enterococcus),假单胞菌属(Pseudomonas).分离自玉米黏虫肠道细菌归为6个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella),不动杆菌属(Acinetobacter),寡养单胞菌属(Stenotrophomonas),肠球菌属(Enterococcus),金黄杆菌属(Chryseobacterium),芽孢杆菌属(Bacillus).同时我们也对采自玉米地和高粱地的草地贪夜蛾肠道微生物优势菌进行了比较分析,在江津高粱地中的草地贪夜蛾中没有发现克雷伯氏菌,但该菌在巫山、巫溪玉米地的草地贪夜蛾中大量存在.结论为进一步研究草地贪夜蛾幼虫肠道核心微生物群奠定了基础.     

重庆地区取食高粱的草地贪夜蛾肠道细菌新分离株的鉴定

为充分认识入侵重庆地区草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的肠道微生物, 2019年7月该课题组再次在重庆江津地区高粱地采集了草地贪夜蛾幼虫,通过分离培养结合16S rDNA测序鉴定,从江津草地贪夜蛾幼虫肠道中共分离得到38个细菌分离株,归为9个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)和鞘脂杆菌属(Sphingobacterium).在课题组前期研究的基础上,新分离到了6个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和鞘脂杆菌属(Sphingobacterium).同时还对入侵重庆地区采食高粱和玉米的草地贪夜蛾幼虫肠道细菌分离株进行了比较分析,只在采食高粱的草地贪夜蛾幼虫肠道中发现了欧文氏菌属(Erwinia)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)的菌株,而气单胞菌属(Aeromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)和类香味菌属(Myroides)则只在采食玉米的草地贪夜蛾幼虫肠道中分离得到.通过对同一片江津高粱地的草地贪夜蛾和玉米黏虫(Mythimna separata)的肠道细菌分离株进行比较分析,只在草地贪夜蛾肠道中发现了微球菌属(Micrococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和鞘脂杆菌属(Sphingobacterium),而金黄杆菌属(Chryseobacterium)只发现于玉米黏虫肠道中.     

云南不同地理种群草地贪夜蛾肠道可培养细菌多样性分析

【目的】明确云南不同地理种群草地贪夜蛾幼虫肠道可培养细菌群落组成及种群间的差异,为草地贪夜蛾肠道细菌多样性及其生物学功能研究提供科学依据,并为解析草地贪夜蛾的环境适应机理打下基础。【方法】采用分离培养法对云南省普洱市澜沧、保山市隆阳、昆明市石林、红河州开远4个不同地理种群的草地贪夜蛾幼虫肠道细菌进行分离培养,结合形态学及16S rDNA测序方法进行细菌种类鉴定。【结果】从云南4个地理种群草地贪夜蛾幼虫肠道中共分离获得27株形态、颜色和大小各异的细菌菌株,27株细菌菌株分属4门9科12属19种,优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),优势菌属为厚壁菌门肠球菌属(Enterococcus)。其中,澜沧、石林、开远和保山种群分别分离到3门4科6属8种共9株细菌、3门5科6属6种共6株细菌、2门3科4属5种共5株细菌和3门6科6属6种共7株细菌;4个地理种群草地贪夜蛾幼虫肠道内均存在肠球菌属和克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌;4个地理种群草地贪夜蛾幼虫肠道细菌的丰富度指数、Shannon指数、Simpson指数和均匀度指数分别为0.705~1.277、0.969~1.381、0.615~0.635及0.602~0.753。【结论】云南4个不同地理种群草地贪夜蛾幼虫肠道内可培养细菌较丰富,不同地理种群肠道细菌多样性存在差异,但优势菌均为厚壁菌门的肠球菌属细菌,肠球菌属细菌对草地贪夜蛾肠道细菌群落起着决定作用。     

重庆地区玉米叶内生细菌的分离及其与草地贪夜蛾肠道菌的比较

为进一步了解重庆地区玉米叶内生细菌的组成以及这些内生细菌与入侵重庆地区草地贪夜蛾肠道微生态的相互关系,以采集自巫山地区被草地贪夜蛾入侵的玉米地里的玉米嫩叶为材料,运用传统微生物培养方法尝试对其内生细菌进行初步的分离培养,并通过16S rDNA测序开展了优势菌的属水平鉴定.此次共分离获得了22个细菌分离株,经16S rDNA序列同源性分析,将它们归类到11个分类单元,分属克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、无色杆菌属(Achromobacter)和丛毛单胞菌属(Comamonas).与前期研究得到的该地区草地贪夜蛾肠道微生物菌群数据比较可以发现,玉米内生细菌中包括克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)和金黄杆菌属(Chryseobacterium)在内的5个属可以在草地贪夜蛾肠道中分离到,表明草地贪夜蛾肠道微生物多数可能源自其食物,但是草地贪夜蛾肠道微生物中常见的假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)和气单胞菌属(Aeromonas)并未在玉米嫩叶中分离到,说明它们可能是主要存在于草地贪夜蛾肠道中的微生物.该研究对草地贪夜蛾所取食的玉米叶中内生细菌的种类进行了初步分析,为后续研究玉米叶内生细菌和草地贪夜蛾肠道微生物的相互关系奠定了基础.     

湖南常德地区草地贪夜蛾肠道细菌的鉴定及其寄主分析

对湖南常德地区草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)幼虫的肠道细菌进行分离培养,结合16Sr DNA测序,共分离得到11个细菌分离株,分别归为肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、莱略特氏菌属(Lelliottia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)5个属,与分离自玉米粘虫(Mythimna separata)幼虫肠道细菌归属的肠杆菌属、芽孢杆菌属及克雷伯氏菌属在种类上相似;发现草地贪夜蛾幼虫在玉米、豇豆、辣椒和甘蓝等植物上均可存活,存活率分别为70%、50%、17%和10%,这些植物可能是湖南地区的潜在寄主。     

云南省芒市草地贪夜蛾幼虫肠道可培养细菌种类及对抗生素的敏感性

[目的]明确云南省芒市草地贪夜蛾幼虫肠道可培养细菌种类及优势种细菌对抗生素的敏感性,为草地贪夜蛾的绿色防控提供参考.[方法]采用常规分离培养法对云南省芒市玉米田草地贪夜蛾5龄幼虫肠道可培养细菌进行分离培养,采用形态特征和16S rDNA技术对细菌种类进行鉴定;采用纸片扩散法测定优势种细菌对10种抗生素的敏感性.[结果]云南省芒市玉米田草地贪夜蛾5龄幼虫肠道内可培养细菌有3门5科5属6种,分别为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、普罗威登斯菌(Providencia vermicola)、金黄微杆菌(Chryseomicrobium aureum)和Kocuria himachalensis,其中变栖克雷伯氏菌是草地贪夜蛾幼虫肠道的优势种细菌.变栖克雷伯氏菌对10种抗生素的敏感性测定结果表明,变栖克雷伯氏菌对诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、氯霉素和头孢唑林敏感,表现为低耐药性;对庆大霉素和阿米卡星中等敏感,表现为中等耐药性;对青霉素、红霉素和氨苄西林的敏感性较弱,表现为强耐药性.[结论]云南省芒市草地贪夜蛾幼虫肠道可培养细菌组成具有多样性,其中变栖克雷伯氏菌为优势种细菌,该优势种细菌对青霉素、红霉素和氨苄西林存在明显的耐药性.     

草地贪夜蛾肠道细菌分离鉴定与功能初探

【目的】明确草地贪夜蛾幼虫肠道细菌的种类和功能,以诠释肠道细菌对草地贪夜蛾寄主植物适应性的影响,为揭示草地贪夜蛾的寄主适应机制及进一步预测其寄主谱扩张趋势提供依据。【方法】采用传统的微生物分离纯化方法对草地贪夜蛾肠道细菌进行分离纯化,对分离获得的细菌菌株进行16S rRNA序列同源性分析鉴定;利用筛选培养基对产生纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶及对苯酚有代谢能力的菌株进行初筛,并进一步用DNS法测定相关菌株产纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的酶活性,用含苯酚的无机盐培养基培养菌株,检测菌株的苯酚降解效率。【结果】共分离获得45株细菌菌株,经同源序列比对分析,45株细菌菌株分属于3门5属8种,分别是厚壁菌门（Firmicutes）的葡萄球菌属（Staphylococcus）和芽孢杆菌属（Bacillus）,变形菌门（Proteobacteria）的克雷伯氏菌属（Klebsiella）和不动杆菌属（Acinetobacter）,放线菌门（Acinobacteria）的短杆菌属（Curtobacterium）,其中克雷伯氏菌属的丰度最高。45株菌株中有产纤维素酶菌株11株,酶活力最高的是变栖克雷伯氏菌菌株K3,为0.105±0.007 U/mL;产木聚糖酶菌株10株,酶活力最高的是枯草芽孢杆菌菌株B9,为1.090±0.468 U/mL;产果胶酶菌株5株,酶活力最高的是变栖克雷伯氏菌菌株K27,为0.193±0.047 U/mL;降解苯酚的菌株9株,降解速率最高的是沙福芽孢杆菌菌株B8,为（0.347±0.042）%。【结论】草地贪夜蛾幼虫肠道细菌的产酶菌株多样性较高,推测这是导致草地贪夜蛾寄主谱广,对寄主为害严重的原因之一。     

重庆巫山地区采食玉米的草地贪夜蛾肠道细菌的分离鉴定补遗

为充分认识入侵重庆地区草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)肠道所携带的细菌组成,以采集自巫山地区玉米地的草地贪夜蛾为材料,在课题组前期研究基础上进一步分离培养并通过16S rDNA测序鉴定了3个未报道的分离株,分别归为短波单胞菌属(Brevundimonas)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)以及肠球菌属(Enterococcus).结论进一步丰富了入侵重庆巫山地区草地贪夜蛾肠道优势细菌的种类,为后续研究草地贪夜蛾肠道微生物对宿主的生长发育以及迁飞等重要问题奠定了基础.     

重庆地区草地贪夜蛾幼虫肠道真菌的分离鉴定

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)是一种洲际迁飞性农业害虫,食谱广泛. 2019年5月已迁飞至重庆地区,对农作物造成严重危害.为了解入侵重庆地区草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)肠道真菌菌群的组成,本研究以采集自重庆巫山玉米田及重庆江津高粱田中的草地贪夜蛾幼虫为材料,运用传统培养方法分离其粪便中的肠道优势真菌,并对其进行形态学观察和分子生物学鉴定.实验通过分离培养不同地区、不同食物的草地贪夜蛾肠道真菌,结合形态学观察及rDNA ITS测序完成了属水平的鉴定,共分离得到了5个属10个真菌分离株,其中分离自重庆巫山玉米田的草地贪夜蛾肠道真菌归为3个属,分别为念珠菌属(Candida)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)和帚枝霉属(Sarocladium);分离自重庆江津高粱田的草地贪夜蛾肠道真菌归为3个属,分别为念珠菌属(Candida)、莫氏黑粉菌属(Moesziomyces)和毛霉属(Mucor).初步分离获得入侵重庆地区的草地贪夜蛾肠道真菌,丰富了对入侵草地贪夜蛾肠道微生物的认识.     

入侵我国中南三省(区)草地贪夜蛾的单倍体型和群体遗传结构分析

【目的】揭示入侵我国中南三省(区)的草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda种群间可能存在的遗传变异,探讨其入侵来源、入侵路线和扩散方式,为制定有效控制和阻击草地贪夜蛾的方案提供理论依据和遗传信息。【方法】利用分子标记技术从线粒体DNA和核DNA角度研究草地贪夜蛾种群的遗传多样性和种群结构。对采集自我国广东、广西和湖南3个省(区)的草地贪夜蛾,利用COI和Tpi基因片段进行了单倍体型分析,利用9个微卫星标记分析种群间的遗传结构和遗传多样性。【结果】供试样品中,除了湖南张家界群体有2个样品为COI玉米型单倍体型、1个样品为杂合型,其他群体的个体均为COI水稻型单倍体型。基于SSR标记的群体遗传分析结果表明,被检测的群体遗传多样性较巴西等国家的美洲群体低,各群体遗传分化不明显。广东东莞群体与湖南张家界群体的遗传距离最近,与广西南宁群体的遗传距离较远。【结论】遗传距离与实际距离之间不一定呈正相关,通过遗传结构的分析有助于推测草地贪夜蛾扩散过程中,天气背景场、地理隔离和人为传播各自所起的作用。入侵湖南省张家界的草地贪夜蛾出现了低频率COI玉米型和高频率的CO I水稻型单倍体型,说明虫源的非单一性;草地贪夜蛾在入侵地定殖时间较短,目前未形成明显的遗传分化。     

柠条锦鸡儿根瘤菌及其共生固氮基因多样性

为研究西北干旱地区豆科植物柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)根瘤菌的系统发育地位及共生基因多样性,对从甘肃省分离得到的菌株进行16SrRNA PCR-RFLP和序列分析,构建系统发育树,确定其分类地位,并通过分析共生基因nodA和nifH,确定种群共生类型。结果表明:从柠条根瘤内分离到64株菌,共有7个PCR-RFLP 16SrRNA基因型,主要归属于Ensifer(占分离总数43.8%)、Mesorhizobium(31.2%)、Rhizobium(25%),其中,Ensifer为主要类群,约占34.4%。共生基因nodA和nifH与Ensifer和Mesorhizobium模式菌株同源性较高,与16SrRNA基因确定的根瘤菌分类地位相比,发现部分共生基因与16S rRNA基因确定的分类地位不同,揭示了共生基因横向转移现象的发生。     

桑叶叶际和家蚕肠道细菌群落结构及功能分析

家蚕是我国重要的经济昆虫,主要以桑叶为食,了解家蚕肠道及所食桑叶叶际微生物对减少家蚕病害具有重要意义。以5龄第3天的家蚕幼虫和所食桑叶为研究对象,利用高通量测序技术对家蚕肠道和叶际细菌的16S rDNA V3-V4区序列进行测序分析。结果表明：桑叶叶际和家蚕肠道各部位细菌的多样性指数（Shannon指数和Simpson指数）无显著差异（P > 0.05）;NMDS分析显示桑叶叶际细菌与家蚕肠道细菌各自聚类,家蚕肠道各部分的细菌菌群无显著差异。桑叶叶际和家蚕肠道中共注释到的主要分类阶元有29 个门、268 个属：前4个优势门为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）;芽孢杆菌属Bacillus为桑叶叶际细菌的最优势属,泛菌属Pantoea为家蚕前肠细菌的最优势属,鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas为家蚕中肠和后肠细菌的最优势属。通过功能预测可知,消化系统、免疫系统、能量代谢、代谢性疾病和传染性疾病在家蚕的前肠、中肠中占比较高,氨基酸代谢、碳水化合物代谢、神经退行性疾病、免疫系统疾病、脂类代谢、其他氨基酸代谢、心血管疾病和核苷酸代谢在家蚕的后肠中占比较高。家蚕肠道细菌群落与叶际细菌群落前4个优势菌门一致;家蚕肠道的前肠和中肠功能菌群相似,与后肠差异较大。     

异色瓢虫对草地贪夜蛾的捕食行为观察与评价

【目的】探究天敌昆虫异色瓢虫Harmonia axyridis对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的捕食潜力。【方法】在室内条件下评价异色瓢虫成虫和4龄幼虫对草地贪夜蛾1～2龄幼虫的捕食能力,观察并总结异色瓢虫的捕食行为特点。【结果】通过观察,发现异色瓢虫捕食草地贪夜蛾幼虫主要经过静止、搜寻、试探、取食和爬行5种行为,其中异色瓢虫成虫捕食3龄草地贪夜蛾幼虫时出现3对足抱握猎物的现象。异色瓢虫成虫和4龄幼虫对草地贪夜蛾1～2龄幼虫的捕食功能反应符合HollingⅡ模型。异色瓢虫成虫和4龄幼虫对草地贪夜蛾1龄幼虫的日最大捕食量分别为196.08和161.29头,瞬时攻击率分别为1.390 6和1.451 4,处理时间分别为0.005 1和0.006 2 d;异色瓢虫成虫和4龄幼虫对草地贪夜蛾2龄幼虫的日最大捕食量分别为65.36和41.84头,瞬时攻击率分别为1.145 7和1.271 0,处理时间分别为0.015 3和0.023 9 d,即异色瓢虫成虫对草地贪夜蛾幼虫的捕食能力强于4龄幼虫。【结论】异色瓢虫对草地贪夜蛾有一定的潜在控害能力,可用于防控草地贪夜蛾。