犬IFN-α1基因的克隆和序列分析

为对犬干扰素进行研究,试验采用PCR法将犬IFN - αl基因从基因组DNA克隆到pGEM -T载体,并进行测序分析.结果表明:犬IFN - αl基因ORF大小为564 bp,编码187个氨基酸,前23个为信号肽;成熟蛋白理论分子质量为19 ku,等电点为6.217,有4个潜在磷酸化位点、1个N糖基化位点和4个半胱氨酸...     

犬IFN-α1基因的克隆和序列分析

为对犬干扰素进行研究,试验采用PCR法将犬IFN-α1基因从基因组DNA克隆到pGEM-T载体,并进行测序分析。结果表明:犬IFN-α1基因ORF大小为564 bp,编码187个氨基酸,前23个为信号肽;成熟蛋白理论分子质量为19 ku,等电点为6.217,有4个潜在磷酸化位点1、个N糖基化位点和4个半胱氨酸残基,大部分为亲水区;经二级、三级结构预测,该蛋白主要由5段α螺旋组成;犬IFN-α1基因与貉子、赤狐的同源性最高,为98%,在进化树中处于同一分支;在干扰素多肽链中,15L、18L、77W、96L9、9C1、24F、131L、137S、140AWE1421、45R和150R在所有分析物种中高度保守。     

猪IFN-α1和IFN-β1基因的克隆与序列分析

从猪的肝细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增IFN-α1和IFN-1β基因,分别克隆到PMD18-T载体上。测序结果表明,克隆的IFN-α1核苷酸序列与GenBank上登录的猪IFN-α1核苷酸同源性为100%,与鼠、犬、人和牛IFN-α1基因同源性为71.1%~81.4%。克隆的IFN-1β核苷酸序列与Gen-Bank上登录的猪IFN-β1核苷酸同源性为99.6%,推导的氨基酸同源性为99.5%;与人、牛和马IFN-β1基因同源性为76.9%~80.4%。     

绵羊IFN-γ基因的克隆与序列分析

将无菌采集的绵羊(湖羊)脾脏淋巴细胞进行体外培养,利用刀豆蛋白(ConA)刺激24 h后提取总RNA,采用RT-PCR扩增绵羊IFNγ-基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,经PCR和双酶切鉴定后进行测序。测序结果表明,扩增的cDNA全长554 bp,包含501 bp开放阅读框,编码166个氨基酸,分子质量约为18.4 ku。克隆的绵羊IFNγ-基因与GenBank上已公布的人、牛、山羊、马鹿、马、骆驼、猪、狗、猫和鸡的IFNγ-核苷酸序列进行比较,其同源性分别为75.2%,96.6%,99.0%,95.8%,83.0%,88.8%,86.6%,82.4%,53.9%和32.9%,与其他品种绵羊的核苷酸同源性为100%;氨基酸序列同源性分别为61.7%,94.6%,98.2%,92.2%,77.8%,86.8%,77.8%,76.0%,39.5%和6.7%,这为进一步研究绵羊IFNγ-基因的表达、生物学活性和应用奠定了一定基础。     

猪IFN-γ基因的克隆与序列分析

猪IFN-γ具有强烈的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，作为生物药荆和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。通过对猪PBMC刺激诱导，提取总RNA，然后采用RT—PCR技术成功克隆了猪IFN-γ基因。序列分析表明，克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。该基因的成功克隆为IFN-γ的进一步研究和开发奠定了基础。     

惠阳胡须鸡和AA肉鸡IFN-β基因的克隆与序列分析

克隆了惠阳胡须鸡和AA肉鸡IFN-β基因，与Genbank上白色来航鸡IFN-β序列核苷酸同源性分别为99．84％和100％，没有形成新的亚型。二级结构预测表明鸡IFN-β与IFN-α都是全α螺旋蛋白，但α螺旋的长度和组成螺旋的氨基酸上有差别；BLAST结果表明其三级结构与人IFN-β的三级结构最为相似。这对于理解IFN-α、IFN-β与其受体结合方式的不同与他们的生物学活性差异之间的关系奠定了基础。     

民猪IFN-γ基因的克隆及序列分析

为了获得民猪干扰素-γ(IFN-γ)基因,并对该基因进行序列分析,试验采用RT-PCR技术,根据猪IFN-γ基因设计1对引物,从刀豆素A(ConA)活化的民猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,获得了长度为502 bp的片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。结果表明:民猪IFN-γcDNA长度为502 bp,IFN-γ基因的开放阅读框大小为501 bp,编码166个氨基酸,含有2个潜在N-糖基化位点;民猪IFN-γ基因与藏猪、贵州白香猪、成华猪和梅山猪等的同源性为100%。     

荣昌猪IFN-ω基因的克隆与序列分析

干扰素(IFN)是机体天然免疫防御系统中的一类细胞因子,是一类具有广谱抗病毒、增强动物对各种疾病的免疫力等多种生物学功能的蛋白质.目前发现的猪干扰素包括IFN-α、β、γ、δ、ω等 [1],其中研究较热的有IFN-α,IFN-γ,对IFN-ω的研究鲜有报道.IFN-ω是由5个以上的相关功能基因编码的 [2],蛋白质家族中与IFN-α亚型之间同源性很高,天然的IFN-α常常是IFN-α与IFN-ω功能基因表达产物的混合体.     

比格犬SLAM基因的克隆与序列分析

对比格犬的犬瘟热病毒细胞受体——信号淋巴细胞激活因子(SLAM)基因进行克隆及测序分析,并与其他物种的SLAM受体进行比较,以期发现其关键结构部分.用RT-PCR从Con A刺激后的犬外周血淋巴细胞中扩增SLAM基因,将目的片段连接到PMD18-T载体上,转化感受态细胞,筛选阳性克隆,测序.结果显示,克隆的比格犬SLA...     

犬γ干扰素基因的克隆与序列分析

根据已发表的犬γ干扰素（Ｃａ－ＩＦＮ－ｒ）ｃＤＮＡ序列设计引物,用植物血凝素（ＰＨＡ）有机锗（Ｇｅ－１３２）刺激体外培养的犬脾细胞产生ＩＦＮ,提取ＩＦＮｍＲＮＡ,并以其为模板进行返转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出４８０ｂｐ基因片段。经酶切鉴定后将其克隆到ｐＵＣ１９的ＳｍａⅠ,构建重组质粒ｐＵＣ．ＩＦＮ。经酶切、ＰＣＲ及序列分析鉴定,可证明克隆的基因为犬γ干扰素,与所发表的核苷酸序列同源率为９     

猪IFN-β的克隆与原核表达

根据已发表的AY687281基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR方法从长白猪白细胞基因组中扩增到猪β干扰素基因,将PCR产物克隆到pMD18-T载体,进行序列测定。序列分析表明,获得的猪β干扰素基因全长561bp,编码186个氨基酸,与GenBank中AY687281基因序列同源性达99.2%,在28、34、128位核苷酸发生了点突变,由G变为A,由C变为G,由A变为G,由C变为T,导致10、12、43位氨基酸由A变为T,L变为V,E变为G,而在177位点核苷酸的突变没有改变氨基酸。将该基因克隆到pEGX-4T-1表达载体中,转化宿主菌Rosetta,对猪β干扰素进行原核表达。重组表达菌经IPTG诱导后,得到高效表达,所表达蛋白约为43 000,占总蛋白的39.3%,表达产物主要为包涵体。纯化后的包涵体具有抗病毒的生物学活性,能抑制口蹄疫病毒（FMDV）增殖。     

不同品种猪IFN-α基因的克隆与序列分析

根据现有猪α干扰素(IFN-α)基因序列设计引物,应用PCR技术直接从肝组织基因组中扩增丹系长白和法系长白、英系大白和法系大白猪IFN-α基因。将克隆得到的特异性片段克隆入pGEM-TEasy载体中,转化感受态细胞JM109,运用蓝白斑筛选、质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性可疑菌株,并将筛选的阳性株进行测序。结果表明,得到了上述4个品系的猪IFN-α基因。核苷酸同源性均在97.2%以上,氨基酸同源性均在92.8%以上。     

梅花鹿IFN-β1基因的克隆与分子进化分析

根据GenBank中牛干扰素-β1(IFN-β1)基因序列(E00137),设计并合成了1对引物,以梅花鹿肝脏组织DNA为模板,采用PCR技术扩增梅花鹿IFN-β1全基因,并克隆、测序。结果表明:梅花鹿IFN-β1基因全长561 bp,编码186个氨基酸,含有6个与二硫键形成有关的半胱氨酸,3个糖基化位点,成熟蛋白含有4个α螺旋,3个β折叠区,7个β转角。序列比较分析发现,梅花鹿IFN-β1基因序列与GenBank发表的23种IFN-β1基因核苷酸序列同源性为3.2%⁹1.1%,氨基酸序列同源性为21.9%91.1%,氨基酸序列同源性为21.9%⁷9.7%。梅花鹿与其他23种动物的IFN-β1基因序列分析和系统进化树分析表明,IFN-β1基因存在种属特异性。梅花鹿INF-β1基因的成功克隆,为进一步研究梅花鹿INF-β1基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。     

犬白细胞介素18基因的克隆与序列分析

为研究犬白细胞介素18(IL-18)的生物学功能,从犬外周血中分离白细胞,经Con A刺激后,提取总RNA,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增犬IL-18基因,连接pMD19-T simple vector,转化DH5α感受态细胞,经双酶切鉴定,获得阳性重组质粒后进行序列分析。结果表明,获得的犬IL-18基因全长为582bp,编码氨基酸194个。将犬与GenBank中牛、猫、羊、猪、鼠、兔、狐、貉IL-18基因进行同源性比较,发现犬IL-18与红狐和貉IL-18的同源性最高,氨基酸序列同源性分别达96.4%、91.2%,与其他物种则存在较大种属差异。     

犬链球菌保护性抗原基因的克隆与序列分析

犬链球菌(Streptococcus canis,Sc)属于Lancefield G 群链球菌,可感染牛、犬、猫等多种动物,偶尔可见感染人的报道.1986年,大链球菌最早于由Devriese 等从奶牛和犬中分离出.     

新兴猪IFN-α成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据NCBI GenBank上登录的猪IFN—α基因序列设计了1对引物，应用PCR技术直接从3周龄新兴猪肝细胞中扩增出了约500bp的基因片段；将该片段克隆到pMD 18-T载体，经PCR、酶切及序列测定，该克隆片段由501个核苷酸组成，共编码166个氨基酸，与NCBI GenBank上登录的2个猪IFN—α基因序列(登录号为M28623和X57191)比较，核苷酸的同源性分别为99．4％和99．2％。     

犬源贾第虫β-贾第素基因的克隆及序列分析

为了鉴定犬源贾第虫佛山分离株的基因型,根据GenBank中登录的贾第虫β-贾第素(bg)基因序列(X85958),设计2对引物GF1/GR、GF2/GR,采用套式PCR方法从贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段;将扩增产物纯化并连接到质粒载体pMD18-T,克隆转入感受态细胞JM109,挑选阳性克隆测序,然后进行序列分析。结果显示,犬源贾第虫bg序列长为384 bp,与预期目的片段一致;分子进化树表明该犬源贾第虫分离株为蓝氏贾第虫D型。该基因型在我国为首次报道,为贾第虫的分子鉴定以及分子遗传学研究奠定了基础。     

水貂IFN-β基因的克隆与原核表达

从水貂基因组中通过PCR方法克隆得到β干扰素基因(IFN-β),将IFN-β成熟肽插入原核表达栽体pET32a,在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达重组蛋白.结果表明,IFN-β片段长561 bp,与已报道的水貂IFN-β基因相比较同源性为100%,IFN-β成熟肽可编码179个氨基酸.重组质粒经ITPG诱导6 h后蛋白表达产物较高,表达量占菌体表达量的50%,分子质量约为34 ku,与预期结果相符.     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

犬冠状病毒小膜蛋白基因的分子克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒(CCV)V1株和DXMV株小膜蛋白(SM)基因进行了克隆和序列测定.用RT-PCR对分离的CCV V1和DXMV野毒株SM基因进行了扩增,并将其克隆到pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果两毒株SM基因ORF全长均为246bp,编码82个氨基酸;与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1 SM基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为100%、92.1%和100%、90.9%.DXMV株与Insavc-1株SM基因相比有9个碱基发生了改变,导致4个氨基酸发生变化.对冠状病毒科中不同的冠状病毒SM基因及其推导的氨基酸序列聚类分析表明,冠状病毒可分为4个群,群内不同冠状病毒SM基因及其蛋白显示出很高的同源性,而不同群之间的同源性却较低.