浅谈猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由其病毒(PRRSV)引起的养猪业的重要传染病。研究发现在病毒GP5蛋白的外功能区找到一个线性中和表位(B表位)和一个线性非中和表位(A表位),且A表位会阻滞或降低机体对B表位的免疫应答,延迟中和抗体的产生。此外,B表位上及其周围的糖基化位点也掩盖了其部分免疫原性,降低了机体对其的反应。研究表明,B表位不是中和表位,并且中和抗体在防控PRRSV感染中发挥着重要作用。文章综述了中和抗体的保护作用、中和表位和糖基化作用等方面的研究进展。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒延边地方株GP4结构基因分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)易引起基因变异现象,使得异地疫苗不能有效控制本地区猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的发生.为研制适合本地区的亚单位疫苗,参照GenBank中已发表的PRRSV序列设计了1对特异性引物,对吉林省延边地区分离株YB-0605 GP4基因进行了序列扩增和测序,序列分析结果表明,PRRSV YB-0605株GP4氨基酸序列与CH-1α、HEB1株氨基酸序列高度一致,而与VR-2332、BJ-4株有一定差异,和LV株在N端及中心区具有很大差异,YB-0605株GP4蛋白抗原性及亲水性与河北省株具有较高相似性;与VR-2332株相比,GP4蛋白在第30 ～40位氨基酸处抗原表位形态发生较大变化,在第50位氨基酸处抗原表位优势增强现象.     

PRRSV N与GP5蛋白抗原表位的串联表达及其间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立基于N与GP5蛋白抗原表位串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体ELISA检测方法,为开发准确、廉价的PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。【方法】将PRRSV的N蛋白和GP5蛋白抗原表位串联优化后进行原核表达,以表达的目的蛋白为抗原,通过优化反应条件建立检测PRRSV抗体的ELISA方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的间接ELISA方法和商品化IDEXX试剂盒同时对临床送检的45份猪血清样品进行检测,计算其符合率。【结果】SDS-PAGE和Western Blot分析表明,表达的目的蛋白分子质量约为24.7ku,具有良好的生物学活性,且为可溶性表达。目的蛋白经纯化后作为抗原包被ELISA平板,建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,优化后的ELISA条件为:抗原(纯化后的目的蛋白)包被量为5μg/mL、一抗(猪血清)1∶80稀释、酶标二抗1∶5 000稀释,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃孵育60min,抗体(一抗和酶标二抗)于37℃孵育90min,TMB避光显色8min;间接ELISA的判定标准为:OD450≥0.345 2为阳性,OD4500.345 2为阴性。所建立的间接ELISA方法特异性强,对猪常见病原,如猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒高免血清检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为1.02%~3.94%和1.38%~4.83%。用所建立的间接ELISA方法对临床送检45份猪血清样品的检测阳性率为84.44%(38/45),商品化IDEXX试剂盒检测的阳性率为80%(36/45),2种方法的符合率为94.73%(36/38)。【结论】成功建立了基于N与GP5蛋白抗原表位串联的PRRSV抗体ELISA检测方法。     

2006～2012年猪繁殖与呼吸综合征病毒东北毒株GP5和M基因变异分析

分离鉴定三株中国东北地区PRRSV,对其主要结构蛋白GP5和M基因RT-PCR扩增和测序,同时对2006～2012年东北地区PRRSV毒株进行遗传变异分析.结果表明,三株东北地区PRRSV分离株均属于美洲型高致病性毒株,JilinTN2株和HH12株可能由JXA1变异而来,GP5基因变异较大,而M基因相对保守;一些氨基酸变异会改变GP5和M蛋白的二级结构;GP5蛋白中和表位Q40和L41的突变和诱骗表位L28的新突变在2011和2012年黑龙江省PRRSV毒株中被发现,33～37 aa处氨基酸的变异对潜在糖基化位点的数量和位置影响较大,可能会干扰中和抗体对紧随其后的中和表位识别,减少病毒中和抗体应答;GP5中PRRSV毒力关键住点的新突变在2012年分离株中被发现.文章揭示东北地区PRRSV流行毒株GP5基因的变异特征,PRRSV仍在不断发生变异,需针对GP5基因变异采取相应防控措施.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)的单克隆抗体,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)GP5重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和NS0浆细胞瘤细胞进行融合,经间接ELISA和阻断ELISA筛选、有限稀释法克隆化获得3株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的(mAb)杂交瘤细胞株,命名为4B7、2C5和2E4。间接免疫荧光(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)结果显示,3株mAb均与感染PRRSV BJ 4株的Marc 145细胞特异性反应,表明其可识别天然病毒蛋白。mAb的Ig亚类均为IgG1,细胞培养上清和腹水的ELISA效价分别为1∶256和1∶51 200,Western blot分析表明,mAb均特异性识别PRRSV GP5蛋白。     

MS2噬菌体介导展示猪繁殖与呼吸综合征病毒线性表位的嵌合纳米颗粒制备及免疫原性

【目的】以MS2噬菌体外壳蛋白为载体,构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白上线性表位的嵌合纳米颗粒,并研究其免疫原性,为猪繁殖与呼吸综合征病毒或其他病毒表位展示提供新的方法和思路。【方法】利用重叠延伸PCR将GP5上优势线性表位基因序列插入到MS2噬菌体外壳蛋白基因上,构建重组载体,通过原核表达系统表达嵌合蛋白,目的蛋白经过硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析纯化,用动态光散射和电镜对嵌合蛋白进行物理表征,通过蛋白印迹和动物免疫试验研究表位嵌合颗粒的免疫原性。【结果】成功将线性表位基因插入MS2噬菌体外壳蛋白基因,嵌合蛋白在原核表达系统中以水溶性表达,目的蛋白经过纯化,纯度达85%以上。嵌合蛋白在体外自组装形成了均一的、直径为25～31 nm的嵌合表位纳米颗粒,该嵌合颗粒免疫动物后,产生可以和灭活病毒反应的高水平抗体,具有良好的免疫原性。【结论】MS2噬菌体外壳蛋白可以耐受9个外源多肽(猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5上线性表位)的插入,在体外自组装形成嵌合病毒样颗粒。该颗粒将外源多肽高密度展示在表面,免疫动物可产生针对该表位的抗体。该技术可为猪繁殖与呼吸综合征病毒其他表位或更长串联表位的展示奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 蛋白的结构与功能研究进展

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV引起的一种高度接触性传染病。作为一种RNA病毒,PRRSV的基因组存在广泛变异,其中以NSP2和ORF5基因变异为主。由于不同谱系毒株的ORF5有特征性的核苷酸序列,因此ORF5可用于PRRSV的分型。ORF5编码GP5蛋白,GP5蛋白含有多个表位,可与细胞受体作用,从而影响病毒的感染、复制。近年来,关于PRRSV的分子流行病学调查倾向于揭示不同毒株所特有的氨基酸突变。这些突变通常发生在GP5蛋白的信号肽编码区、非中和表位、中和表位和跨膜区。因此有研究将这些突变数据与病毒的毒力强弱、中和能力关联起来。而研究者尝试通过突变来推测GP5蛋白的构象或功能改变,从蛋白互作的结构基础层面来解释这种联系。由于GP5的三级结构并不能用传统的高分辨率冷冻电镜以及X射线晶体学方法观测,因此生物信息学方法成为相关研究的唯一选择。此外,GP5可用于基因工程疫苗的研制。综述了近年来关于GP5蛋白的生物信息学研究,并总结了GP5蛋白对病毒感染、复制、毒力、...     

PRRS吉林株GP5基因序列测定与分析

PRRSV易引起基因变异现象,使得异地疫苗不能有效地控制本地区PRRS的发生。为研制适合本地区的亚单位疫苗,试验参照GeneBank中已发表的PRRSV序列设计了1对特异性引物,对吉林分离株JL-0605对GP5基因进行了序列扩增和测序,序列分析结果表明,PRRSV JL-0605株GP5氨基酸序列与CH-1α和HEB1株氨基酸序列高度一致,而与VR-2332和BJ-4株有一定的差异,和LV株在N端及中心区具有很大的差异,JL-0605株GP5蛋白抗原性及亲水性与中国河北株具有较高的相似性;与VR-2332株相比,30～40位氨基酸处抗原表位形态发生较大变化,在135～145位氨基酸处抗原表位优势增强现象。     

C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位对PCV2 VLPs稳定性的影响

【目的】利用大肠杆菌原核表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及在其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap嵌合蛋白,对Cap蛋白形成的病毒样颗粒(VLPs)的稳定性、免疫原性以及C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位VLPs的热稳定性进行研究,为猪圆环病毒2型(PCV2)VLPs疫苗的高效制备及基于Cap VLPs纳米骨架展示技术嵌合疫苗的开发奠定基础。【方法】采用分子生物学方法合成PCV2b型强毒株ZJ的cap基因,在其C-端插入PRRSV T细胞抗原表位T1、T2、T3、T4、T5,构建cap-T1～cap-T5基因;将cap及cap-T1～cap-T5基因与pET28a表达载体连接,构建重组表达载体,转染大肠杆菌ClearColi^TMBL21(DE3)进行诱导表达,并对表达产物的热稳定性及免疫效果进行检测。【结果】实现了Cap蛋白及其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap-T1、Cap-T2、Cap-T3、Cap-T4和Cap-T5嵌合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,并成功观察到了VLPs;表达产物热稳定性分析显示,在60℃处理30 min条件下,Ca...     

1株PRRSV类NADC30毒株的分离鉴定及序列分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的变异情况,将PRRSV阳性病料处理后接种Marc-145细胞,成功分离到1株PRRSV毒株,将其命名为HENZXC-4,并对其全基因组序列进行测定和分析。结果表明,HENZXC-4为未发生重组的类NADC30毒株,其NSP2蛋白存在131个氨基酸不连续缺失,且其GP5蛋白存在1个氨基酸插入。     

Virus Location and Lymphocyte Apoptosis in Lymph Nodes of Piglets Infected with PCV-2

The present study has been performed to understand the location of the virus, type of apoptotic cells, and their relation to lymph nodes of piglets infected with porcine circovirus type Ⅱ （PCV-2）. Nine 32-day-old conventional piglets free of infection with PCV-2 were used, and distributed into three groups： control group （n = 3）, piglets inoculated with PCV-2 alone （PCV-2, n = 3）, and PCV-2 inoculated and KLH immunostimulated group （PCV-2 ＋ KLH, n = 3）. Superficial inguinal lymph nodes from all piglets were collected for histological examination after 32 days postinoculation, and immunohistochemistry for PCV-2 detection. Location of apoptotic cells was detected with TdT-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and cell cycle, and the apoptotic rates were measured by flow cytometry. The characteristic histopathological lesions of the piglets in PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH were lymphocyte depletions in the cortex and paracortex of the lymph nodes, epithelioid-like macrophage infiltration, and intracytoplasmic inclusion bodies presented in epithelioid-like macrophages. PCV-2 was mainly found in epithelioid-like macrophages by immunohistochemistry. In the lymph nodes, lymphocytes presented higher apoptotic rates in the cortex by TUNEL, special B-cell areas, and similar apoptotic cells were found in this compartment in the control. The apoptotic rates of the lymph nodes were 0.41, 3.34, and 4.88% in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH groups by flow cytometry, respectively. The apoptotic rates of lymph nodes for PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH piglets were significantly higher than those for the control group （P〈0.05 and P〈0.01）. The proliferation index （PI） was 0.17_＋0.01, 0.12_＋0.01 and 0.12_＋0.04 in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH group, the PI of the control group was higher than that of the other groups, but without the statistical difference. PCV-2 can induce lymphocyte depletion in lymph nodes of piglets by blocking cell proliferation and promoting apoptosis. This is one o     

不同温度LED光萎凋对铁观音MEP上游关键基因和香气的影响

【目的】萜类化合物是乌龙茶挥发性芳香物质的重要组分,2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径(MEP)上游关键基因直接参与调控萜类化合物前体物质的合成。而乌龙茶香气的形成与萎凋工序密切相关,光照和温度是影响萎凋的重要因子,探讨LED光与温度在乌龙茶萎凋过程中对香气的影响,为提高乌龙茶萎凋叶香气品质提供参考。【方法】基于转录组数据,根据KEGG筛选出响应光照的MEP上游关键基因(DXS、DXR、HDS、HDR)。对一芽三叶铁观音鲜叶进行LED白光和不同温度(20℃(L20)、25℃(L25)、30℃(L30)、35℃(L35)和40℃(L40))萎凋处理,黑暗下温度(20℃(D20)、25℃(D25)、30℃(D30)、35℃(D35)和40℃(D40))萎凋处理;分别测定铁观音萎凋叶的香气组分和MEP上游关键基因的相对表达量。【结果】L30处理萎凋叶各基因表达量达到最大值,萜类基因(DXS、DXR、HDS、HDR)表达量分别为XY组(对照)的4.31、5.28、11.77、1.59倍,为D30处理的2.24、2.39、1.86和1.60倍。D30组各基因表达量为黑暗处理组最大,依次为XY...     

丙草胺与4种磺酰脲类除草剂混用对稻苗安全性的影响

室内测定了丙草胺分别与磺酰脲类除草剂甲磺隆、苄嘧磺隆、醚磺隆和吡嘧磺隆混用后，一叶一心期稻苗抑制50％株高的使用浓度(IC50)和抑制10％株高的使用浓度(IC50)，并用共害系数(CHC)对混用组合安全性的联合作用进行了评价．结果表明：所有混配处理的CHC10均小于12．0，表现出强烈的解毒效应；不同混用处理的CHC50值差异很大，丙草胺与甲磺隆混用的CHC50均小于25．0，解毒效应显著．丙草胺与苄嘧磺隆混配的CHC50为26．1—167．8，丙草胺与苄嘧磺隆混用的CHC50为52.2—115.5，丙草胺与醚磺隆混用的CHC50为80．0—110．2．     

不同阶段肉仔鸡能量需要模型的建立

试验研究了0~8周龄肉仔鸡胴体与羽毛蛋白、脂肪的生长曲线及0~3、4~6和7~8周龄3个阶段每日摄入不同水平的能量及蛋白对其体蛋白、体脂肪沉积的影响,旨在确定胴体与羽毛蛋白、脂肪动态的沉积规律及日粮能量沉积为体蛋白及体脂肪的效率。试验1,包括3个饲养试验分别选取体重相近的0、21和42日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡324只,按性别及日粮随机分为18个处理,每处理3个重复,每重复6只鸡。肉仔鸡每日限量饲喂,饲喂水平分别为正常采食量的90%、70%和50%,每日定量供给肉仔鸡高、中、低3个水平的高蛋白质基础日粮及由饲喂水平决定的定量淀粉,进而使肉仔鸡每日采食能蛋质量比(代谢能/粗蛋白)不同的9种日粮;试验2,选取体重相近的0日龄AA肉仔鸡144只,按性别不同随机分为2个处理,每处理4个重复,每重复18只鸡。试验初和试验末分别进行屠宰,以测定肉仔鸡胴体和羽毛蛋白、脂肪和干物质含量。结果显示:1)Gompertz方程能很好的拟合不同性别肉仔鸡蛋白和脂肪的生长,不同性别间蛋白和脂肪极限重量、羽毛蛋白和脂肪的生长速率差异显著(P<0.05),而胴体蛋白和脂肪的生长速率差异不显著(P>0.05)。2)在0~3、4~6和7~8周...     

ICP-OES法同时测定果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡含量

果蔬样品经混酸消化后,控制一定的酸度,定容后应用等离子体发射光谱法(ICP-OES)对果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡六种有害重金属进行测定,研究了分析测定条件,方法简单快速。测定结果表明,五种元素的加标平均回收率在91.0%~107%之间。其RSD均小于3.5%。按该方法进行处理及测定铅、砷、镉、铬、铜、锡,在选择的测定条件下最低检出限分别为0.0006 mg/kg、0.0003 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.00005 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.0006 mg/kg。     

不同授粉组合对‘富士’和‘新红星’苹果品质的影响

【目的】探讨不同授粉品种对苹果品质和香气物质成分差异的影响,为高效授粉树的选育和苹果品质的提高提供依据。【方法】采用自育高效授粉树‘红菱’‘红锦’‘红雾’的花粉,在‘富士’(Malus domestica‘Fuji’)、‘新红星’(M.domestica‘Starkrimson’)铃铛花期进行授粉,以授‘嘎拉’(M.domestica‘Gala’)花粉的果实为对照,对果实发育期间总类黄酮含量的变化进行研究,并在果实成熟时测定可溶性固形物、花色苷含量等品质指标及香气物质成分。【结果】不同的授粉品种条件下,‘富士’和‘新红星’苹果除可滴定酸外的各项品质指标均高于对照。‘富士’苹果经‘红菱’授粉后,其果形指数、硬度、花色苷、可溶性糖含量显著提高,分别为对照的1.12、1.15、1.28、1.12倍。‘新红星’苹果经‘红雾’授粉后,其单果重、果形指数、花色苷、可溶性固形物、可溶性糖含量均显著提高,分别为对照的1.22、1.12、2.48、1.10、1.11倍,其可滴定酸含量显著降低,仅为对照的75%。在果实发育的整个生长期内,不同授粉品种处理的‘富士’和‘新红星’苹果总类黄酮含量均高于对照,且不同品种间存在显著差异。在花后160 d,‘富士’经‘红菱’‘红锦’‘红雾’花粉授粉后,果实内总类黄酮含量与对照相比分别增长19.63%、28.72%、13.97%,‘新红星’在花后120 d分别增长14.18%、15.26%、4.24%,差异显著。‘红菱’‘红雾’‘红锦’和对照授粉处理的‘富士’和‘新红星’苹果总酯类挥发性物质的相对含量分别为50.20%、52.03%、42.68%、45.10%和71.08%、68.85%、71.83%、66.03%,‘红菱’授粉后‘富士’‘新红星’果实总酯类挥发性物质含量明显增加,其中2-甲基丁酸乙酯的含量分别为对照的1.14和203.91倍。‘富士’苹果中,‘红菱’‘红雾’‘红锦’授粉处理的果实乙酸-2-甲基丁酯的含量分别为对照的1.73、1.07、1.36倍;其己酸乙酯和乙酸丁酯的含量分别为对照的1.09、1.12、1.29倍和1.50、0.77、1.30倍。而在‘新红星’苹果中,经‘红菱’‘红雾’‘红锦’授粉后,乙酸-2-甲基丁酯和己酸乙酯的含量分别为对照的1.82、1.27、0.93倍和2.57、1.15、0.27倍;乙酸丁酯的含量分别为对照的7.83、3.48、3.30倍。此外,‘富士’和‘新红星’苹果经‘红菱’授粉后,其烃类物质含量明显高于对照,主要表现为法呢烯的增多。【结论】高效授粉树能显著提高‘富士’和‘新红星’苹果的外观和内在品质,并且与对照存在显著差异。不同授粉组合对‘富士’和‘新红星’苹果品质影响差异较大,经‘红菱’授粉,‘富士’和‘新红星’苹果品质有显著提高。     

Characterisation of Neonicotinoid and Pymetrozine Resistance in Strains of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from China

Four strains of the Q biotype and one of the B biotype of the whitefly Bemisia tabaci collected from China were characterised for resistance to four neonicotinoid insecticides and pymetrozine. Q biotype strains showed moderate to strong resistance to imidacloprid, thiamethoxam and acetamiprid, but little or no cross-resistance to dinotefuron. Resistance to neonicotinoids was consistently associated with resistance to pymetrozine, despite the latter having a distinct (though unresolved) mode of action. The single B biotype strain proved largely susceptible to all the insecticides investigated. Resistance in the Q biotype strains was associated with over-expression of a cytochrome P450 monooxygenase gene, CYP6CM1, whose substrate specificity presumably accounts for the observed cross-resistance profiles.     

贵州山区做好玉米区域试验的经验与方法

玉米区域试验是在不同生态条件下,对新育成品种的丰产性、稳产性、抗逆性、适应性及品质性状等进行全面鉴定和综合评价的中间环节,是新育成品种能否通过审定推广的重要过程,是农业科研与农业生产的重要纽带,是新品种是否能在本地区推广应用的科学依据,做好玉米区域试验事关重大.     

夹竹桃目植物新资料

本文根据国内外模式标本和文献资料,将亚洲、美洲和大洋洲夹竹桃目植物进行了部分整理和研究,对该目夹竹桃科和萝摩科18属37种作了订正,其中有11种分布新记录,17个新异名,建立15个新名称和1个新组合.     

氮、磷、钾、硼肥施用对甘蓝型杂交油菜产量及经济效益的影响

 【目的】指导当前生产条件下江西油菜测土配方施肥技术的推广。【方法】2008—2009年在江西省设置12个田间试验,研究氮、磷、钾和硼肥施用对甘蓝型杂交油菜产量及其相关性状的影响,并对施肥经济效益进行分析。【结果】氮磷钾硼肥配施处理(NPKB)平均产量为2 015 kg?hm-2,与不施肥相比,NPKB、缺B(NPK)、缺P(NKB)、缺K(NPB)和缺N(PKB)分别增产1 121、839、758、746和249 kg?hm-2;NPKB配施处理下各主要经济性状表现较好,有利于对N、P、K、B素的吸收利用;效益分析表明,NPKB配施效益达到5 449.5元/hm2,比不施肥增收2 231.1元/hm2,其次是缺B(NPK)、缺P(NKB)、缺K(NPB),分别比不施肥增收1 298.4、1 280.7和1 541.1元/hm2,而不施氮肥的处理减收206.1元/hm2。【结论】NPKB配施对甘蓝型杂交油菜增产、增收效果显著,是保证高效生产的技术关键。