苹果树腐烂病拮抗细菌菌株BJ1的鉴定及其抑菌作用

为开发对苹果树腐烂病有效的生防措施,对从山东栖霞苹果果园根际土壤中分离的63株细菌进行了筛选,获得有显著拮抗作用的菌株BJ1。采用玻片法和对峙培养法测定BJ1对苹果树腐烂病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用及其抑菌谱,根据菌株BJ1的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列对其进行鉴定,并用离体枝条烫伤接种法对腐烂病的防效进行测定。菌株BJ1对腐烂病菌的抑制率为78.38%,其发酵滤液的抑菌率达到70.54%;BJ1可显著降低腐烂病菌分生孢子的萌发率,致使菌丝畸形、分支增多及细胞质外渗;该菌株对常见的8株果树病原真菌具有显著的拮抗作用。经鉴定,菌株BJ1属于微嗜酸寡氧单胞菌Stenotrophomonas acidaminiphila。BJ1不同稀释倍数的发酵滤液均对苹果树腐烂病有明显的抑制作用,其稀释50倍发酵滤液的防效仍可达81.06%,表明该菌株具有良好的生防潜力。     

苹果树腐烂病内生拮抗放线菌A-2的鉴定及其活性评价

以苹果树腐烂病菌Valsa mali为靶标菌,从健康苹果树枝条中获得一株高效内生放线菌A-2。采用生长速率法、对峙培养法和玻片法测定了菌株A-2的抑菌谱及对苹果树腐烂病菌菌丝生长和孢子萌发的影响;利用离体枝条烫伤接种法测定了菌株A-2对腐烂病的防治效果。结果表明:A-2发酵滤液对腐烂病菌的抑制率达90%以上,对其他9种常见的植物病原真菌也具有良好的拮抗作用;菌株A-2可导致腐烂病菌菌丝畸形、分支增多和局部膨大;不同稀释倍数的A-2发酵滤液对苹果离体枝条腐烂病均有明显的防效,接种病原菌前后24 h和同时施用500倍发酵滤液的防效均达70%以上。根据培养特征、生理生化特性和16S rDNA 序列分析,将菌株A-2鉴定为卡伍尔链霉菌Streptomyces cavourensis。     

七株植物内生放线菌对苹果树腐烂病的防治作用

通过分生孢子萌发试验、菌丝抑制试验、接种离体枝条试验及田间病斑涂抹药剂防治试验,研究了7株植物内生放线菌对苹果树腐烂病的防治效果。结果表明,7株植物内生放线菌无菌发酵滤液对病原菌分生孢子萌发及菌丝生长均有明显的抑制作用,2倍稀释液对孢子萌发抑制率均达85%以上,20倍稀释液对菌丝生长抑制率均达80%以上。显微观察发现,Hhs.015 (BAR1-5)菌株无菌发酵滤液可导致病菌芽管、菌丝畸形。在人工接种条件下,无菌发酵滤液原液对离体枝条病斑扩展具有明显的抑制作用,其中AR1-14、Hhs.015 (BAR1-5)和TGYXCSA-7处理5天后防治效果分别达83.2%、69.7%和85.6%。田间刮除病斑后涂抹放线菌发酵原液也可明显抑制病斑复发,防效均达80%以上。     

一株沙福芽胞杆菌ZG6的筛选、鉴定及其对茶树轮斑病的生防潜力研究

轮斑病是茶树生产上的重要病害,造成茶叶产量和品质重大损失。为获得有效防治茶树轮斑病的生防菌株,从合肥茶园茶树根部组织中分离筛选到一株对茶树轮斑病菌具有较强拮抗活性的内生细菌ZG6。对峙培养条件下,该菌株对茶树轮斑病菌的菌丝抑制率可达65.38%。基于菌落形态、生理生化特征、16S r RNA和gyr B基因的序列分析,将菌株ZG6鉴定为沙福芽胞杆菌Bacillussafensis。菌株ZG6具有广谱抑菌能力,对油菜菌核病菌、玉米小斑病菌和苹果腐烂病菌表现出较强的抑制效果,抑制率分别为78.82%、64.71%和61.82%。酶学试验结果表明,菌株ZG6在代谢过程中可产生纤维素酶和蛋白酶。茶树离体枝条叶片防效试验结果表明,菌株ZG6的发酵液、无菌发酵滤液与菌液均对茶树轮斑病有预防和控制效果,在茶树离体枝条的叶片上的防效可达69.9%以上。由此可见,沙福芽胞杆菌ZG6具有作为防治茶树轮斑病生防菌剂研发的潜力。     

5种矿物源药剂对苹果树腐烂病菌室内防效评价

为了筛选高效低毒且对苹果树腐烂病防效较佳的矿物源农药,本试验采用菌丝生长速率法、玻片孢子萌发法和离体枝条烫伤接种法,测定了5种矿物源药剂对苹果树腐烂病菌菌落生长和分生孢子萌发的抑制作用,以及其在离体枝条上的防治效果。结果表明,5种矿物源农药对苹果树腐烂病菌菌落的生长和分生孢子萌发均具有显著的抑制作用,当70%腐植酸钠GR、77%氢氧化铜WP、80%波尔多液WP、86.2%氧化亚铜WG和77%硫酸铜钙WP质量浓度分别为5、257、400、123和385μg/mL时,其对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制率分别为97.55%、97.67%、98.94%、95.48%和98.43%,其EC_(50)分别为2.60、71.15、159.60、77.40和95.73μg/mL;对苹果树腐烂病菌分生孢子萌发的抑制率分别为96.33%、97.67%、98.67%、91.01%和95.58%,其EC_(50)分别为1.38、69.3、145.41、65.48和102.98μg/mL。离体枝条防效测定表明,5种矿物源农药中70%腐植酸钠GR对苹果树腐烂病防效最佳,为86.83%。因此,腐植酸钠可作为防治苹果树腐烂病的最佳矿物源农药。     

梨火疫病和梨腐烂病生防潜力粘细菌的筛选鉴定及室内防效评价

梨火疫病和梨腐烂病是当前香梨生产中的2大重要病害。为开发防治梨火疫病和梨腐烂病的生防资源,本研究以从新疆各地州土壤样品中分离获得的粘细菌菌株为材料,采用菌苔共培养测定比较粘细菌菌株对梨火疫病菌Erwinia amylovora的捕食性能,平板对峙法测定粘细菌菌株对梨腐烂病菌Valsa pyri的菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用,从中筛选出对梨火疫病菌和梨腐烂病菌具有较好捕食功效和抑菌活性的菌株。通过离体叶片和枝条试验、盆栽试验评价其防效,并利用形态学和分子生物学方法对生防潜力粘细菌菌株进行鉴定。结果表明,筛选出的6个粘细菌菌株对梨火疫病菌具有较好捕食功效,捕食后梨火疫病菌活菌数显著降低,由初始的10⁹降低至10²～10⁵cfu/m L;同时对梨腐烂病菌具有较好的抗菌活性,对菌丝生长和分生孢子萌发的抑制率分别达到70%和87%以上。综合香梨离体叶片和杜梨苗上的试验结果,菌株NST12和NST47在对梨火疫病的保护性和治疗性防效均大于75%;NST47和NST49菌株在香梨离体枝条上对梨腐烂病的保护性和治疗性防效分别达到了7...     

苹果树皮内生真菌的分离及其对腐烂病的生物防治潜力

为了明确苹果树皮中内生真菌的种类及其对苹果树腐烂病菌的抑制作用,对25年生富士苹果健康树皮中的内生真菌进行了分离和初步鉴定,并通过室内抑菌试验和田间保护作用试验测定其内生真菌对苹果树腐烂病菌的抑制作用。分离到的126株内生真菌分属于13个属,主枝中分离到的内生真菌的种类和数量较多;对峙试验中对苹果树腐烂病菌的抑菌率在40%以上的有24株,其中87.5%的菌株为链格孢属真菌。Al 6的培养滤液对腐烂病菌菌丝生长抑制作用较强,抑制率为83.76%;Al 58对其孢子萌发抑制作用较大,抑制率为82.42%;Al 67产生的挥发物质对腐烂病菌菌丝生长的抑制作用较大,为24.41%。田间试验结果显示,用拮抗性内生真菌预先占位接种苹果树枝干,能有效抑制腐烂病菌的侵入和病斑的扩展,Al 107的抑制作用最强。     

解淀粉芽胞杆菌YU-1对水稻纹枯病的防治作用

本文旨在筛选对水稻纹枯病有生防作用的菌株,并初步探索其生防作用机理。收集水稻、甘蓝、黄瓜等不同植物根际土壤,采用稀释分离和对峙培养法筛选对水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani Kühn有抑菌作用的菌株;通过离体接种防效、盆栽防效、抑菌谱、对水稻纹枯病菌菌核萌发及形成的抑制作用等方面评价其生防潜力,并对生防菌株进行鉴定。结果表明,从采集的37份根际土壤中共分离获得细菌297株,其中4株对纹枯病菌具有较好的拮抗作用,菌株YU-1对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制率达89.8%;对西瓜枯萎病菌、草莓灰霉病菌、番茄早疫病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌菌丝生长的抑制率均在85%以上;对水稻纹枯病的离体和盆栽防效分别为73.1%和66.3%;对水稻纹枯病菌菌核萌发的抑菌率在92%以上;经生理生化和分子鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。由此可看出,菌株YU-1对水稻纹枯病的防治具有较强的应用价值,具有进一步开发成生物农药的潜力。     

生防放线菌ZZ-9耐药菌株的微波诱变选育

为了获得耐甲基硫菌灵的菌株, 采用微波诱变法对放线菌ZZ-9菌株进行0～75 s的处理,筛选出在甲基硫菌灵致死浓度下仍能较好生长的突变菌株,并测定其对苹果树腐烂病菌拮抗性和传代稳定性的影响,选育出性能优良的耐药菌株,与甲基硫菌灵协同作用进行防治苹果树腐烂病试验。结果表明,在微波辐照15～60 s条件下,获得4株耐70 μg·mL^-1甲基硫菌灵的突变菌株ZZ-9A、ZZ-9B、ZZ-9C和ZZ-9D。通过对4株突变菌株进行抑菌率和传代稳定性测定,筛选出一株抑菌率较好且传代稳定的突变菌株ZZ-9B。菌株ZZ-9B与70 μg·mL^-1甲基硫菌灵协同作用测定表明,当菌株ZZ-9B与甲基硫菌灵配比为8∶2时,在离体枝条上对苹果树腐烂病的协同防效为89.42%,明显高于单独使用突变菌株和甲基硫菌灵的防效。因此,在使用菌株ZZ-9B来防治苹果树腐烂病时,添加少量的甲基硫菌灵,可显著提高防效。     

链霉菌XG40的鉴定及其对琯溪蜜柚黑斑病的防效

为筛选出对琯溪蜜柚黑斑病菌有拮抗效果的生防菌株,本研究采用平板对峙法和牛津杯法分离筛选植物根际土壤放线菌,共分离纯化得到12株能够拮抗蜜柚黑斑病菌Phyllosticta citriasiana的放线菌菌株,其中菌株XG40对蜜柚黑斑病菌的拮抗能力最强,抑菌带宽度为16.3 mm。根据形态特征、生理生化特征以及16S rDNA、recA、rpoB、gyrB序列分析,将菌株XG40确定为小串链霉菌Streptomyces catenulae。抗菌谱试验结果表明,菌株XG40的发酵液对番茄叶霉病菌、蜜柚炭疽病菌、蜜柚黑点病菌等12种植物病原真菌和2种植物病原细菌也有较好的拮抗作用,抗菌性能广谱高效。菌株XG40对黑斑病菌的抑菌机制表现为受抑制菌丝发生畸变、粗细不均匀、大量断裂,其发酵液能使黑斑病菌孢子内含物消解并产生液泡。防效测定结果表明,菌株XG40发酵液对室内离体果实黑斑病的预防效果和治疗效果分别为83.52%和78.87%;对田间果实黑斑病的预防效果和治疗效果分别为78.91%和71.15%。因此,菌株XG40可作为防治蜜柚黑斑病的生防材料,具有良好的开发价值和应用前景。     

地肤子提取物对苹果树腐烂病菌的抑制作用及对其菌体结构和功能的影响

为开发新型安全高效的植物源苹果树腐烂病防治剂,采用菌丝生长速率法测定中草药地肤子乙醇提取物及各层析流分L1～L9对苹果树腐烂病菌Valsa mali的抑制作用,同时通过室内常规分析方法观测流分L7对该菌菌丝形态结构、细胞膜通透性及物质吸收和代谢的影响。结果表明,地肤子乙醇粗提物浓度为2 mg/mL时对苹果树腐烂病菌具有较强的离体抑制活性,处理后96 h的抑菌率达到92.16%。分别用石油醚、氯仿、正丁醇萃取醇提物,石油醚萃取物对苹果树腐烂病菌的抑制效果最为明显,其EC_(50)为0.07 mg/mL;在石油醚萃取物通过硅胶柱层析分离得到的9种流分中,流分L7对苹果树腐烂病菌的抑制作用显著,离体抑菌率高达96.73%;且在流分L7处理下,病菌菌丝体出现肿胀、膨大或畸形等现象,细胞膜通透性增大,可溶性蛋白、还原糖以及丙酮酸的含量随流分L7浓度的升高而持续降低,当浓度为100μg/mL时,菌丝体可溶性蛋白、还原糖及丙酮酸的含量分别降低70.78%、71.74%和78.68%。表明在离体培养条件下地肤子乙醇提取物能明显抑制苹果树腐烂病菌的生长,并对菌丝体细胞膜结构和功能稳定性产生显著影响,具有进一步开发为新型植物源苹果树腐烂病防治剂的潜力。     

梨和苹果腐烂病菌不同培养表型菌株的致病性分析

The pathogenicity of three strains (F-SD-8, F-BJ-2c-2 and F-HN-2a-1) of Valsa mali var. pyri causing pear canker and one strain (F-SX-A6) of V. mali var. mali causing apple canker in China were comparatively tested by wound inoculation on in vitro twigs of pear, apple and some other woody plants, and in vivo twigs of pear. Significant pathogenicity differentiation was detected in V. mali var. pyri. Generally strains F-SD-8 and F-BJ-2c-2 were highly pathogenic on pear although their culturing characteristics differed greatly. The strain F-SX-A6 was more aggressive on apple than on pear, and the strain F-HN-2a-1 showed significant lower pathogenicity on ten pear cultivars and other seven species of woody plants. Our results confirmed that two variants of V. mali had host preference and were also aggressive to crabapple, apricot, and peach besides apple and pear. Meanwhile, strains F-SD-8 and F-BJ-2c-2 could induce the formation of pycnidia on in vivo twigs of pear, which was not observed on in vivo twigs inoculated with F-HN-2a-1 and F-SX-A6.     

极长链霉菌SL01菌株抑菌活性物质的发酵条件优化和稳定性研究

为了获得极长链霉菌Streptomyces longissimus SL01菌株发酵的最佳培养基配方和发酵条件,采用单因素和正交试验法对SL01菌株的发酵液配方进行了优化,采用离体枝条和果实病斑抑制试验检测了其配方优化效果,并测定了SL01抑菌活性物质对温度、酸碱度和紫外光照射的稳定性。最终获得最佳发酵液的配方（质量分数）为:小米粉2%、酵母粉1%和MgSO4·7H2O 0.15%。以在28℃、初始pH 7.0、接种量2%、装液量50 mL/250 mL和转速180 r/min的条件下培养7 d得到的发酵液抑菌活性最强。采用优化的培养基配方发酵所得的SL01发酵液对苹果枝条和果实上的苹果树腐烂病的防效,分别比对照提高了39.86%和10.15%。所得发酵液在低于40℃、pH在6~10或紫外光照射12 h时,抑菌活性仍较为稳定。研究表明,通过培养基优化,可以显著提高SL01发酵产物的抑菌活性。     

GA1-2菌株的分离鉴定及其对香蕉尖孢镰刀菌的抑菌效果

为了从土壤中分离筛选对香蕉尖孢镰刀菌具有良好拮抗作用的放线菌,采用平板稀释涂布法从四川省会理县干热河谷小麦根际土壤中进行放线菌分离,并采用平板对峙法和孢子萌发法进行筛选,通过形态特征、培养特征、生理生化特征以及16S r DNA序列分析对筛选菌株进行鉴定。结果表明,从四川省会理县干热河谷小麦根际土壤筛选获得一株对香蕉尖孢镰刀菌4号生理小种Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4(FOC4)菌丝和孢子萌发都有很强抑制作用的菌株GA1-2,对FOC4菌丝和孢子萌发抑制率分别为36.34%和94.81%。菌株GA1-2与薰衣草灰链轮丝菌Streptoverticillium lavenduligriseum的亲缘关系最近,相似率达99.85%,且其形态特征、培养特征、生理生化特征也与薰衣草灰链轮丝菌基本相符,因此将菌株GA1-2初步鉴定为薰衣草灰链轮丝菌。     

一株生防内生真菌的分离筛选、鉴定及抑菌特性

为获取优良植物病害生防菌,以交链孢菌Alternaria tenuis Ness和尖镰孢菌Fusarium oxysporum Schlecht为指示菌,采用平板对峙培养法、抑菌圈法和菌落直径法对健康龙柏鳞叶小枝中分离的4株优势内生真菌进行了筛选评价,并结合形态学观察及ITS序列分析对筛选出的生防内生真菌进行了鉴定。结果表明,对峙培养发现1菌株对交链孢菌和尖镰孢菌均具有较好的抑制作用,抑菌率分别为52.05%和48.65%,标记其为LB-1;LB-1菌株与指示菌对峙培养的菌落交界面处,2种指示菌的菌丝均出现了消解、断裂,而LB-1的菌丝则生长正常。未灭菌LB-1菌株发酵液对交链孢菌和尖镰孢菌产生的抑菌圈直径分别为14.1 mm和13.7 mm,抑菌率分别为47.89%和48.72%;灭菌LB-1菌株发酵液对交链孢菌和尖镰孢菌的抑菌圈直径分别为15.3 mm和15.0 mm,抑菌率分别为5.96%和33.90%,指示菌在生长过程中菌丝溶解现象明显。经鉴定,LB-1菌株为毛壳菌属Chaetomium中的近缘毛壳菌C.subaffine,是一种极具生防潜力的内生真菌,其抑菌特性可能通过溶菌作用实现。     

苹果树腐烂病菌染色质重塑因子Vmles4的功能研究

染色质重塑因子INO80是一类由多亚基构成的遗传学调控因子，调控多种DNA代谢，在基因的表达中发挥着重要的调控功能。但其在苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中是否存在及其生物学功能并不清楚，为此，本研究从病菌基因组中分析鉴定到INO80的一个亚基基因Vmles4，利用qRT-PCR技术分析了Vmles4在病菌侵染过程中的表达模式，利用Double-joint PCR技术和PEG介导的原生质体转化方法进行了基因敲除，然后对3个突变体的营养生长及致病力进行测定和分析，并对病菌的非核糖体肽合成酶基因VmNRPS12及VmNRPS14在突变体中的表达进行定量分析。结果表明：Vmles4在侵染初期的表达显著上调，接种后6 h上调表达6.2倍。敲除突变体的生长速率平均降低28%且菌丝生长稀疏，在富士苹果品种（Malus domestic cv. Fuji）叶片和枝条上的致病力分别降低到22.5%和27.5%，VmNRPS12及VmNRPS14基因在Vmles4突变体侵染苹果枝条24 h后的表达量分别下调86.5%和50%；综上所述，Vmles4正调控腐烂病菌的营养生长、致病力以及次级代谢合成酶基因VmNRPS12和VmNRPS14的表达。     

苹果树腐烂病菌VmMFS1~VmMFS3基因的功能分析

为绿色持久防控苹果树腐烂病,该研究分析苹果树腐烂病菌Valsa mali的3个主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily,MFS）编码基因的氨基酸序列特征,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术分析这3个基因在苹果树腐烂病菌侵染阶段的表达水平,通过构建这3个基因的缺失突变体和回补菌株分析其在病原菌营养生长、致病力和非生物胁迫应答等方面的功能。结果表明,这3个基因的氨基酸序列均具有MFS保守结构域,将其命名为VmMFS1~VmMFS3; VmMFS1和VmMFS2的进化距离较近,均与VmMFS3的进化距离较远;在苹果树腐烂病菌侵染过程中VmMFS1~VmMFS3基因表达均显著上调;与野生型03-8菌株相比,VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的菌落形态无明显差异,但生长速度下降; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的致病力均显著降低; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体对H₂O₂胁迫的敏感性无明显变化,但对NaCl胁迫更敏感;基因回补后基因缺失突变体的表型缺陷能恢复到野生型菌株的水平。