猪乙型脑炎病毒在Vero细胞上的繁殖特性及其灭活疫苗的免疫原性研究

试验旨在对猪乙型脑炎病毒（JEV,SA14-14-2株）在传代细胞上的繁殖培养特性及其制备的灭活疫苗免疫原性进行研究,确定猪JEV在细胞培养瓶中培养的关键技术参数及其灭活疫苗的免疫原性。以Vero细胞培养病毒,通过接种时间、接毒量、吸附时间、吸附温度、维持液pH、维持培养温度及培养时间7个条件的优化,将繁殖的病毒液冻融一次,采用病毒蚀斑数测定方法测定病毒滴度。按照优化好的条件繁殖一批毒液,经β-丙内酯灭活,与双相佐剂混合,制备成猪乙型脑炎灭活疫苗。两次免疫（间隔14 d）接种乙型脑炎抗体阴性仔猪,首次免疫前（0 d）、免疫后第7、14、21、28、35、42天采集血清,检测血清中和抗体。二免后第28天进行乙型脑炎P3强毒的攻击,攻毒前（0 d）、攻毒后第1、2、3、5、7、9天采集血浆,攻毒后第14天剖杀免疫猪,采集脑组织,检测血浆和脑组织中JEV。结果显示,用细胞培养瓶进行培养,将Vero细胞培养至48 h进行病毒接种,接种量为1 000 PFU/mL,病毒吸附温度为37℃,吸附时间为90 min,吸附后用pH 7.6~8.8维持液继续培养,培养温度为35℃,培养96 h后收获毒液,冻融一次,可获得较高滴度的病毒。仔猪免疫制备的灭活疫苗后血清抗体水平迅速升高,血浆和脑组织中均未检测出JEV,免疫组试验猪能抵抗强毒攻击,可获得有效免疫保护。本试验结果为猪乙型脑炎疫苗的生产提供了参考依据。     

猪乙型脑炎病毒在Vero细胞上的繁殖特性及其灭活疫苗的免疫原性研究

试验旨在对猪乙型脑炎病毒(JEV,SA14-14-2株)在传代细胞上的繁殖培养特性及其制备的灭活疫苗免疫原性进行研究,确定猪JEV在细胞培养瓶中培养的关键技术参数及其灭活疫苗的免疫原性。以Vero细胞培养病毒,通过接种时间、接毒量、吸附时间、吸附温度、维持液pH、维持培养温度及培养时间7个条件的优化,将繁殖的病毒液冻融一次,采用病毒蚀斑数测定方法测定病毒滴度。按照优化好的条件繁殖一批毒液,经β-丙内酯灭活,与双相佐剂混合,制备成猪乙型脑炎灭活疫苗。两次免疫(间隔14d)接种乙型脑炎抗体阴性仔猪,首次免疫前(0d)、免疫后第7、14、21、28、35、42天采集血清,检测血清中和抗体。二免后第28天进行乙型脑炎P3强毒的攻击,攻毒前(0d)、攻毒后第1、2、3、5、7、9天采集血浆,攻毒后第14天剖杀免疫猪,采集脑组织,检测血浆和脑组织中JEV。结果显示,用细胞培养瓶进行培养,将Vero细胞培养至48h进行病毒接种,接种量为1 000PFU/mL,病毒吸附温度为37℃,吸附时间为90min,吸附后用pH 7.6～8.8维持液继续培养,培养温度为35℃,培养96h后收获毒液,冻融一次,可获得较高滴度的病毒。仔猪免疫制备的灭活疫苗后血清抗体水平迅速升高,血浆和脑组织中均未检测出JEV,免疫组试验猪能抵抗强毒攻击,可获得有效免疫保护。本试验结果为猪乙型脑炎疫苗的生产提供了参考依据。     

猪流行性腹泻病毒变异株CH/GX/750A/2015在Vero细胞上转瓶培养条件的优化试验

本研究旨在确定猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株CH/GX/750A/2015株在Vero细胞上转瓶培养的最佳条件,为大规模生产高效PEDV变异株疫苗提供技术支撑。试验以10 L转瓶培养病毒,对接毒时细胞维持液中胰酶浓度(0、2、4、6、8和10μg/mL)、细胞密度(40%、60%、80%、100%、200%)、接毒剂量(MOI分别为1、0.1、0.01和0.001)、吸附时间(0、30、60、90、120、240 min)、收毒时间(接毒后12、24、36、48、60、72 h)、维持培养温度(35、36、37和38℃)和转瓶转速(6、8、10、12、14、16 r/h)7个条件进行优化。结果显示,PEDV CH/GX/750A/2015株在10 L转瓶中的最佳培养条件为:细胞刚铺满单层时接毒,接毒量为MOI=0.01,维持液(无血清DMEM培养液)中胰酶质量浓度为6μg/mL,不需吸附,维持培养温度为37℃,12 r/h旋转培养48 h后收获病毒液可获得较高效价的病毒液,效价可稳定达到10~(6.50) TCID_(50)/0.1 mL。本试验为PEDV变异株大量培养提供了参考,为变异株疫苗研发奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒变异株CH/GX/750A/2015在Vero细胞上转瓶培养条件的优化试验

本研究旨在确定猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异株CH/GX/750A/2015株在Vero细胞上转瓶培养的最佳条件，为大规模生产高效PEDV变异株疫苗提供技术支撑。试验以10 L转瓶培养病毒，对接毒时细胞维持液中胰酶浓度（0、2、4、6、8和10 μg/mL）、细胞密度（40%、60%、80%、100%、200%）、接毒剂量（MOI分别为1、0.1、0.01和0.001）、吸附时间（0、30、60、90、120、240 min）、收毒时间（接毒后12、24、36、48、60、72 h）、维持培养温度（35、36、37和38 ℃）和转瓶转速（6、8、10、12、14、16 r/h）7个条件进行优化。结果显示，PEDV CH/GX/750A/2015株在10 L转瓶中的最佳培养条件为：细胞刚铺满单层时接毒，接毒量为MOI=0.01，维持液（无血清DMEM培养液）中胰酶质量浓度为6 μg/mL，不需吸附，维持培养温度为37 ℃，12 r/h 旋转培养48 h后收获病毒液可获得较高效价的病毒液，效价可稳定达到10^6.50 TCID₅₀/0.1 mL。本试验为 PEDV 变异株大量培养提供了参考，为变异株疫苗研发奠定了基础。     

3种细胞培养流感病毒的比较

将流感病毒分别接种于鸡胚成纤维细胞(CEF)、Vero和MDCK细胞,并改变细胞维持液中FBS浓度,然后检测胰酶的用量、细胞培养流感病毒的最佳时间、细胞接种病毒最佳吸附时间和接种剂量、收获细胞液后的血凝素(HA)滴度.结果表明,胎牛血清对病毒的繁殖有明显抑制作用;加入约4 μg/mL的胰酶可提高病毒产量.最佳收获时间为60 h～72 h,吸附时间为90 min,接种剂量为0.1 mL/L;CEF、MDCK细胞上病毒HA滴度高于Vero细胞.     

猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞中增殖规律的研究

通过孔板培养系统以及微载体和转瓶培养系统，研究了感染复数(MOI)、病毒感染时间(TOI)和病毒维持液对细胞生长和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)繁殖的影响。结果表明，MOI影响细胞生长速率和单位细胞病毒产量，TOI影响细胞对病毒的敏感程度以及胞内病毒的增殖速率；丰富的维生素、氨基酸等物质有利于病毒效价的提高；采用微载体和生物反应器系统生产TGEV，病毒效价可达11．3lgTCID50／0．2mL,北方瓶培养系统提高约100倍。     

犬瘟热病毒Vero细胞悬浮产业化培养工艺研究

为克服犬瘟热疫苗现有生产工艺的缺陷,试验采用10 g/L Cytodex-1型微载体,按每个微载体15～20个细胞的细胞接种量接种至微载体培养Vero细胞,细胞培养液为10%NBS的DMEM培养液。结果显示,当细胞密度达到8×106CFU/mL时接种犬瘟热病毒,最佳培养时间30 h,接毒剂量按照MOI为0.1接种犬瘟热病毒液;当细胞病变达到50%时,病毒感染细胞时间为30 h,收获毒液。按照上述摸索生产工艺参数,收获的犬瘟热病毒液的病毒液滴度每病毒含量≥108.5TCID50/0.1 mL。将收获的病毒液冻存及下游相关的灭活处理,作为制备犬瘟热疫苗的抗原。研究表明,试验大幅度提升犬瘟热病毒培养量,效价批间差异性均一,实现了产业化反应器悬浮培养代替细胞工厂的技术路线。     

BHK-21细胞稳定测定猪乙型脑炎病毒半数细胞感染量效价（TCID_（50））的条件优化及应用

为建立BHK-21细胞测定乙型脑炎病毒（Japenese encephalitis virus,JEV）病毒效价的方法,对96孔细胞板中不同初始接种量BHK-21细胞在多种维持液中的生长状态进行探讨,发现当BHK-21细胞以1250～2500个/孔接种96孔板培养24 h后,更换含3%新生牛血清的DMEM后在37℃、5%CO2条件下可至少良好维持72～96 h。在此条件下并基于Reed-Muench法测定病毒效价的原理,本文建立了准确测定JEV TCID50的方法,利用该方法对JEV野毒分离株及商品疫苗进行测定,均获得稳定、准确的病毒效价。本实验为JEV的体外培养、病毒定量、疫苗评价等提供了一种准确、稳定、易判定的参考方法。     

猪乙型脑炎病毒LS株的理化特性及其在BHK-21细胞上增殖特性的研究

对猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)LS株的理化特性及其在BHK-21细胞上的增殖特性进行研究,结果表明,该病毒对温度(56 ℃)、酸(pH 5.0以下)、乙醚、胰蛋白酶敏感,反复冻融(-65～20 ℃)3次几乎不影响病毒效价;该毒株在BHK-21细胞上连续传20代,仍能维持较高的病毒滴度(TCID₅₀=10^7.75/mL)和血凝效价(2⁸),且根据其在BHK-21细胞上的增殖规律,得到最佳收毒时间为接毒后28～40 h。本试验为进一步研究JEV LS株的生物学特性奠定基础。     

应用生物反应器培养ST细胞制备猪传染性胃肠炎病毒

通过生物反应器制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),研究了感染复数(MOI)、微载体浓度、病毒感染时间(TOI)和病毒维持液对病毒效价的影响,结果表明,分别以1:500稀释种毒(8.0 LgTCID50/mL)后接种、接种72 h的ST细胞、5 mg/mL微载体浓度和维持液低糖DMEM+0.2%水解乳蛋白(LH)的参数培养方式效果最为理想。     

ST悬浮细胞培养猪伪狂犬病病毒工艺参数的优化

为优化ST悬浮细胞培养条件及其生产猪伪狂犬病病毒的工艺参数,对影响ST悬浮细胞生长的接种细胞初始密度、培养时间和摇瓶转速等工艺参数进行优化比较,对影响猪伪狂犬病病毒增殖的接种细胞初始密度、感染量和培养时间等条件进行优化。结果显示：接种细胞初始密度1.00×106 cells/mL、摇瓶转速140 r/min、悬浮培养48 h时,细胞数量扩增了4倍且细胞活力高;猪伪狂犬病病毒接种时初始细胞密度2.00×106 cells/mL、感染量MOI=1.0、培养60~72 h,毒价可达109.00 TCID50/mL。结果表明,优化后的培养工艺适用于摇瓶中ST悬浮细胞及猪伪狂犬病病毒的培养。本研究为获得高密度ST悬浮细胞和提高猪伪狂犬病病毒繁殖能力提供了试验依据。     

猪乙脑病毒CSF.XZ-2D株的分离鉴定及其体外培养特性研究

为了解河南省规模化猪场日本乙型脑炎病毒(JEV)流行株的特征,本研究对临床流产胎儿脑脊液进行病毒盲传分离,经RT-PCR等分子生物学方法及乳鼠感染试验,分离鉴定了1株基因Ⅲ型JEV株,命名为CSF.XZ-2D。采用BHK-21细胞对该分离株的体外培养特性进行研究,结果表明,在25 cm2细胞瓶中,用1.25×106个细胞/瓶的初始量制备细胞单层,以较低剂量的病毒液吸附细胞并洗涤弃去游离病毒粒子,可在感染后60 h达到最大增殖量,病毒效价为105.0TCID50/0.1 mL以上。本研究为其他JEV分离株的体外培养提供了参考。     

反复冻融次数和不同保存温度对病毒滴度的影响

为探讨在有宿主细胞的情况下,反复冻融和不同保存温度对病毒滴度的影响,将收集的含ST细胞培养的猪细小病毒和含Vero细胞培养的伪狂犬病病毒经过不同次数的反复冻融,测定其病毒滴度。将收集的猪细小病毒液和伪狂犬病病毒液分别在4、22、-20、-80℃保存,间隔一段时间后测定半数组织细胞感染剂量(TCID_(50)),以了解病毒滴度。结果显示,含ST细胞的猪细小病毒和含Vero细胞的伪狂犬病病毒经过反复冻融3次之后,病毒滴度比未经冻融的病毒滴度分别提高了1.81lg和1.86lg。同一温度下,随着放置时间的增加,病毒滴度均呈下降的趋势。在一定时间内,不同保存温度下病毒滴度有明显区别,但在-20℃和-80℃条件下保存的病毒滴度下降比4℃和22℃条件下保存的慢。因此,在培养病毒的时候可以用反复冻融3次的方法来提高病毒的滴度。4℃和22℃只能作为病毒的短期储存温度,-20℃和-80℃对于病毒来说是合适的保存温度。     

猪圆环病毒2型片状载体悬浮培养生产工艺研究

为了提高猪圆环病毒2型(PCV2)抗原的病毒含量,对PCV2片状载体悬浮培养生产工艺进行了试验。将PCV2接种到PK-15细胞悬液中,在转瓶上培养,第2次带毒传代后,接种到片状载体上悬浮培养,当培养液中耗糖量稳定时,换维持液,每48 h收获1次,可以连续收获5次以上,有效抗原含量比传统转瓶生产工艺提高了5～10倍。     

猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero细胞中繁殖条件的优化

通过研究猪流行性腹泻病毒（PEDV）疫苗株在Vero细胞中的繁殖规律,确定最佳的增殖条件。将猪流行性腹泻病毒疫苗株分别在六孔板、10L转瓶培养的Vero细胞中增殖试验,培养过程中检测不同接毒量及接毒后不同时间点病毒TCID50,以确定PEDV疫苗株的增殖规律。结果显示,在已确定病毒增殖的最佳条件下,PEDV疫苗株在逐级放大的不同培养体系中均能获得较高而稳定的增殖,不同体系中病毒增殖均能达到106.3TCID50/0.1mL以上。     

猪细小病毒在F81细胞和PK15细胞增殖的研究

将猪细小病毒(PPV)接种于F81和PK15细胞,研究不同的培养基、pH值、血清含量、细胞密度对病毒在细胞里增殖的影响,细胞毒液冻融3次后测半数组织细胞感染量(TCID50)。试验结果表明,接毒24 h后F81和PK15细胞都有病变产生,在细胞病变达到75%以上时收获细胞毒液,发现PPV在F81细胞和PK15细胞中均能增殖且病毒滴度比较高。测得F81细胞接种PPV最高滴度为108.71TCID50/mL;PK15细胞接种PPV最高滴度为108.73TCID50/mL。     

猪流行性腹泻病毒在微载体培养Vero细胞上的增殖试验

为了探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)在微载体培养Vero细胞上的增殖效果,采用2 L生物反应器进行微载体培养Vero细胞和PEDV繁殖,并摸索细胞生长和病毒繁殖的最佳条件,检测病毒滴度,与方瓶培养的病毒滴度进行比较。结果显示:当微载体为5 g,种子细胞数约3.05×107个,采用灌注式培养,Vero细胞经72 h长满单层,细胞数约为3.02×109个,此时用滴度为104.45TCID50/m L的PEDV 1 m L感染Vero细胞,培养96 h,微载体上80%细胞脱落时收毒,培养的PEDV具有较高的病毒滴度。相同病毒在微载体系统与方瓶上进行同步传代,经检测病毒滴度均有提高,但在微载体系统上培养的PEDV最高滴度可达到106.05TCID50/m L,明显高于方瓶培养。本试验为研究PEDV能更好适应Vero细胞,提高PEDV产量提供技术支持。     

脾毒保存期对猪瘟病毒增殖的影响

为确定脾毒保存期对猪睾丸细胞(Swine Testis,ST)繁殖猪瘟病毒的影响,选用不同保存期的脾毒接种ST细胞,培养猪瘟病毒,从感染率、产毒时间、病毒液效价、合格收次4个方面进行对比。结果显示,随着脾毒保存期延长,病毒对细胞感染率明显降低,产毒时间延后,所产病毒液效价下降,合格收次减少。提示保存期对ST细胞产毒有很大影响,在生产中应严格控制脾毒种毒的保存期。     

带毒传代工艺在狂犬病细胞苗生产中的应用

狂犬病细胞苗的传统生产方法是取长成“ ”的BHK21细胞单层，弃去生长液(血清含量100mL／K)，按1．5万mL细胞培养瓶每瓶40mL的量接毒旋转，使毒液浸润整个细胞面，37℃旋转吸附40～60min，加入2000mL维持液(含血清30mL／L)，37℃旋转培养48h后，调pH至7．2～7．4，继续培养至96～120h，冻毒，收获细胞培养物。传统方法的生产成本高，劳动强度大，种毒使用量大。2004年笔者采用带毒传代工艺生产狂犬病细胞苗，效果较为满意。     

H9亚型HP株禽流感病毒繁殖规律的探索

为了研究H9亚型HP株禽流感病毒接种非免疫鸡胚后病毒的繁殖规律,试验用H9亚型HP株禽流感病毒接种非免鸡胚,记录不同时间段死亡的鸡胚数量,并分别收获各时间段死亡鸡胚的尿囊液,测定不同时间段尿囊液的病毒效价。结果表明,接种H9亚型HP株禽流感病毒后,非免鸡胚死亡高峰期出现在60～84 h,死亡数量占接种鸡胚数的80%以上,而该时间段死亡鸡胚尿囊液的病毒滴度也处于最高峰,最高到达10^9.63EID₅₀/mL,直到96 h病毒仍维持较高水平(10^9.50EID₅₀/m L),而96 h后病毒滴度开始衰减。