血清4型禽腺病毒W株的分离鉴定和全基因组序列分析

为了解血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus genotype 4,FAdV-4)W株全基因序列、结构特征及遗传变异情况,本试验采集发病鸡肝脏和肾脏进行PCR鉴定、SPF鸡胚和鸡胚肝细胞分离、电镜观察证明该病毒为FAdV-4,TCID_(50)为10~(-7.2)/0.1 mL;电镜观察可见70 nm左右的二十面体无囊膜病毒颗粒;经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚后能明显抑制鸡胚发育出现侏儒胚,接种10 d内死亡率达100%;进一步对W株进行全基因组扩增及序列分析。病毒序列分析结果显示,其全基因组长为43 591 bp,共有60个开放阅读框,W株与GenBank中公布的FAdV-4参考毒株全基因组核苷酸序列同源性为98.4%～100%,其中与标准株非致病性毒株ON1(登录号:GU188428.1)的同源性为98.4%,主要缺失ORF19(脂肪酶基因)和ORF27;通过对病毒主要结构蛋白Hexon、Fiber-1和Fiber-2基因分析发现,W株与近几年国内分离株亲缘关系较近,与ON1株及其他国外分离株差异较大。综上说明,该分离株具有高致病性,与国外分离株存在较大差异,为进一步分析FAdV-4的毒力增强机制提供了基础依据。     

1株鸡传染性喉气管炎病毒的基因组特征与致病性

本研究旨在了解我国鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)流行毒株的分子特性.对1株分离自国内养殖场的鸡传染性喉气管炎病毒毒株BT株进行了部分基因序列(TK、ICP4、gB、UL32)测定分析,并研究了其对2周龄SPF鸡的致病性.遗传进化分析表明,BT株核苷酸序列与国内其他流行毒株相似性在97％以上,属于同一进化分支,未出现较...     

鸭源禽腺病毒分离株的致病性及细胞培养特性研究

为进一步了解Ⅰ群禽腺病毒鸭源分离株的致病性和生物学特性,采取接种鸡胚和鸭胚,攻毒SPF鸡和雏鸭,并应用鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肝细胞(CEL)培养观察细胞病变。试验结果表明,SPF鸡胚和鸭胚均出现死亡以及心包积液等典型症状,SPF鸡和雏鸭也引起不同程度死亡,且出现与临床送检病例类似的症状,PCR检测与序列分析证实分离的2株鸭源Ⅰ群禽腺病毒均为FadV-4血清型,病毒接种CEF细胞后没有细胞病变,而接种CEL细胞后则出现很强的聚集性、细胞变圆等典型病变。表明分离的鸭源FadV-4对SPF鸡和雏鸭均具有一定的致病性,对CEL细胞具有一定的适应性。     

血清4型禽腺病毒W株的分离鉴定和全基因组序列分析

为了解血清4型禽腺病毒（fowl adenovirus genotype 4,FAdV-4） W株全基因序列、结构特征及遗传变异情况,本试验采集发病鸡肝脏和肾脏进行PCR鉴定、SPF鸡胚和鸡胚肝细胞分离、电镜观察证明该病毒为FAdV-4,TCID₅₀为10^-7.2/0.1 mL;电镜观察可见70 nm左右的二十面体无囊膜病毒颗粒;经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚后能明显抑制鸡胚发育出现侏儒胚,接种10 d内死亡率达100%;进一步对W株进行全基因组扩增及序列分析。病毒序列分析结果显示,其全基因组长为43 591 bp,共有60个开放阅读框,W株与GenBank中公布的FAdV-4参考毒株全基因组核苷酸序列同源性为98.4%~100%,其中与标准株非致病性毒株ON1（登录号：GU188428.1）的同源性为98.4%,主要缺失ORF19（脂肪酶基因）和ORF27;通过对病毒主要结构蛋白Hexon、Fiber-1和Fiber-2基因分析发现,W株与近几年国内分离株亲缘关系较近,与ON1株及其他国外分离株差异较大。综上说明,该分离株具有高致病性,与国外分离株存在较大差异,为进一步分析FAdV-4的毒力增强机制提供了基础依据。     

3株H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

为了获得H9亚型禽流感病毒(AIV)流行毒株并掌握流行毒株的分子特征和致病性,采用病毒分离、血凝性试验、鸡胚半数感染量(EID₅₀)测定、HA基因序列分析、致病性试验、交叉保护性试验等对3份临床疑似H9亚型AIV感染病料进行了研究。结果:3份临床病料样品可引起10日龄SPF鸡胚规律性死亡,3株分离毒株对1%鸡红细胞的凝集效价分别10log₂、11log₂和10log₂;对SPF鸡胚的EID₅₀分别为10^-8.83/mL、10^-9.50/mL和10^-9.0/mL;与2018年上海分离毒株亲缘关系较近,进化树处于同一分支;对SPF雏鸡的发病率分别为80%、100%和90%;均未引起SPF雏鸡死亡;彼此之间具有100%的交叉保护率,商品化禽流感(H9亚型)灭活疫苗对3株分离毒株的保护率分别为100%、90%和100%。本试验成功分离鉴定到了3株低致病性H9亚型AIV流行毒株,并证实当前商品化疫苗对H9亚型AIV流行毒株仍具有较好的保护效果。     

山西亚群H5N1亚型HPAIV对鸭及鸭胚的继代感染研究

2006年从山西省分离获得的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)曾引起免疫鸡群的大量死亡,与我国之前分离的病毒抗原差异性较大,称为"山西鸡型"抗原变异株。本研究应用该亚群代表毒株CK/SX/2/06(H5N1),研究该病毒对SPF鸭和鸭胚的致病性,并通过病毒在鸭和鸭胚内的连续传代,探讨该亚群病毒在鸭和鸭胚中的进化规律。结果表明,病毒对3周龄鸭呈低致病性,在各脏器中的复制能力较弱;鸭感染病毒后无明显临床症状,排毒水平较低并且不能感染同居鸭。病毒在3周龄鸭和10日龄鸭胚中分别继代感染3代和5代后,对3周龄鸭仍呈低致病性且HA基因未发生氨基酸位点变化。病毒不能致死3周龄鸭和1日龄雏鸭,但能致死10日龄～23日龄鸭胚,而且对鸭胚的致病性随着鸭胚日龄的增长逐渐减弱,致死鸭胚时间从对10日龄鸭胚24h致死到对23日龄鸭胚72h致死直至对25日龄鸭胚只感染但不致死。病毒对鸭呈低致病性且在鸭群传播中保持着基因水平和致病性上的相对稳定,对不同日龄鸭胚、1日龄和3周龄鸭致病性的不同表现,与目前存在于我国的其他亚群H5N1HPAIV对鸭致病性和进化特点上呈现出明显的差异,并对家禽养殖业存在威胁。     

雏鸭坦布苏病毒分离鉴定及全基因序列分析

山东潍坊地区某鸭场养殖的21日龄樱桃谷鸭突然发病,病鸭主要表现翅腿瘫痪等神经症状,排黄绿色或黄白色稀粪,病死率5%左右。为了确定发病鸭群感染病原的种类,首先采集病死鸭肝脏,处理后接种9日龄~11日龄SPF鸡胚进行病原分离。其次,对分离的病原RT-PCR扩增和序列测定,MEGA5绘制系统发育进化树,DNA Star软件分析核苷酸同源性。结果表明,通过SPF鸡胚分离到一株坦布苏病毒(TMUV),命名为TMUV-SDWF。该病毒株基因组全长为10 990nt,编码1个含3 426个氨基酸的多聚蛋白。系统发育进化树分析显示,TMUV-SDAG毒株属于Ⅰa分支。核苷酸同源性分析表明,TMUV-SDSG与GenBank上公布的16株不同TMUV分离株核苷酸同源性高达97.0%~99.8%。成功分离鉴定一株鸭坦布苏病毒并对其进行了遗传进化分析,为鸭坦布苏病毒弱毒或灭活疫苗的筛选制备及该病毒分子流行病学的研究奠定了基础。     

基因C型鸭甲肝病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,并掌握该致病原的遗传进化特征,进行了临床病料的RT-PCR检测、病毒分离与鸭胚病变特征观察、分离毒株半数致死量(ELD50)测定、动物回归试验、VP1基因序列分析等研究。结果显示:临床病料样品经DHAV-C特异性引物检测为阳性,病料样品可引起10日龄鸭胚规律性死亡以及肝脏肿大、出血等特征性病变,分离毒株对鸭胚的ELD50为10^-6.32/0.1mL,分离毒株对雏鸭的致死率达100%,并可引起雏鸭精神沉郁、运动障碍、肝脏肿大出血等典型症状,分离毒株VP1基因序列与GenBank中登录的DHAV-C VP1基因的同源性在96.5%~100%之间,遗传进化关系中分离毒株与DHAV-C各毒株处于同一个分支,而与DHAV-A、DHAV-B处于不同分支。试验结果为研制针对DHAV-C流行毒株的诊断试剂和新型疫苗奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒SC2013株的分离鉴定

利用RT-PCR从疑似鸭坦布苏病毒感染的致死产蛋鸭的肝、脾和卵泡膜等组织中扩增出鸭坦布苏病毒E基因,并利用10日龄鸭胚分离出病毒SC2013株。该毒株对氯仿和胰蛋白酶敏感,不凝集鸡红细胞;E基因核苷酸序列与坦布苏病毒GX2013G(Gen Bank:KM275941.1)的相似性在99%以上;对10日龄鸭胚的半数致死量为10-4.59/0.2 m L,人工接种能引起2日龄雏鸭发病死亡并呈现典型的临床症状与病理变化。以上结果表明,分离病毒SC2013株为致病性的鸭坦布苏病毒,在今后养鸭业中除注重鸭坦布苏病毒对产蛋鸭的危害外,也应加强防止幼龄鸭感染。     

5株Ⅰ群4型禽腺病毒的分离与鉴定

对5份不同来源的临床上疑似禽腺病毒感染鸡组织处理后接种6～7日胚龄SPF鸡胚,经过LMH细胞传代,通过血凝性检测和PCR方法对细胞培养物进行鉴定。血凝性检测表明分离物不能凝集鸡红细胞,对Hexon和52K基因的序列分析显示,分离到5株病毒为Ⅰ群4型禽腺病毒(FAdV-4)。动物回归试验结果表明,5个病毒株均能致40日龄SPF鸡死亡,死亡率达80%以上,并表现与FAdV-4感染临床发病相似的症状。研究结果为探究国内FAdV-4分子流行与毒力演变以及病毒感染的预防提供了基础材料。     

1株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定

为了解广东猪流感病毒(SIV)的流行变异情况,2010年11月从广东某规模猪场采集流感症状的猪鼻拭子60份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到1株猪流感病毒,通过流感分型RT-PCR和HI试验鉴定为H3N2亚型SIV,命名为A/swine/Guangdong/L22/2010(H3N2),进行全基因序列测定及相似性分析发现,该分离株有低致病性流感分子特征,该毒株的8个基因片段连同最近广东猪群流行的流感毒株与2000年前后H3N2人流感病毒有较高的同源性.系统遗传演化显示,该病毒分离株可能是由1999年人源H3N2流感病毒A/Moscow/10/99(H3N2)进化而来.     

4株基因C型鸭甲肝病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

为了获得鸭甲肝病毒(DHAV)流行毒株并掌握流行毒株的分子特征,试验采用临床病料RT-PCR检测、病毒分离、病毒含量测定、致病性试验、VP1基因序列分析等方法对8份临床疑似DHAV感染病料进行了研究.结果显示:8份临床病料样品经RT-PCR检测有4份为DHAV-C阳性;4份阳性病料均可引起10日龄鸭胚规律性死亡;4株分...     

肉鸡禽呼肠孤病毒变异株的分离与致病性研究

为了解禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)变异株在我国的流行情况,了解其生物学特性及致病特点,对吉林省某企业送检的病鸡关节组织进行病毒分离,通过RT-PCR检测、序列分析及动物回归试验对该分离病毒进行鉴定。结果显示:成功分离到1株肉鸡ARV变异株,将其命名为ARV-JL21-0102;σC基因遗传演化分析显示:该分离病毒与ARV基因Ⅱ型参考株ISR528处于同一进化分支,氨基酸序列相似性为89.8%,而与ARV基因Ⅰ型疫苗株S1133和HeB02株氨基酸序列相似性分别为56.3%和58.4%;该变异株在LMH细胞上增殖良好,对鸡胚和1日龄SPF雏鸡存在一定的致病性;与基因Ⅰ型HeB02株相比,变异株对鸡胚和SPF雏鸡致病性较弱,感染雏鸡发病时间推迟,雏鸡致死率较低。研究结果为全面了解ARV变异株的遗传进化特征和新型疫苗的研发奠定了基础。     

禽腺病毒4型云南株分离鉴定及Hexon基因序列分析

【目的】分析云南省家禽及野鸟禽腺病毒4型(Fowl adenovirus-4,FAdV-4)流行情况、Hexon基因差异性及致病性,为研究FAdV-4流行及Hexon基因对病毒毒力的影响提供参考。【方法】2020年1月―2021年6月在云南省昆明市、曲靖市、楚雄州、大理州、红河州、玉溪市等家禽养殖密集区采集疑似感染FAdV-4家禽肝脏组织样品158份,候鸟迁徙地采集野鸟新鲜粪便310份,采用PCR技术检测FAdV-4核酸,对获得的代表性阳性样品进行病原分离鉴定,并对分离毒株进行致病性及Hexon基因序列分析。【结果】家禽肝脏组织样品中检出FAdV-4核酸阳性样品19份,阳性率为12.03%(19/158);黑颈鹤粪便样品中检出核酸阳性样品1份,阳性率为0.3%(1/310)。从FAdV-4核酸阳性样品中分离到7株FAdV-4,致病性研究结果显示,FAdV-4云南分离株均能致鸡胚发育不良,引起4周龄肉鸡发生心包积液-肝炎综合征,鸡胚半数致死量(ELD₅₀)为10^―6.17~10^―4.32/mL。7株分离株均聚类于FAdV-C亚群,Hexon蛋白与国内FAdV-4高致病性毒株具有相同的¹⁸⁸R、¹⁹³R、¹⁹⁵Q特征。分离株感染SPF鸡后,临床症状明显,具有高致病性且高致死率,肝细胞病变明显。【结论】研究初步掌握了云南FAdV-4的流行情况,首次在黑颈鹤粪便中检测到FAdV-4病原核酸,分离获得7株FAdV-4,部分毒株Hexon蛋白存在氨基酸突变。     

免疫鸭体内副黏病毒的分离及其F基因的分子特征

为分析当地鸭副黏病毒流行状况及其融合蛋白(F)基因的序列特征,从江苏省某新城疫疫苗免疫过的鸭群中分离到1株病毒,经血清学试验和中和试验鉴定为鸭副黏病毒,命名为JS0920株.生物学特性分析,9日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50)为10-5.3；9日龄SPF鸡胚的最小致死量平均死亡时间(MDT)为47.7h,1日龄SPF鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.875,6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)测定为2.7.用该病毒的培养物(鸡胚尿囊液)经肌肉注射攻毒,鸭的发病率为70％,死亡率为40％；鸡的发病率和死亡率均为100％.用RT-PCR方法扩增该分离毒株的F基因,序列分析表明,JS0920株与标准强毒株F48E9的核苷酸序列和氨基酸序列同源性最高,分别为99.2％和99.5％,与免疫预防用的LaSota株的同源性分别为89.0％和92.2％；其多肽裂解位点为112R-R-Q-R-R-F117,具有高致病性鸭副黏病毒毒株的分子特征；系统发育进化树分析,JS0920株与LaSota株的基因型不同,JS0920株为基因Ⅸ型,与F48E9株的亲缘关系最近.试验结果对认识当前DPMV的流行和变异现状以及疫苗研制具有重要的参考价值.     

2株Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析

为了解山东省禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV)毒株的基因遗传演化情况及致病性,本试验对山东省两家疑似暴发鸡包涵体肝炎和心包积液综合征鸡场采集的病料(肝脏、脾脏)进行PCR鉴定,并将鉴定为FAdV的2份阳性病料提取病毒液,接种鸡肝癌细胞(LMH)进行毒株传代培养和细胞病变(CPE)观察、PCR检测、TCID50测定、鸡胚致病性试验、SPF鸡回归试验、病毒hexon部分基因扩增及序列分析。结果显示,试验成功分离到2株FAdV,2株分离株细胞传第1代即可观察到CPE,PCR均可扩增出大小为500bp的片段,且2株分离株细胞F5代TCID50分别为10-7.75/0.1mL和10-7.60/0.1mL,均对7日龄SPF鸡胚有强致病性;第1分离株和第2分离株对21日龄SPF鸡攻毒死亡率分别为80%和15%。hexon基因核苷酸同源性分析结果显示,第1分离株与FAdV-4株同源性最高(99.57%),第2分离株与FAdV-8b株同源性最高(99.18%)。这2株FAdV分离株均与Ⅰ群禽腺病毒同源,与火鸡出血性肠炎病毒(HEV)所在的血清Ⅱ群及减蛋综合征病毒(EDSV)所在的血清Ⅲ群禽腺病毒位于不同分支。第1分离株基因型为C型,血清型为4型,命名为FAdV-SDC4株;第2分离株基因型为E型,血清型为8b型,命名为FAdV-SDE8b株。综上所述,FAdV-SDC4和FAdV-SDE8b株属于近几年国内流行毒株。本研究结果可为鸡包涵体肝炎、心包积液综合征的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

一株麻鸡传染性法氏囊病毒新型变异株的分离鉴定

近几年,鸡传染性法氏囊病毒新型变异株在我国广泛流行,主要发生于肉鸡,其致病力弱、隐蔽性强但能造成法氏囊严重萎缩。本研究从山东济宁地区临床出现法氏囊萎缩的发病麻鸡中采集法氏囊病料,接种SPF鸡胚进行病毒分离,通过RT-PCR方法进行病毒鉴定,将分离毒株回归SPF鸡进行致病性试验,同时对其主要抗原基因VP2进行进化分析。结果发现,该毒株能致死鸡胚;对其VP2基因进行测序比对和进化树分析发现,其与近几年的新型变异株基因序列的进化关系较近,同源性为96.1%～99.2%;人工感染SPF鸡第7 d法氏囊即出现较为明显的萎缩,第14 d萎缩更为明显,囊体比显著小于对照组(P<0.01)。本研究分离到的麻鸡源传染性法氏囊病毒JN22株属于新型变异株,能导致SPF鸡法氏囊显著萎缩。     

禽腺病毒的分离鉴定及LMH细胞适应毒的生物学特性研究

为了对采集自北京平谷某养殖场发病鸡中出现心包积液综合征症状的病料进行病毒分离和鉴定,将病料接种LMH细胞进行病毒分离,并在LMH上连续传代,取C5和C15代细胞毒分别接种3周龄SPF鸡进行致病性试验。根据分离病毒在LMH上的CPE特征、病毒血清中和试验、Hexon基因序列比对分析、SPF鸡致病性回归试验,表明从发病鸡病料中分离的一株病毒为血清4型禽腺病毒;病毒在LMH细胞盲传3代后,就能很好地适应细胞培养,出现禽腺病毒典型的CPE;培养至第10代,病毒在接种后72 h,病毒含量即可达到107.4TCID50/0.1m L的峰值滴度;接种细胞毒的SPF鸡出现4型禽腺病毒导致的典型临床症状和特异性剖检病理变化,两组接种鸡的死亡率分别为100%和70%。结果表明,研究分离到的4型禽腺病毒毒株对SPF鸡具有高致死率,但病毒经过细胞连续传代后对鸡的致死率降低。     

番鸭副粘病毒1型的分离鉴定

自表现神经症状、腹泻、病死率较高、腺胃粘膜局灶性出血或溃疡及肠道粘膜出血为特征的病死番鸭肝脏中分离到病毒,经电镜观察、血凝及血凝抑制试验鉴定为副粘病毒1型.以SPF鸡胚测定其平均致死时间(MDT)为51 h,对1日龄SPF鸡的脑内接种致死指数(ICPI)为1.74,表明该毒株属强毒株.经肌肉注射途径攻击10 d雏番鸭致死率达66.7%,表明该分离毒对雏鸭有高度的致病性.     

1株H5N1禽流感病毒云南分离株的生物学特性分析

为了解2014年分离自云南省通海县的1株H5N1亚型禽流感病毒的生物学特性,对病原A/chicken/Yunnan/1/2014(yn2014)进行了一系列分析,包括全基因组序列测定,遗传演化分析,抗原性分析,以及对SPF鸡、鸭和BALB/c小鼠的致病性试验。交叉血凝抑制试验和免疫保护试验对yn2014分离株进行抗原分析显示,yn2014与Re-5疫苗株之间抗原性差异显著。全基因组序列测定和遗传进化分析表明,yn2014病毒HA基因与韩国、日本、中国流行毒株核苷酸高度同源,同属于2.3.4.6分支;HA含有多个连续碱性氨基酸,具有高致病性禽流感病毒的分子特征。yn2014病毒人工静脉接种SPF鸡和鼻腔感染SPF鸭试验,结果显示,yn2014病毒对鸡、鸭的致死率分别为100%和50%。用10~6EID50病毒鼻腔感染6周龄BALB/c小鼠,结果显示,yn2014病毒对BALB/c小鼠的致病性较低,仅在鼻窦中复制,且不能在小鼠之间传播。本研究为该分支禽流感病毒的防控提供了较好的参考价值。