白毛乌骨鸡ChIFN-β基因克隆与生物信息学分析

为研究白毛乌骨鸡β干扰素的生物学特性,利用RT-PCR技术扩增了白毛乌骨鸡肝脏β干扰素(ChIFN-β)基因,将其连接到pGEM-T Easy载体上进行转化,重组质粒PCR鉴定后进行序列测定,同时利用BLAST、SignalP 4.1 Server、TMHMM Server v.2.0和DNAStar等软件对ChIFN-β进行生物信息学分析。结果表明:ChIFN-β基因编码区长度为612 bp,编码203个氨基酸,分子量为23.686 ku,等电点为10.3;ChIFN-β与已报道的其它鸡的IFN-β氨基酸序列具有较高的同源性;白毛乌骨鸡ChIFN-β氨基酸序列和绿头鸭首先聚类,与其它动物的亲缘关系较远;ChIFN-β存在跨膜结构,为分泌蛋白,前26个氨基酸为信号肽序列;ChIFN-β蛋白具有干扰素αβ的匹配区域,同时含有干扰素αβ受体复合物两个跨膜亚基IFNAR-1和IFNAR-2的结合位点,预测ChIFN-β蛋白属于IFαβ超家族。研究结果为白毛乌骨鸡ChIFN-β基因的结构和功能研究提供了参考。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

从江香猪源切除信号肽β干扰素原核载体的构建

β干扰素(IFN-β)具有重要的抗病毒生物学功能,为了研究从江香猪源IFN-β生物活性,试验设计1对扩增切除信号肽序列的香猪源IFN-β编码区引物,以pUCm-T-IFN-β为模板进行PCR扩增,经菌液PCR筛选、测序鉴定后,获得重组质粒pColdⅠ-CJ-poIFN-β,将其转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达后用SDS-PAGE蛋白电泳,Western blot方法对重组表达蛋白进行分析。结果:切除信号肽序列的从江香猪源IFN-β序列编码区长为498 bp,表明该片段已正确插入原核表达质粒pColdⅠ中;SDS-PAGE蛋白电泳在预期位置未见蛋白条带,但Western blot检测显示带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,显色后条带为18.26 ku,与预期大小相符。结果显示:试验成功构建了携带切除信号肽序列的香猪源IFN-β基因的原核表达质粒,但重组蛋白表达量极低,试验结果为进一步研究从江香猪源-β干扰素的生物活性奠定基础。     

黑凤鸡ChIFN-α基因克隆与序列分析

为进行黑凤鸡α干扰素(ChIFN-α)基因克隆与序列分析研究,笔者利用RT-PCR技术扩增黑凤鸡肝脏ChIFN-α基因,将其连接到pUCm-T载体上进行遗传转化,对重组子进行序列测定,同时利用ExPASy、BLAST、DNAStar等软件对ChIFN-α进行序列分析。结果表明:ChIFN-α基因长度为582 bp,编码193个氨基酸,分子质量为22. 116 ku,等电点为9. 06; ChIFN-α与已报道的其他鸡的IFN-α蛋白序列具有较高的同源性,与蓝孔雀首先聚类,其次是鸭、天鹅、雁等,与哺乳动物的亲缘关系较远; ChIFN-α具有干扰素α、β的匹配区域,同时含有其跨膜亚基IFNAR-1和IFNAR-2的结合位点,预测ChIFN-α属于IFαβ超家族; ChIFN-α为分泌蛋白,前31个氨基酸为信号肽序列,不存在跨膜结构; ChIFN-α的二级结构主要以α-螺旋(61. 14%)和无规则卷曲(35. 75%)为主。     

鹅细小病毒YBLJ株NS1基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆鹅细小病毒(GPV)NS1基因,并对其进行生物信息学分析,试验参照Gen Bank发表的GPV全基因组序列(U25749)设计扩增GPV-NS1基因的1对特异引物,经PCR扩增,将克隆的GPV-NS1基因进行TA克隆和转化,对鉴定正确的质粒进行测序,并对测序结果进行生物信息学分析。结果表明:YBLJ株GPV-NS1基因全长1 884 bp,编码627个氨基酸,与其他11株GPV的NS1基因核苷酸同源性为93.6%~99.9%,氨基酸同源性为96.2%~99.8%;蛋白二级结构中α螺旋占31.42%,β折叠占19.30%,无规则卷曲占49.28%;蛋白三级结构中α螺旋和β折叠占GPV-NS1总蛋白的一半以上的比例。说明GPV-NS1基因和其编码的氨基酸均较保守,尤其氨基酸更为保守,提示NS1蛋白虽然是非结构蛋白,但其对于GPV应该是至关重要的功能蛋白。     

羊干扰素Tau基因克隆与序列分析

本文应用 PCR扩增技术 ,以国外已发表羊干扰素 Tau(IFN- τ)基因序列为基础设计引物 ,在国内首次从北京绵羊、南江黄羊这两种国产羊的血液中分别扩增出 IFN- τ基因 ,并将 IFN- τ基因插入 PQE- 30载体构建重组质粒 ,经 PCR鉴定及 Sph 、H ind 双酶切鉴定证实为羊 IFN- τ基因的重组质粒。重组表达质粒测序结果表明 IFN- τ(p3)基因全长 5 16 bp,编码 172个氨基酸。实验发现 ,从北京绵羊、南江黄羊扩增出来的 IFN- τ基因序列与已发表的序列相比 ,其碱基同源性分别为 96 .3%、99.0 4 % ,氨基酸同源性分别为 :92 .4 %、97.1%。     

陆川猪PLIN5基因的克隆和序列分析

为了研究陆川猪背最长肌围脂滴蛋白5(PLIN5,Perilipin5)基因的结构和功能,试验对陆川猪PLIN5基因进行RT-PCR扩增,所得产物经转化获得含目的基因的重组质粒pMD19-T-PLIN5,经菌落PCR扩增和测序鉴定正确后利用生物信息学方法对陆川猪PLIN5基因的结构、理化性质及其编码蛋白信号肽、跨膜结构、亚细胞定位等进行分析,并探讨了陆川猪与其他物种PLIN5氨基酸序列的进化关系。结果表明:PLIN5基因编码区(CDS)序列长度为1 377 bp,编码458个氨基酸,与NCBI上公布的野猪PLIN5基因序列中的编码区存在4个碱基差异,均为错义突变;陆川猪PLIN5蛋白不存在信号肽,没有跨膜结构域,不存在N糖基化位点;二级结构中α-螺旋占47.16%,无规则卷曲占43.67%,延伸链占9.17%;陆川猪PLIN5基因在不同物种及进化过程中具有较高的保守性,该基因编码的蛋白符合一般Perilipin超家族的结构特征。     

从江香猪γ干扰素基因克隆与序列分析

试验旨在研究从江香猪γ干扰素(interferon gamma,IFN-γ)基因克隆与序列分析。试验提取贵州从江香猪肝脏组织总RNA,反转录生成cDNA,采用2对特异性引物进行巢式PCR扩增从江香猪IFN-γ(CJ-poIFN-γ)基因编码区,将其克隆至pUCm-T载体上,获得重组质粒pUCm-CJpoIFN-γ,并测序鉴定;利用NCBI、SOPMA、SignalP-4.1等在线服务器软件、DNAStar软件对CJ-poIFN-γ进行序列分析。结果表明,CJ-poIFN-γ基因编码区长501bp,编码166个氨基酸;核苷酸序列比对结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪、荣昌猪、印度猪、长白猪、内江猪同源性为99.4%~100.0%;进化树分析结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪亲缘关系较近;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白不存在跨膜结构,为分泌蛋白,前23个氨基酸为信号肽序列;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白二级结构主要以α-螺旋(50.60%)和无规则卷曲(33.14%)为主,B细胞表位主要位于62-65、84-87、113-115、144-156和162-166位氨基酸。试验结果为进一步研究IFN-γ的生物活性、加快从江香猪品种资源的有效利用奠定基础。     

食蟹猴IFN-α基因的克隆及遗传衍化研究

为了提取食蟹猴外周血液中的DNA,利用PCR法扩增IFN-α基因,将扩增的IFN-α目的片段产物克隆到p MD18-T载体上构建重组质粒,经PCR和双酶切鉴定后进行基因序列的测定,对测定的结果用DNAStar软件进行序列分析。结果表明:食蟹猴的IFN-α基因ORF为567 bp,共编码188个氨基酸,前23个为信号肽;成熟蛋白的理论分子质量为22 ku,等电点为8.240,亲水区占多数;该蛋白主要由5段α-螺旋组成,其IFN-α基因与苏门答腊猩猩的同源性最高,在进化树中处于同一分支,为95.8%。     

从江香猪源干扰素α2、β在生菜中的瞬时表达及其对PRRSV复制抑制作用的研究

为在生菜中瞬时表达从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β和IFN-β,检测其抗猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)的活性,本实验采用从江香猪源干扰素特异引物分别从p UCm-CJpoIFN-α2、p UCm-CJpoIFN-α2β、p UCm-CJpoIFN-β质粒中扩增IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β基因序列,分别克隆至植物表达载体p BI121中,构建含不同干扰素的重组质粒。将各质粒分别转化根癌农杆菌LBA4404,采用真空渗透法将携带重组质粒的根癌农杆菌感染生菜,经用GUS染色和ELISA方法检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达;用q PCR方法和细胞病变抑制试验检测生菜中表达的从江香猪源干扰素蛋白抗PRRSV的活性。结果显示:本实验构建了含从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β的植物表达载体PBI121-IFN-α2、PBI121-IFN-α2β、PBI121-IFN-β;GUS染色和ELISA检测结果显示从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中实现了瞬时表达;q PCR检测结果显示生菜中瞬时表达的从江香猪源干扰素蛋白在Marc145细胞中对PRRSV的复制有明显抑制作用;生菜中表达的从江香猪源IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β分别经4~7、4~9、4~7稀释在Marc145细胞中仍然能够抑制100 TCID_(50)PRRSV的致细胞病变作用。本实验实现从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中的瞬时表达且表达蛋白具有较强抑制PRRSV的复制作用,本研究为从江香猪源干扰素抗PRRSV新复合型药物蛋白的开发利用提供参考依据。     

牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合基因的克隆与生物信息学分析

为了解牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合基因的生物学特性,本试验提取牛源犬新孢子虫基因组DNA,应用PCR技术扩增犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS2和致密颗粒蛋白基因NcGRA7,SOE-PCR技术拼接NcSRS2和NcGRA7基因,构建NcSRS2-NcGRA7融合基因重组克隆质粒,并进行PCR鉴定、双酶切鉴定及生物信息学分析。结果,NcSRS2基因扩增片段大小为1 061 bp,NcGRA7基因扩增片段大小为364 bp,NcSRS2-NcGRA7融合基因扩增片段大小为1 482 bp;获得重组克隆质粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7经PCR鉴定、双酶切鉴定正确;测序分析表明,与Gen-Bank中已发表的美国株犬新孢子虫(AF061249、AF176649)核苷酸序列同源性为99%;经DNAman等软件分析,预测NcSRS2-NcGRA7融合蛋白抗原指数较高,融合蛋白二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,三级结构中2种蛋白独立折叠,并借助Linker互相连接,功能互不影响。本试验为牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合蛋白的免疫学研究奠定了基础。     

不同品种猪IFN-α基因的克隆与序列分析

根据现有猪α干扰素(IFN-α)基因序列设计引物,应用PCR技术直接从肝组织基因组中扩增丹系长白和法系长白、英系大白和法系大白猪IFN-α基因。将克隆得到的特异性片段克隆入pGEM-TEasy载体中,转化感受态细胞JM109,运用蓝白斑筛选、质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性可疑菌株,并将筛选的阳性株进行测序。结果表明,得到了上述4个品系的猪IFN-α基因。核苷酸同源性均在97.2%以上,氨基酸同源性均在92.8%以上。     

隆林黑猪氨肽酶N基因的生物信息学分析和原核表达

本研究旨在进行猪氨肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因扩增和生物信息学分析,并在大肠杆菌中进行表达。从三元杂商品猪和广西地方猪隆林黑猪中扩增出pAPN基因,通过ExPASy和Mega 6.0等软件对其进行生物信息学和系统进化分析;将pAPN克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-pAPN,使其在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达。经IPTG诱导表达、纯化,产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。结果显示,隆林黑猪和三元杂商品猪的pAPN基因长2 949 bp,开放性阅读框为2 892 bp,编码963个氨基酸,同源性为100%,与GenBank数据库中公布的标准序列(登录号:NM_214277)相比,隆林黑猪共有5处氨基酸突变,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108Ile和Ser330Pro 4处突变位于pAPN酶催化活性区域,Val621Ile突变位于APN病毒结合区域。pAPN为不稳定的亲水性蛋白,跨膜区位于第17～33位氨基酸,有12个N-糖基化位点,33个B细胞抗原表位预测位点,三级结构为同源二聚体。Val621Ile突变可能影响APN结合病毒的能力。试验成功构建重组质粒pET-32a-pAPN,SDS-PAGE鉴定以包涵体形式表达,纯化后的蛋白在123 ku处有明显条带,且具有良好的抗原性,为进一步获得多克隆抗体、研究该基因和TGEV、PEDV、PDCoV的关系奠定基础。     

副猪嗜血杆菌sapA基因克隆与生物信息学分析

试验旨在克隆副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）sapA基因,并对其进行生物信息学分析,以期为sapA基因缺失疫苗的开发与应用提供理论依据。以71株临床菌株为研究对象,经PCR扩增鉴定其中的阳性菌株;将扩增得到的sapA基因片段与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经PCR和双酶切鉴定为阳性克隆后进行测序;用生物信息学软件进行核苷酸与氨基酸序列比对、系统进化树分析、蛋白二级和三级结构预测、疏水性预测、柔性区域位预测、B细胞抗原表位预测和Jameson-Wolf抗原指数预测。试验结果显示,在71株临床菌株中,有29株成功扩增出sapA基因,29株Hps的sapA基因核苷酸序列与已公布的SH0165菌株相似性为96.5%~98.8%,除H88菌株外,氨基酸序列与SH0165菌株相似性为98.9%~100%。sapA蛋白二级结构主要有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲,有13个亲水区、38个柔性区和23个B细胞潜在抗原表位。以上结果表明,Hps的sapA基因是一个保守基因,各菌株间核苷酸序列、氨基酸序列都有很高的相似性,sapA蛋白具有较强的抗原性。     

狂犬病病毒CVS株G基因和IFN-α基因的克隆及双基因真核表达载体的构建

从狂犬病病毒CVS毒株致死的小鼠脑组织中提取总RNA,通过RT-PCR获得G基因;以pMD18-T-α质粒为模板,PCR扩增得到IFN-α基因.两个基因和pIRES真核表达载体分别双酶切,连接构建P IRES-G/IFN-α,经PCR、双酶切鉴定和测序证明载体构建成功.测得的G基因序列长1 575 bp,与CVS株G基因氨基酸同源性为98.5%;IFN-α序列长为570 bp,与GenBank中登录号为NM 001017411的IFN-α基因氨基酸同源性为91.6%.     

新兴猪γ-干扰素基因克隆及其真核表达质粒的构建

为研发猪γ-干扰素(interferon-gam-ma,IFN-γ)制剂,根据已发表的猪IFN-γ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR技术从3周龄新兴猪脾细胞中扩增出约500 bp的基因片段;将其片段连接到pMD18-T载体,经PCR、酶切及序列测定表明,该基因片段由501个核苷酸组成,共编码166个氨基酸,与NCBI GenBank上登载的猪IFN-γ基因序列完全一致。新兴猪IFN-γ基因的成功克隆及真核表达质粒的构建,将为进一步研发猪干扰素制剂奠定了基础。     

吉林延边地区猪附红细胞体A1基因的克隆与原核表达

采用PCR方法扩增吉林延边地区猪附红细胞体A1基因片段,将扩增产物与pMD18-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序;分别构建A1重组pGEX-4T-1和PET-28-a表达质粒,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示:克隆的A1基因片段长1 044 bp,含有1个999 bp的开放阅读框,编码333个氨基酸,与GenBank中A1基因序列(AM265536)的同源性为97%;表达的融合蛋白分子量分别为64 ku和40 ku,能被猪附红细胞体阳性血清识别。表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。     

牛源化脓隐秘杆菌PLO蛋白的原核截短表达及其溶血活性检测

为研究牛源的化脓隐秘杆菌溶血素(PLO)生物学功能,本研究应用PCR方法扩增牛源化脓隐秘杆菌(A.pyogenes)PLO全基因序列,通过生物信息学方法分析其与猪源A.pyogenes的PLO蛋白差异,并构建了溶血功能区重组表达质粒pQE30-PLO585,在E.coli XL1Blue中用IPTG诱导表达。结果表明,扩增到PLO蛋白基因ORF为1 605 bp,编码535个氨基酸,与猪源PLO的核苷酸序列同源性为97.4%,氨基酸同源性为97.2%,在生物学活性功能区没有发生改变。表达的PLO蛋白溶血功能区重组蛋白能够被阳性血清识别,而且具有溶解绵羊红细胞的活性,产生β溶血现象。本研究获得了牛源A.pyogenes截短重组PLO蛋白,并证明PLO具有β溶血功能与较好的抗原性。     

猪细小病毒疫苗株NS1基因克隆及生物信息学分析

为进一步开展猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）NS1蛋白功能研究,根据GenBank登录的PPV参考株NADL-2（登录号：NC001718）的NS1基因序列设计1对特异性引物,采用PCR技术扩增PPV疫苗株NS1基因,将PCR扩增产物克隆入pTA2载体构建重组质粒pTA2-NS1,并进行测序鉴定。测序结果显示,构建的pTA2-NS1质粒含有一个开放阅读框（ORF）,全长1989 bp,共编码662个氨基酸,与GenBank登录的PPV参考株NADL-2、Kresse株的NS1基因的核苷酸同源性分别为99.85%和99.65%,氨基酸同源性分别为99.70%和99.70%。上述结果表明试验成功构建了含有PPV NS1基因的重组质粒pTA2-NS1。应用DNAStar软件及在线ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM、Scansite、PSORTⅡ等生物信息学软件对NS1基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,结果显示NS1蛋白分子质量为75.7 ku,等电点PI为6.82,是弱酸性蛋白;NS1蛋白不含信号肽序列,无跨膜区,为可溶性蛋白,主要定位于细胞核内,T199、Y309、T338、T512、S631、T635为其潜在磷酸化位点。以上研究为进行PPV NS1蛋白表达,进一步开展NS1蛋白功能研究奠定了基础。     

隆林黑猪氨肽酶N基因的生物信息学分析和原核表达

本研究旨在进行猪氨肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因扩增和生物信息学分析,并在大肠杆菌中进行表达。从三元杂商品猪和广西地方猪隆林黑猪中扩增出pAPN基因,通过ExPASy和Mega 6.0等软件对其进行生物信息学和系统进化分析;将pAPN克隆到原核表达载体pET-32a（+）,构建重组质粒pET-32a-pAPN,使其在大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中表达。经IPTG诱导表达、纯化,产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。结果显示,隆林黑猪和三元杂商品猪的pAPN基因长2 949 bp,开放性阅读框为2 892 bp,编码963个氨基酸,同源性为100%,与GenBank数据库中公布的标准序列（登录号：NM_214277）相比,隆林黑猪共有5处氨基酸突变,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108Ile和Ser330Pro 4处突变位于pAPN酶催化活性区域,Val621Ile突变位于APN病毒结合区域。pAPN为不稳定的亲水性蛋白,跨膜区位于第17~33位氨基酸,有12个N-糖基化位点,33个B细胞抗原表位预测位点,三级结构为同源二聚体。Val621Ile突变可能影响APN结合病毒的能力。试验成功构建重组质粒pET-32a-pAPN,SDS-PAGE鉴定以包涵体形式表达,纯化后的蛋白在123 ku处有明显条带,且具有良好的抗原性,为进一步获得多克隆抗体、研究该基因和TGEV、PEDV、PDCoV的关系奠定基础。