猪MSTN基因敲除载体的构建及细胞筛选

构建猪肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因的打靶载体并获得敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞.以Puro为正筛选基因,白喉毒素-A(DT-A)为负筛选基因.将同源长臂和同源短臂分别插入Puro基因的两侧.同源长短臂分别为4 294 bp和1 015 bp,定点敲除MSTN基因的部分内含子2和部分外显子3.采用FugeneHD 转染法将打靶载体转入37 d的猪胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用嘌呤霉素筛选.结果显示,成功构建了对猪MSTN基因部分区域进行敲除的打靶载体,共得到48个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,获得2个正确同源重组的细胞克隆.     

日粮能量对猪肉质性状及MSTN基因表达量的影响

选择杜长大三元杂交猪,采用实时荧光定量PCR技术,研究日粮不同能量对猪肉质性状及抑肌素(MSTN)基因表达量的影响。结果表明:日粮能量对MSTN基因的表达量影响虽不显著(P0.05),但高能量水平有促进MSTN基因表达的趋势;日粮能量对肌内脂肪含量具有显著的影响(P0.05),对肉色、滴水损失及p H值的影响不显著(P0.05);MSTN基因表达量与肌内脂肪含量呈显著正相关(P0.05),与肉色、滴水损失及p H值相关不显著(P0.05)。综上所述,日粮能量水平与MSTN基因的表达对肉质有一定的影响。     

鲁西黄牛MSTN基因上游序列多态性对转录表达的影响

肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因是转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族的新成员。为了研究鲁西黄牛MSTN基因上游序列多态性与转录表达的关系,本试验提取鲁西黄牛腿肌组织细胞的基因组,扩增出MSTN基因上游序列,构建进化树并通过基因测序确定其上游序列中存在单核苷酸多态位点,多态位点位于起始密码子上游805 bp处。构建表达载体,在体外对C2C12细胞进行转染,从而验证MSTN基因上游序列多态位点对转录的影响。结果显示,MSTN基因上游序列中单个核苷酸的改变会影响其下游基因的表达水平。推测在体内MSTN基因上游序列中单核苷酸多态性能够影响基因的转录活性,在调节基因转录的过程中起着重要作用。     

摘除卵巢对母羊不同组织中MSTN、MYOG基因表达量的影响

试验通过研究卵巢摘除对布尔山羊杂种母羊羔肝脏、背最长肌、股二头肌中肌细胞生长抑制素(MSTN)和肌细胞生成素(MYOG)基因表达量的影响,旨在探讨去卵巢是否可以促进羔羊生长发育。将体重相近、长势良好的5月龄布尔山羊杂种母羊羔,随机分为处理组(n=20)和对照组(n=20)。试验初期摘除处理组母羊羔卵巢,对照组不摘除。饲养60d后,利用实时定量PCR法检测肝脏、背最长肌、股二头肌中MSTN和MYOG基因mRNA相对表达量。结果表明,卵巢摘除后,母羊股二头肌中MSTN基因mRNA相对表达量是对照组的8.73倍,差异极显著(P0.01),但背最长肌和肝脏中MSTN基因mRNA水平低于对照组(P0.05);处理组背最长肌和股二头肌中MYOG基因表达量极显著高于对照组的5.12倍和6.51倍(P0.01),肝脏中MYOG基因表达量为对照组的2.23倍(0.01P0.05)。可见,卵巢摘除可以上调背最长肌、股二头肌和肝脏中MYOG基因的表达以及股二头肌中MSTN基因的表达。     

CRISPR-Cas9介导的蒙古牛MSTN基因敲除细胞系的建立

试验旨在利用CRISPR-Cas9技术对蒙古牛胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因进行编辑,构建无标记的MSTN基因敲除的蒙古牛细胞系,为培育肌肉发达的蒙古牛提供试验材料。通过组织块贴壁法对妊娠45d的蒙古牛胎儿建立皮肤成纤维细胞系,同时在第2外显子区域选定1个gRNA靶位点,使用在线软件设计sgRNA序列,并选取评分较高的3个sgRNA,采用试剂盒法构建无标记的Cas9/gRNA载体,随后用T7E1酶酶切法对其进行活性验证,将有活性的载体用电转法转染蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过无限稀释法和口吸管法将转染后的单细胞接种于96孔板扩繁后提取DNA,对其进行PCR扩增及测序验证来获取阳性细胞。本试验构建了3个无标记的CRISPR-Cas9载体,经验证1个有活性,对电转染后的单细胞进行筛选共获得96个单细胞株,测序分析后有1个单细胞株发生单碱基突变,使得MSTN基因不能编码正常的蛋白。试验成功建立了1个MSTN基因失活的细胞株,可作为后续体细胞核移植的供体细胞,用于生产无标记的敲除MSTN基因的蒙古牛,对培养产肉率高并具有生物安全性的蒙古牛具有重要的意义。     

CRISPR-Cas9介导的蒙古牛MSTN基因敲除细胞系的建立

试验旨在利用CRISPR-Cas9技术对蒙古牛胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因进行编辑,构建无标记的MSTN基因敲除的蒙古牛细胞系,为培育肌肉发达的蒙古牛提供试验材料。通过组织块贴壁法对妊娠45 d的蒙古牛胎儿建立皮肤成纤维细胞系,同时在第2外显子区域选定1个gRNA靶位点,使用在线软件设计sgRNA序列,并选取评分较高的3个sgRNA,采用试剂盒法构建无标记的Cas9/gRNA载体,随后用T7E1酶酶切法对其进行活性验证,将有活性的载体用电转法转染蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过无限稀释法和口吸管法将转染后的单细胞接种于96孔板扩繁后提取DNA,对其进行PCR扩增及测序验证来获取阳性细胞。本试验构建了3个无标记的CRISPR-Cas9载体,经验证1个有活性,对电转染后的单细胞进行筛选共获得96个单细胞株,测序分析后有1个单细胞株发生单碱基突变,使得MSTN基因不能编码正常的蛋白。试验成功建立了1个MSTN基因失活的细胞株,可作为后续体细胞核移植的供体细胞,用于生产无标记的敲除MSTN基因的蒙古牛,对培养产肉率高并具有生物安全性的蒙古牛具有重要的意义。     

MSTN基因在贵州地方黄牛不同组织中mRNA表达量的研究

为了研究贵州地方黄牛不同组织中肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因mRNA的表达差异和表达规律,以4个品种贵州地方黄牛(关岭牛、思南牛、威宁牛和黎平牛)为试验动物,分别提取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪和背最长肌的总RNA,设计MSTN实时荧光定量引物,以牛GAPDH基因作为内参,应用实时定量PCR技术检测MSTN基因在4个品种黄牛不同组织中mRNA的相对表达量,同时利用MAS3. 0在线软件分析MSTN基因功能。结果显示:MSTN基因在4个贵州地方黄牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪和背最长肌中均有表达,在背最长肌中的表达量显著高于其他组织(P0. 05),不同品种之间MSTN基因在部分组织中的表达存在差异,且所分析的通路与机体生长发育和转录调控存在关联。研究表明MSTN基因在背最长肌中的表达量最高,品种对于MSTN基因的表达影响不大,而在不同组织中的表达量存在差异。     

海兰鸡MSTN基因的表达检测

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是1997年McPherron等根据TGF—β超家族的保守区设计一对简并引物,通过PCR扩增而发现的骨骼肌特异性因子,属于转化生长因子(transforming growth factor beta,TGF—β)超家族成员之一,又名生长分化因子8(growth and differentiation factor 8,GDF-8)。2001年,由Michel Georges领导的研究组,历经十余年的研究,发现比利时蓝牛(Belginm Blue)的双肌性状是由于MSTN基因突变造成的。     

食醋对小鼠肠道内5种细菌16SrRNA表达量变化的影响

16只C57BL/6雄性小鼠随机分为2组,食醋组作为试验组,饮用蒸馏水作为对照组。在第0、7、14、21、28天收集试验组与对照组小鼠的粪便,提取粪便细菌总DNA。采用荧光定量PCR鉴定双歧杆菌、乳酸菌、肠球菌、梭菌以及脱硫弧菌的16SrRNA表达变化。结果显示,乳酸菌16SrRNA表达量在5种待测细菌中最高。与对照组相比较,在不同时间点乳酸菌的16SrRNA表达量有变化,双歧杆菌的16SrRNA表达在试验组中有明显的升高。但双歧杆菌和乳酸菌2种益生菌的16SrRNA含量在5种检测菌中的比例维持在92.61%⁹9.09%。第28天时,梭菌与肠球菌在试验组中的16SrRNA表达量明显低于对照组。肠球菌、脱硫弧杆菌和梭菌3种有害菌的16SrRNA水平仅占5种细菌16SrRNA表达量的0.91%99.09%。第28天时,梭菌与肠球菌在试验组中的16SrRNA表达量明显低于对照组。肠球菌、脱硫弧杆菌和梭菌3种有害菌的16SrRNA水平仅占5种细菌16SrRNA表达量的0.91%⁷.32%。     

大骨鸡MSTN基因的表达检测

以大骨鸡为试材,采用RT-PCR法检测了MSTN基因在大骨鸡不同器官中的表达情况。结果表明,MSTN基因在大骨鸡骨骼肌中表达水平较高,在心肌、肾脏、脑、肠、舌中也有微量表达,但在肺、肝脏中未检测出MSTN mRNA,而且在14日龄时表达水平高于35和56日龄。     

MSTN基因在1~6月龄哈萨克羔羊脂肪中相对表达量的研究

探索MSTN(生长抑制素)基因在脂肪组织中不同生长阶段的表达差异,为哈萨克羔羊的良种选育提供遗传学资料。采用荧光定量1~6月龄哈萨克羔羊脂肪组织中MSTN基因的相对表达量,2-ΔΔCt处理不同月龄相对表达量数据,SPSS 17.0软件分析表达量差异。结果表明:MSTN基因在1~6月龄哈萨克羔羊尾脂中的相对表达量6月龄最高,1、2、3、4各月龄之间无显著性差异(P0.05),5月龄最低。说明MSTN基因在脂肪中的表达量在生长发育的前期差异不显著(P0.05),在5月龄显著降到最低点,随后在6月龄达到最高。     

发酵床饲养对猪运动时间、肌纤维形态、MSTN蛋白表达的影响

旨在研究发酵床饲养模式（fermentation bed breeding,FB）以及常规水泥地面饲养模式（conventional breeding,CB）下,猪群运动时间差异,以及由此差异造成的对猪生产性能、肌纤维形态、MSTN蛋白表达的影响。结果显示,在FB条件下,猪只运动时间占总时间比率较CB显著增加82.60%（P〈0.05）;生产性能上,FB与CB饲养效果相比,平均增重与平均日增重分别提高10.50%与11.72%,差异显著（P〈0.05）;FB条件下猪臀部肌纤维束变粗,且与CB相比,肌纤维直径增加4.90%（P〉0.05）;免疫组织化学结果显示,内源性MSTN蛋白在CB条件下,猪臀肌中的阳性比例较高,FB条件下,猪臀肌中内源性MSTN蛋白显著减少（P〈0.05）。     

PNPLA5基因敲除对大鼠睾丸形态学及精子运动能力的影响

旨在研究PNPLA5基因对雄性大鼠繁殖性能的影响。本研究以PNPLA5敲除型雄性大鼠(KO)为试验组,野生型大鼠(WT)为对照组,分别饲喂普通饲料,并采集大鼠附睾精子及睾丸组织。利用繁殖试验检测配种后雌鼠的妊娠率及平均产仔数,精子运动性能分析检测精子运动能力,Western blot检测精子中线粒体功能相关细胞色素C(cytochrome C,Cytc)与细胞色素C氧化酶亚基IV(cytochrome c oxidase subunit IV,COX IV)的表达水平,HE染色检测睾丸组织形态。结果表明:与野生型雄性大鼠相比,PNPLA5敲除型雄鼠与野生型雌鼠配种后,雌鼠的妊娠率极显著下降(P<0.01);精子的曲线运动速度显著降低(P<0.05)及渐进运动精子的百分率极显著降低(P<0.01);PNPLA5敲除型大鼠精子中细胞色素C表达量下调,细胞色素C氧化酶亚基IV表达量上调,但差异均不显著(P>0.05);PNPLA5基因缺失引起大鼠睾丸组织结构疏松,曲细精管中各阶段生精细胞排列紊乱,上皮细胞脱落至管腔。综上表明,本研究发现PNPLA5基因敲除能够引起雄性大鼠繁殖能力降低,为家畜繁殖研究提供重要的参考依据。     

敲除FGF5基因对陕北白绒山羊血液生理生化指标的影响

为探究敲除FGF5基因对陕北白绒山羊血液生理生化指标的影响,本实验以敲除FGF5基因的陕北白绒山羊(公、母羊各8只,阳性)、同龄普通陕北白绒山羊(公、母羊各5只,阴性)为研究对象,分别在10月龄、1岁与1.5岁时测定8项血常规指标和14项血液生化指标。结果表明:血常规指标中,10月龄、1岁时,阳性公羊的红细胞压积(HCT)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)显著低于阴性公羊(P0.05),阳性母羊的红细胞分布宽度变异系数(RDW)、血红蛋白(HGB)、HCT极显著高于阴性母羊(P0.01);1岁时,阳性公羊和母羊的红细胞数目(RBC)均显著高于阴性公羊和母羊(P0.05);1.5岁时,阳性母羊的白细胞数目(WBC)显著高于阴性母羊(P0.05)。血液生化指标中,10月龄时,阳性母羊的球蛋白极显著低于阴性母羊(P0.01);1岁、1.5岁时,阳性母羊的白蛋白极显著高于阴性母羊(P0.01);1.5岁时,阳性母羊的尿素极显著低于阴性母羊(P0.01);其余指标均差异不显著(P0.05)。因所有指标均在参考范围内,说明敲除FGF5基因的陕北白绒山羊的蛋白质代谢、糖代谢、脂类代谢、肝胆功能、钙磷代谢均无显著影响。表明采用CRISPR/Cas9技术敲除FGF5基因并未对陕北白绒山羊的健康产生影响,但部分存在显著差异的血液生理生化指标有待进一步研究。     

MSTN基因对牛肌动蛋白细胞骨架调节通路的影响

为探究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究前期利用定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析野生型蒙古牛（MG.WT）和MSTN^+/-蒙古牛（MG.MSTN^+/-）腿臀肌肌肉组织中蛋白质水平和磷酸化修饰水平的差异变化,使用已建立的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,检测设计合成的MSTN siRNA （si-MSTN）干扰效果;采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测转染si-MSTN的增殖期（GM）和分化第3天（DM3）牛骨骼肌卫星细胞中肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因的mRNA和蛋白水平的表达变化,研究敲低MSTN表达对肌动蛋白细胞骨架调节通路的影响。结果显示,在MSTN^+/-蒙古牛肌肉组织中共鉴定到16个肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因表达丰度上调;转染si-MSTN细胞中的MSTN表达水平极显著降低（P<0.01）;在转染si-MSTN的GM期牛骨骼肌卫星细胞中,肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因ENAH、ACTN4和Cdc42的mRNA水平均显著升高（P<0.05）,PFN1、RhoA和ACTN4的蛋白水平均显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）;在转染si-MSTN的DM3牛骨骼肌卫星细胞中,ENAH、CFL1、SCIN和Cdc42基因mRNA水平均显著升高（P<0.05）,RhoA基因mRNA水平极显著升高（P<0.01）,PFN1和ACTN4的蛋白水平均显著升高（P<0.05）。结果表明,干扰MSTN可以促进肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因的表达,探明了MSTN可能通过介导肌动蛋白细胞骨架调节通路影响牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的分子机制,为进一步研究MSTN对牛成肌分化的调控机制提供参考。     

干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为研究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,本试验以牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型为对象,以前期设计合成3个干扰RNA（si-MSTN-1、si-MSTN-2、si-MSTN-3）并对其进行干扰效果筛选为基础,将干扰效果极显著的si-MSTN-2（si-MSTN）转染牛骨骼肌卫星细胞,通过EdU染色法检测干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;进一步对干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过肌管形成状态和分化标志因子综合分析干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：首先通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,然后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyoG和MyHC在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果显示,干扰MSTN后,牛骨骼肌卫星细胞中EdU阳性细胞率极显著增加（P < 0.01）,说明下调MSTN表达极显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现增大趋势,牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC在mRNA和蛋白水平的表达均极显著高于对照组（P < 0.01）,说明下调MSTN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰MSTN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。本试验结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究提供了参考。     

5龄食桑天数对全茧量和茧层量的影响

目前，饲养家蚕形式大多是以各农户饲养为主，蚕农在定蚕种时，往往订种量偏多，结果，饲养至大蚕期，蚕儿就没有足够的桑叶喂了，造成蚕儿饥饿上蔟现象，影响到产量及经济收入。通过试验，让广大蚕农知道5龄期缺叶如何技术处理。     

曲马多对大鼠不同脑区AMPK表达量的影响

为研究曲马多(tramadol,INN)作用下大鼠不同脑区AMPK(腺苷单磷酸活化蛋白激酶)表达量的变化,探讨INN的中枢镇痛机制,将30只SD纯种大鼠随机分为对照组和INN组(Q组),Q组又分为4个亚组:Q1组(注射INN后10min)、Q2组(注射INN后20min)、Q3组(注射INN后40min)和Q4组(注射INN后60min),各组大鼠到达预定的时间点后分别采取脑组织,应用RT-PCR法检测脑内AMPKα1、α2mRNA转录量,应用Western blot方法检测p-AMPK蛋白的相对表达量。结果显示:腹腔注射INN后引起大鼠各脑区AMPKα1、α2mRNA高效表达,各时期AMPKα1、α2mRNA表达与对照组比较差异显著(P<0.01或P<0.05);在小脑区p-AMPK蛋白的相对表达量在10min时间点与对照组比较差异极显著(P<0.01),在大脑皮层、丘脑和脑干区其相对表达量在40,60 min时间点与对照组比较差异显著(P<0.01或P<0.05),海马区则只在40min时间点差异极显著(P<0.01)。结果提示,大鼠各脑区的AMPK参与了INN的镇痛过程,而INN的镇痛机制可能与AMPK的高效表达有关。     

阿勒泰羊羔羊MSTN mRNA表达的发育性变化

肌肉生长抑制素（MSTN）是一种骨骼肌生长发育的负调控因子.试验以不同生长阶段的阿勒泰羊羔羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术测定了肌肉和脂肪组织中MSTN mRNA相对表达量.比较该基因在不同月龄阿勒泰羊羔羊肌肉和脂肪组织中的表达差异.结果表明：阿勒泰羊0～6月龄羔羊MSTN mRNA在肌肉和脂肪组织中均有表达.4月龄羔羊MSTN mRNA表达量在肌肉中最高,0～4月龄的表达量逐渐上升,4～6月龄逐渐下降.6月龄羔羊脂肪中的MSTN mRNA表达量最高.不同月龄阶段阿勒泰羊羔羊肌肉和脂肪MSTN mRNA表达量存在差异,这些差异可能会影响其生长发育和产肉性能等指标,这对进一步理解MSTN基因的调控作用奠定了基础.