ITS鉴定真菌病原：一例司法鉴定研究实例

本研究选择一例疑似空气污染物伤害松树的司法鉴定案作为研究实例,在现场勘察和初步形态鉴定的基础上,应用ITS序列分析鉴定了对疑似空气污染物伤害松树的病原做了分子鉴定。我们对委托鉴定的疑似空气污染物伤害松树的地及周边地区进行了勘查,现场勘查结果并不支持空气污染物伤害松树的看法。为明确松树枯死的原因,对取样病枝上的疑似病原物进行了显微镜观察和培养性状观察,根据显微镜下孢子的形态和病原菌的培养性状,初步判断导致马尾松枯死的病原可能为拟盘多毛孢属（Pestalotipsis）真菌。为进一步确定病原种类,我们应用分子生物学技术对危害马尾松的病原物进行了ITS分子鉴定。测定了疑似真菌的ITS序列,并进行了比对和系统发育分析。研究结果表明,导致松树枯死的病原菌系韦司梅拟盘多毛孢（Pestalotipsis vismiae）。在本研究案例中,利用真菌ITS序列的系统发育分析,快速、准确地鉴定了真正导致松树枯死的病原,为今后类似司法鉴定案件审理提供了证据鉴定的新手段。     

我国南方野生樱属植物的分子系统发育分析

为鉴定我国樱属植物的系统发育关系,本研究以30种典型樱属植物为试验材料,利用核基因ITS和4个叶绿体间隔序列[petA-psbJ、trnH-psbA、rpl32-trnL(UAG)和trnL-trnF]进行测序,采用MEGA 6软件对5个序列特点进行分析,并构建系统发育树。结果表明,5个序列的DNA片段长度多态性和单核苷酸多态性较高,其中ITS和rpl32-trnL(UAG)变异程度最大,可作为樱属植物核心条形码序列,其他序列可作为辅助序列;通过5个序列的组合序列构建的系统发育树,可相对准确地反映樱属植物间的系统发育关系。本研究结果为进一步探究樱属植物的起源、系统发育关系、物种鉴定及资源保护提供了一定的参考依据。     

甘肃本地产当归、黄芪和大黄的rDNA ITS序列分析

本研究采用改良CTAB法分别提取18份甘肃本地产当归、黄芪和大黄基因组DNA,并用PCR分别扩增其ITS1-5.8S-ITS2序列、直接测序并作序列同源性比对分析。双向测序分析结果表明,甘肃6个不同产地当归rDNA的ITS1、5.8S和ITS2序列一致,片段长度分别为215bp、162bp和223bp;供试的黄芪ITS1、5.8S和ITS2序列分别为228bp、164bp和210bp;大黄ITS1、5.8S和ITS2序列分别为160bp、159bp和164bp。供试材料的ITS1-5.8S-ITS2核苷酸序列已提交GenBank。本研究为提供甘肃当归、黄芪和大黄指纹图谱鉴别的分子标记、其道地性药材的分子鉴定和品质评价提供参考。     

浙江乐清铁皮石斛rDNA ITS序列的克隆及序列比对

为判断浙江乐清铁皮石斛（Zhejiang Dendrobium officinale）与石斛属（Dendrobium）其它物种的亲缘关系,本文提取了该石斛鲜样的DNA,利用真核生物ITS序列通用引物ITS4/ITS5进行了扩增,并将扩增产物连接转化至大肠杆菌,在对阳性克隆测序。将得到的序列与GenBank上我国石斛属12个组中34个种的rDNAITS进行了比对,并在此基础上构建了系统发育树。序列比对结果表明浙江乐清铁皮石斛的rDNAITS与黄石斛（D.tosaense）一致,其次与铁皮石斛（D.officinale）最相近,序列相似性99%。系统发育树也表明浙江乐清铁皮石斛的rDNAITS序列与黄石斛（D.tosaense）的相似程度高于其与铁皮石斛（D.officinale）的相似程度。本研究将为利用ITS序列鉴别石斛物种种属关系提供参考。     

用ITS序列识别牧草种质资源

DNA条形码技术能够快速、准确地识别物种,对于开展基础性的分类学研究和应用性的生物多样性研究极为重要。本文以广西畜牧研究所牧草种质资源圃的8个物种共22个品种为材料,进行植物条形码ITS测序。PCR结果显示ITS的扩增成功率达到100%,同源性的分析表明各物种中的ITS序列变异显著,共找到99个可以用来区分物种的变异位点,系统进化树的结果表明利用ITS序列进行物种水平鉴定成功率达100%,能够作为DNA条形码识别植物物种。     

基于核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列鉴定四季青及其近缘种和混伪品

中药材四季青(Ilicis Chinensis Folium)的基原植物冬青(Ilex chinensis)是重要的园林观赏物种。利用DNA条形码技术可以快速、准确鉴定四季青及其近缘种和混伪品。本研究以冬青、铁冬青(Ilex rotunda)、秤星树(Ilex asprella)、枸骨(Ilex cornuta)和女贞(Ligustrum lucium)等37份植物样本为实验材料,提取全基因组DNA,扩增核糖体DNA第二内部转录间隔区(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列并进行双向测序。测序结果利用Codon Code Aligner 4.2.7进行序列拼接,获得高质量ITS2序列。同时从Gen Bank中获得28条冬青的同属近缘种以及混伪品女贞、四川山矾(Symplocos setchuensis)的ITS2序列。基于隐马尔科夫模型(hidden Markov model,HMM)注释5.8S和28S,获得完整的ITS2区域,进而应用MEGA6.0(molecular evolutionary genetics analysis)进行冬青种间和种内序列分析,计算种内种间K2P(Kimura 2-parameter)遗传距离,构建邻接树(neighbor-joining tree,NJ tree)。结果表明,琼脂糖凝胶电泳得到清晰明亮的均一条带,说明利用通用的ITS2引物可以成功扩增到用于测序的PCR产物。通过PCR产物测序、数据处理和序列分析可知,冬青种内ITS2长度经过比对后为239 bp,全部样品的种间ITS2比对后长度为269 bp。冬青种内有4个变异位点以及6个单倍型,种间有143个变异位点,远远多于其种内变异位点。MEGA6.0分析结果表明,种间最小K2P遗传距离(0.094)大于种内最大K2P遗传距离(0.013)。邻接树显示,女贞和四川山矾分别以100%的自展支持率分别聚类,表现出良好的单系性,冬青属物种聚为一大支。冬青在冬青属下可以单独聚为一支,可以进行区分。冬青属其他物种以同一亚属聚为一支。研究结果表明,作为一种快速、准确、简便的分子生物学鉴定方法,ITS2可以应用于冬青及其近缘种和混伪品的鉴定,同时对于准确鉴定冬青属物种亦有巨大潜力,可为冬青属植物在临床上的用药安全和开发应用提供科学依据。     

DNA条形码与实时荧光定量PCR技术在铁皮石斛鉴定中的应用

为建立铁皮石斛准确、高效的鉴定体系,本研究以101份石斛属和蝴蝶兰属植物样品为试验材料,通过对比ITS、psbA-trnH、matK及rbcL基因在石斛属植物中的鉴定能力,筛选出ITS作为本研究最理想的DNA条形码。以ITS序列作为靶基因,设计铁皮石斛特异引物和特异探针,以及石斛属通用引物和探针,利用实时荧光定量PCR(TaqMan)技术,建立铁皮石斛多重实时荧光PCR检测新体系,通过特异性、灵敏度和实际样本验证,发现参试样品中的25份铁皮石斛均可被有效鉴定,与其他鉴定方法相比,该方法具有特异性强、灵敏度高(高出普通PCR 100倍)、重复性好且高效经济的优势。本研究结果对铁皮石斛的资源保护与利用起到了积极作用。     

玉米根际土球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的分离与鉴定

为明确虫生真菌在玉米根际的分布情况,通过选择性培养基对采自安徽省涡阳、萧县、蒙城3地的玉米根际土壤中的虫生真菌进行了分离,并结合形态特征及r DNA ITS序列分析对分离的菌株进行了鉴定。结果表明,从玉米根际土壤中共分离得到39个白僵菌菌株,经鉴定均为球孢白僵菌(Beauveria bassiana),且不同菌株间的菌落生长速度和分生孢子产生量存在显著差异。本研究对丰富玉米地下害虫及土传病害的生物防治资源具有重要的意义。     

基因组ITS序列分析鉴定红曲霉菌株

为建立有效的红曲霉分类鉴定方法,进一步发掘和保护红曲霉菌株生物资源,以福建省内各类红曲霉生产菌株为主要材料,采用MEGA 5.10软件对其ITS序列进行分析,构建系统发育树,结合在麦芽汁琼脂培养基、察氏酵母提取物琼脂培养基和甘油硝酸盐琼脂培养基上的菌落形态特征以及生理生化试验对41株红曲霉进行分类鉴定。试验结果显示41个红曲霉菌株的ITS序列长度为520bp左右,嘌呤嘧啶(GC)含量比例在56.2%~58.0%,41个不同序列间的平均遗传距离为0.0052。经分子生物学手段分析,辅以菌落形态观察和生理生化试验,最终将41株红曲霉鉴定为紫色红曲霉、丛毛红曲霉、橙色红曲霉、红色红曲霉、烟灰色红曲霉和白色红曲霉6大类。     

松材线虫与拟松材线虫rDNA中ITS区的比较研究

本研究利用PCR－RFLP和DNA测序技术分析了松材线虫和拟松材线虫rDNA中的ITS区。ITS区界于rDNA的18S和28S基因之间,并被5.8S基因分为ITS1和ITS2两个区。5种限制性内切酶酶切结果表明,松材线虫和拟松材线虫rDNA的ITS区存在着显著的差异;在松材线虫不同来源株系中,来自中国和日本的株系的酶切图谱一致,与来自加拿大的株系有着微小差别。对南京和日本的松材线虫及富阳的拟松材线虫株系ITS1区的序列分析显示在ITS1的280bp中,南京和日本的松材线虫株系之间,同源性高达99.7%,而来自富阳的拟松材线虫与南京和日本的松材线虫ITS1区序列的同源性相对较低,分别为90％和89.6%。     

青花菜乙烯反应传感蛋白基因BoERS的克隆与表达分析

乙烯反应传感蛋白在乙烯信号转导中起着重要作用,可作为负调控因子使下游的CTR1失活,并激活之后的一系列反应。为明确青花菜ERS基因的序列特征和表达特点,本研究以青花菜为试验材料,在克隆乙烯反应传感蛋白基因BoERS的基础上进行表达分析,以明确其在核盘菌和根肿菌侵染下的表达模式。结果表明,BoERS的基因组DNA全长为1 928 bp,含有1个长度为68 bp的内含子;编码区全长为1 860 bp,编码619个氨基酸,编码蛋白有4个跨膜结构域、1个GAF结构域和1个HisKA结构域。序列比对结果表明,BoERS与芸薹属ERS序列的差异最小,在系统发育树上处于同一分支,但与萝卜属、盐芥属和拟南芥属植物ERS序列的差异较大,在系统发育树上处于不同的分支。实时荧光定量PCR结果表明,BoERS的表达受核盘菌的诱导,36 h时表达量最大,为对照的3.53倍,但BoERS的表达不受根肿菌的诱导。本研究结果为进一步开展BoERS基因功能鉴定和应用研究奠定了理论基础。     

大白菜抗软腐病基因BrWRKY33植物表达载体的构建

利用农杆菌侵染法获得抗软腐病转BrWRKY33基因大白菜,首先要构建植物表达载体。本实验根据BrWRKY33基因的序列及pROK2表达载体的酶切位点设计引物(FN/RN),获得BrWRKY33基因,然后将该基因连接到克隆载体pGEM-TEasy,重新构建了克隆载体T-WRKY。经测序及酶切验证,选取PCR反应中错配率最低的产物,构建了表达载体pROK2-WRKY,并将该表达载体转入到根癌农杆菌EHA105中,并对其转化子进行了鉴定。结果表明,PCR扩增获得目的基因BrWRKY33全长约1443bp,PCR及酶切结果鉴定表明克隆载体T-WRKY已经重新构建成功。表达载体的PCR及BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定表明有4个重组子表现阳性,表明目的基因已经插入到pROK2表达载体,表达载体构建成功。PCR鉴定表明表达载体pROK2-WRKY已经转入根癌农杆菌EHA105中。本实验结果将为进一步研究大白菜抗软腐病基因的转化奠定基础。     

DNA条形码与FTIR在石斛分析中的联用

目前市面上石斛种类混淆和以次充好现象的频发。为建立石斛快速分析鉴定体系,测试常用的植物DNA条形码能否适用于石斛鉴定,并探讨DNA条形码与FTIR联用的可行性,本研究选择常用的植物DNA条形码并结合FTIR技术对市面上常见的9种石斛进行了分析。结果表明,9种石斛的ITS2序列的种间遗传距离最小值大于种内遗传距离最大值,且平均种间遗传距离为平均种内遗传距离的58倍。ITS2序列具有作为石斛鉴定DNA条形码的潜能,且优于psb A-trn H序列的石斛鉴别能力。此外,基于FTIR还获取了9种石斛的特异性红外光谱,并基于峰形、峰高、峰强等进行了简单的组分分析,发现金钗石斛、铁皮石斛、铜皮石斛和密花石斛具有相对较高的含糖量。本研究首次将DNA条形码与FTIR技术联用,为石斛的快速分析鉴定提供了可能。     

青花菜转录因子基因BoNAC1的克隆与表达分析

为明确青花菜NAC转录因子基因的序列特征和表达特点,本研究以青花菜为试验材料,在克隆Bo NAC1转录因子基因的基础上,采用RT-q PCR研究该基因的表达,以明确其在核盘菌和根肿菌侵染下的表达模式。结果表明,Bo NAC1含2个内含子,长度分别为1 832 bp和670 bp,编码区全长为1 035 bp,编码344个氨基酸,含1个NAM结构域;系统发育树分析结果表明,Bo NAC1与来自芸薹属的NAC亲缘关系最近,并与其他十字花科NAC聚为一组,而与豆科、蔷薇科NAC的亲缘关系相对较远,在系统发育树上处于不同的分支。基因表达分析结果表明,Bo NAC1的表达受核盘菌的诱导,在12 h和24h时的表达量最高,分别为对照的6.28倍和7.03倍;Bo NAC1的表达还受根肿菌的诱导,15 d和20 d时的表达量最高,分别为对照的4.23倍和4.11倍,表明该基因可能参与核盘菌和根肿菌的应答反应。本试验对青花菜Bo NAC1基因的克隆与表达分析,为Bo NAC1基因的功能鉴定和生产应用奠定了理论基础。     

尖孢镰刀菌异核体及其不同核型分离子rDNA ITS区序列分析

选取从河南棉花上分离的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）异核体菌株Ag149及其两个表型差异显著的同核型分离了Ag149－Ⅰ和Ag149－Ⅲ为材料，对它们的核糖体基因ITS区段进行测序分析。结果表明，供试菌株核糖体基因ITS区段碱基组成完全相同，与GenBank中镰刀菌的ITS区序列进行同源性比较发现，属内种间的同源性在34％－99％之间，而大部分尖孢镰刀菌种内不同菌株之间的同源性均在98％以上。序列分析表明，ITS区对镰刀菌属内种间的差异鉴别具有参考价值，但看来并不适合尖孢镰刀菌内或种以下水平的鉴定和分类。     

马铃薯黑痣病菌AG2-1和AG3融合群分析

采用菌丝融合分类法对立枯丝核菌进行融合群的划分,有时不能准确地反映该菌群体间的遗传变异.本研究通过菌丝融合反应、ITS序列分析对马铃薯黑痣病菌(Rhizoctonia solani)AG2-1和AG3两个融合群进行了遗传变异研究.对马铃薯黑痣病菌AG2-1和AG3融合反应测定表明,AG3融合群菌株间为完全融合,而AG2-1菌株间存在完全融合和不完全融合现象,根据不完全融合现象可将AG2-1划分为两组.通过ITS序列构建的系统发育树表明,AG3形成单一的分支,而AG2-1可分为明显的两个分支,并且AG2-1和其内部分化出的AG2-1-1和AG2-1-2两个亚分支长度要大于AG3融合群,这说明AG2-1正在发生着明显的遗传分化.基于AG2-1不完全融合反应将其划分的两组与ITS序列分析划分的两个分支完全吻合,因此,不完全融合现象可作为融合群不断分化的参考指标.     

甜橙β-胡萝卜素羟化酶cDNA克隆及其瞬间反义表达*

根据已报道的温州蜜柑(Citrus unshiu)β-胡萝卜素羟化酶(BCH)cDNA序列(AF296158)，设计1对引物，以华盛顿脐橙(C.sinensis)成熟果实cDNA为模板，采用PCR扩增出1条长为1057bp的cDNA片段，将此片段克隆入pUCm—T载体，测序结果表明，所得序列与已报道序列同源99．62％，表明所获得的基因是BCH基因。将该基因反义插入到pBI121中构建成反义植物表达载体，其正确性得到测序的鉴定。含有该植物表达载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)在脐橙白皮层中诱导了β-胡萝卜素积累。     

谷子硫解酶基因家族鉴定及表达模式分析

硫解酶(thiolase)是脂肪酸代谢的关键酶,在植物次生代谢合成、生长发育以及抵抗非生物胁迫中均发挥重要作用.为探究谷子硫解酶基因家族的基本特征,本研究利用生物信息学方法,对谷子硫解酶基因家族成员进行了鉴定,对蛋白理化性质及系统进化、基因结构、染色体位置、启动子、基因进化进行了分析;采用转录组测序进行了根、茎、叶、穗...     

广西沿海地区红树林根系土壤中放线菌的分离与鉴定

本研究通过分离纯培养,从广西北海及防城港红树林根系土壤中分离出放线菌并提取其总DNA,用放线菌通用引物对获得菌株的16SrDNA进行PCR扩增,对获得的扩增产物进行DNA序列测定及菌株鉴定。研究结果表明,从红树林根系土壤样品中分离出15株典型放线菌菌株。16SrDNA测序比对鉴定结果显示,15株典型放线菌菌株中有12株属于链霉菌属（Streptomyces）,是常见菌属;3株属于拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）,为稀有放线菌。本研究分离纯化获得15株典型放线菌,初步揭示了广西沿海地区红树林土壤中放线菌的多样性。