翦股颖EST-SSR信息分析与分子标记开发

为加速分子标记在翦股颖中的应用,利用GenBank中翦股颖EST数据信息,展开了翦股颖EST-SSR信息分析和标记开发研究。在16992条翦股颖EST序列中,共发现微卫星序列254条,占整个EST总数的1.49%。EST序列总长为12717kb,平均每50.07kb含有1个SSR。EST-SSR分布特征分析表明,在所有SSR中,六核苷酸基序最多(37.80%),三核苷酸基序(31.10%)次之;六核苷酸基序以TGCGGC/ACGCCG出现频率最高(3.15%),TCCAGC/AGGTCG次之(2.36%);三核苷酸基序以CAG/GTC出现频率最高(10.63%),其次分别为GCA/CGT(3.54%)、GAT/CTA(2.36%)和AAG/TTC(2.36%)。根据这些含有SSR的EST序列,利用Pri mer 5.0软件,设计了77对EST-SSR引物,并选择其中15对引物进行合成。15对引物在翦股颖中均有PCR扩增条带。利用这些引物,选用8个翦股颖品种进行多态性研究,其中9对EST-SSR引物有多态性,共检测到23个多态性位点,平均每对引物产生2.56个多态性位点。     

基于桑树转录组测序的SSR标记开发和引物筛选

以桑树品种抗青10号植株的幼叶和根部为材料进行高通量转录组测序,获得60 069条unigene序列,运用MISA软件从中搜索到10 268个SSR位点,并针对这些SSR位点建立了EST-SSR引物数据库。从EST-SSR引物数据库中随机挑选100对SSR引物对抗青10号植株叶片的基因组DNA进行PCR验证,有87对引物可以扩增出条带,其中58对引物扩增的片段大小与预期相同,26对引物扩增的片段大于预期片段,3对引物扩增的片段小于预期片段。100对引物涉及的SSR位点中,基序重复单元长度为3个核苷酸的占46%,为2个、4个、5个、6个核苷酸的分别占12%、10%、10%、22%。KEGG代谢通路分析100对引物所在unigene的功能主要涉及新陈代谢、甘油磷脂代谢、醚脂代谢等途径,扩增条带最多的引物SSR28所在的Unigene5642主要参与新陈代谢。实验结果证明了基于高通量桑树转录组测序数据开发SSR标记的可行性及高效性。     

基于EST数据的柞蚕SSR标记开发

柞蚕SSR标记的开发对研究柞蚕的遗传与进化、分子遗传图谱构建、功能基因定位和克隆等有重要意义。从1 500条柞蚕表达序列标签(EST)中鉴定了71个SSR位点,平均5.2 kb出现1个SSR位点,在1~6个碱基的重复基元中,以3个和4个核苷酸重复为主导类型。设计合成了29对EST-SSR引物,通过PCR扩增和电泳检测鉴定了7对具有多态性的引物,测序验证结果表明其中的4对为有应用价值的EST-SSR标记。建立的利用EST数据开发柞蚕SSR标记的方法,有助于进一步大量开发柞蚕SSR分子标记。     

菊苣EST-SSR分子标记开发及通用性分析

为了开发菊苣(Cichorium intybus)简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)分子标记,采用菊苣表达序列标签(Expressed sequence tags,EST)序列设计EST-SSR引物,并验证引物的有效性和通用性.结果表明:菊苣EST序列中共搜索到648个SSR位点,14...     

多花黑麦草品种间杂交F2代分子标记遗传分析

运用序列相关扩增多态性(SRAP)和微卫星标记(SSR)技术对6个多花黑麦草亲本品种及其9个杂交F₂代组合80份材料进行遗传分析。筛选出具有多态性的15对SRAP引物、16对SSR引物,SRAP标记平均每对引物扩增出16.7条带,多态性位点百分率为68.88％。SSR标记平均每对引物扩增出14.75条带,多态性位点百分率为58.05％。通过聚类树状图分析得出结论,杂交F₂代内同一组合基本聚为一类,长江2号×剑宝和长江2号×阿伯德组合除外;父本和母本与其杂交F₂代遗传距离与聚类结果基本一致。同时还发现SRAP标记对杂交F₂代及亲代聚类分析可靠性高于SSR标记。     

苏丹草转录组SSR分子标记开发及遗传多样性评价

苏丹草是一种高产优质的禾本科牧草,优质分子标记的缺乏成为苏丹草育种工作顺利开展的限制性因素。本研究基于高通量测序结果开发苏丹草EST-SSR标记,并对34份苏丹草和2份高丹草种质资源进行了遗传多样性分析,验证所开发的EST-SSR引物的可应用性。从苏丹草转录组的80686条序列中鉴定出17548个SSR位点分布在13574条序列中,分布频率为16.82%。一、二和三核苷酸重复分别占38.59%、19.18%和39.09%,SSR重复基元的重复次数分布在5~23次;开发的300对引物扩增成功率达73.67%,其中54对多态性引物在36份供试材料中共扩增出275条带,其中多态性条带有205条,多态位点百分率(PPB)为73.05%,多态信息含量(PIC)平均值为0.41,遗传距离的变化范围为0.3922~0.9020;聚类分析结果将36份供试材料分为3大类群,相同品种的材料大致聚为一类,材料间的聚类与地理来源呈一定的相关性。以上结果证明了利用苏丹草转录组数据开发SSR标记的可行性并揭示了供试材料间具有丰富的遗传多样性,为苏丹草及近源物种种质资源的多样性水平和变异分析以及分子标记辅助育种等研究提供依据。     

偃麦草EST-SSR标记开发及应用

利用NCBI数据库中偃麦草(Elytrigia repens)EST序列开发偃麦草EST-SSR引物,并对47份偃麦草资源进行遗传多样性分析,验证所开发EST-SSR引物在偃麦草上的可应用性。结果显示,在27 891条偃麦草EST序列中可以搜索到SSR位点1 068个;其中六核苷酸重复序列最多,占总SSR的53.83%;二、三、四、五、六核苷酸优势重复基元及出现频率分别为AC/TG(2.72%)、CGC/GCG(1.87%)、CGAC/GCTG(5.24%)、CCGCC/GGCGG(0.37%)、CAGCTC/GTCGAG(3.37%)。开发的105对偃麦草EST-SSR引物中有64对引物(60.95%)可以有效扩增;随机选取18对多态性引物对47份偃麦草进行遗传多样性分析,其多态性百分率为78.64%,多态性指数(PIC)为0.22~0.83。以上结果表明,开发的偃麦草EST-SSR标记是有效的,有较高的应用价值,为偃麦草遗传多样性、重要性状关联分析研究奠定了基础。     

高粱EST-SSR标记的建立及其在苏丹草中的应用初探

从NCBI中下载了202 325条高粱Sorghumbicolor EST序列。去除低质量和冗余的序列后,在5 661条高粱EST中共发掘出了6 663个SSR位点,出现频率是20.19%,平均分布频率是1/3.93 kb。在5 197条EST序列中,共有3 446条序列能够设计引物,占总数的66.3%。在高粱EST-SSR中,三核苷酸重复是主要的重复类型,出现最多的重复基元是GGC/GCC。在3 446对高粱EST-SSR引物中,随机选择了20对引物进行了合成。以苏丹草Sorghumsudanense722和高粱Sorghumbicolor TX623A为模板,用这20对引物进行PCR扩增,结果全部可以扩增出条带,可用率为100%,有差异的有4对,多态性比率为20%。研究结果证明了根据高粱EST建立SSR标记是有效、可行的。     

沙鞭转录组简单重复序列(SSR)位点特征分析

沙鞭是禾本科、沙鞭属的一种多年生大型根茎类草本植物,主要分布于青海柴达木盆地和内蒙古高原及其毗邻荒漠地区,具有较强的耐旱、耐寒、耐碱、抗风沙和抗病能力。本研究使用MISA(Microsatellite identification tool)软件对沙鞭全长转录组测序获得的184 076条Unigenes的SSR位点进行搜索和特征分析,共获得3 563个SSR重复序列,分布于56 824条Unigenes上,SSR发生和出现频率分别为30.87%和50.83%;重复类型以单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复为主。单核苷酸重复中,(A/T)_n基元类型占总SSR位点的42.26%;二核苷酸重复优势基元类型为(AG/CT)_n,占总SSR位点的9.29%。SSR数量随重复次数增加而降低;重复次数类型随基元序列长度增长而减少。此外,本研究还得到沙鞭29 444条和10 864条Unigenes的KOG和GO注释,其主要集中于翻译后修饰、蛋白质周转、催化活性和代谢过程。因此,本研究认为沙鞭转录组SSR序列呈现较高的多态性潜能,具有较大的开发价值,为今后沙鞭分子...     

青海草原毛虫转录组分析及SSR位点开发

青海草原毛虫(Gynaephora qinghaiensis)是青藏高原牧区重要的害虫之一。本研究采用Illumina HiSeq^TM2000高通量测序平台对青海草原毛虫成虫和4龄幼虫进行转录组测序，在此基础上筛选其微卫星(Single sequence reperts, SSR)位点并挖掘微卫星引物。本研究共获得63 335条unigenes,有12 597个微卫星位点分布于9 851条unigenes中。通过KOG,GO注释和KEGG通路数据库分析发现，unigenes注释主要集中于一般功能预测、细胞进程和碳水化合物代谢过程。SSR重复类型主要为单核苷酸和二核苷酸重复，(A/T)_n是单核苷酸重复中最主要的基元类型，占总SSR位点的71.37%,(AC/GT)_n为二核苷酸重复的优势基元，占总SSR位点数的6.06%,且SSR数量随重复次数增加而降低，重复次数类型随基元序列长度增长而减少。利用Primer 3软件设计出2 714对青海草原毛虫SSR引物，随机挑出25对引物进行PCR验证，有11对引物扩增出目的DNA片段。...     

紫花苜蓿耐苏打盐碱相关基因的转录组学分析

为了揭示紫花苜蓿适应苏打盐碱环境胁迫机制,本试验采用Illumina HiSeq 4000测序技术对紫花苜蓿叶片进行转录组测序并对基因进行功能预测,测序共获得91 853个Unigenes,总碱基数为65 369 474 bp。Unigenes序列长度分布显示,测序质量较好,可信度高,其中,45 540个Unigenes与其它生物的基因有不同程度的同源性,通过GO,COG及KEGG数据库注释,将Unigenes具体定位到次生代谢物的生物合成途径、抗生素合成途径、光合作用途径等。紫花苜蓿叶片苏打盐碱胁迫响应中GH3,MYB,HSF等转录因子均发生不同程度的上调,而EREBP转录因子总体受到抑制,同时候选了4CL,PP2C基因及相关转录因子。从91 853个Unigenes中共检测到10 949个SSR位点,包括6类核苷酸基序,A/T出现频率最高,其次为AG/CT和AAG/CTT。qRT-PCR荧光定量检测5个基因的表达趋势与RNA-Seq分析结果一致,证明RNA-Seq测序的可靠性。本研究通过对紫花苜蓿转录组研究,为优质牧草的分子生物学研究提供数据库来源。     

柱花草花粉不育基因连锁的SCAR标记研究

本研究以圭亚那柱花草‘1979’（Stylosanthes guianensis ‘1979’,母本,花粉不育）和‘热研2号’柱花草（轮回父本）的BC₁F₁代群体为材料,利用简单序列重复区间扩增多态性（Inter-simple Sequence Repeat,ISSR）技术,结合集群分组分析法（Bulked Segregate Analysis,BSA）构建花粉育性基因池。结果表明：利用100条ISSR引物筛选出在不育基因池中有特异条带的引物共11条;经BC₁F₁群体单株验证,有8个标记仅在花粉不育个体中出现,表明其与花粉不育基因连锁;将这8个特异性片段回收、克隆、测序,并分别设计8对特异序列特异扩增区域（Sequenced Charaeterized Amplified Region,SCAR）引物,对BC₁F₁单株进行验证,发现这8条片段仅在不育个体中扩增出目标条带,表明8 ISSR特异片段成功转化为8个SCAR标记。本研究结果为建立柱花草稳定的雄性不育系提供新的理论基础,为柱花草杂交育种奠定基础。     

紫花苜蓿细胞质雄性不育系和保持系SCAR标记的鉴定研究

本研究通过已获得细胞质雄性不育系材料MS-GN-1A和保持系材料MS-GN-1B筛选与紫花苜蓿细胞质不育恢复基因高度连锁的分子标记并转化为SCAR特异标记,经鉴定分析发现该标记的重复性好,而且稳定,对紫花苜蓿“三系”配套中不育系种子生产鉴定提供研究基础。实验应用100条ISSR引物在紫花苜蓿线粒体基因组水平进行筛选,UBC842、UBS864引物在紫花苜蓿不育系及其同型保持系间显示出特异性片段,经反复验证,其差异条带均稳定出现,条带大小分别为457 bp和645 bp。对已获得的差异条带进行胶回收连接克隆载体后测序并转化为SCAR特异鉴定标记,以两对特异性引物对新培育的4组紫花苜蓿杂交种的不育系母本和同型保持系父本进行鉴定分析,发现该SCAR标记的重复性稳定。本研究通过ISSR标记对紫花苜蓿的不育系与保持系进行分析,将得到的差异片段克隆测序后转化为SCAR特异标记,该标记可以作为紫花苜蓿不育系种子纯度分析的候选标记,实际应用于不育系种子纯度的鉴定。     

假俭草抗寒性状与低温胁迫响应EST分子标记的关联分析

为深入研究抗寒分子机理以及为分子标记辅助育种奠定基础,以具有代表性的96份种源为材料,利用假俭草(Eremochloa ophiuroides)抗寒品种TifBlair低温诱导后所得的EST及其近缘种高粱NCBI中低温胁迫响应的EST开发分子标记,对假俭草抗寒指标LT₅₀观测值和EST分子标记位点进行关联分析.结果表明:开发的17对引物在假俭草群体共扫描到46个多态遗传位点,其中CINAU114-900,CINAU115-1500和CINAU116-400位点与抗寒指标LT₅₀有显著关联,其表型变异的解释率分别为5.10%, 4.04%和4.59%;其LT₅₀表型效应分别为0.2518℃,-0.3121℃和0.2449℃.CINAU114-900和CINAU116-400位点提高假俭草对低温的敏感性,而CINAU115-1500位点可提高其抗寒性.     

基于RNA-Seq测序的高、低产双黄蛋高邮鸭卵巢组织SNP筛选分析

试验旨在进一步完善高邮鸭基因组结构信息,探索高邮鸭双黄蛋产蛋性能的调控机制。通过高通量测序技术对高邮鸭双黄蛋高、低产组卵巢组织转录组进行RNA-Seq测序,对测序数据进行质控和注释,筛选与高邮鸭双黄蛋产蛋性能相关的SNP位点。测序获得的初始数据（raw reads）进行系列质控筛选,6个高邮鸭卵巢组织分别获得84 540 140~87 479 660个有效数据（clean data）,70.79%以上的测序数据被已注释的鸭基因组数据覆盖;在所覆盖的基因组数据中,检测到位于基因外显子区域的108 260~116 478个SNP位点（转换和颠换类型）,转换类型总数极显著高于颠换类型总数（P<0.01）。利用KEGG数据库对筛选出的SNP位点所在基因进行信号通路分析,筛选出前20条信号通路,其中包括核糖体信号通路、碳代谢信号通路和氨基酸生物合成信号通路等。试验对双黄蛋高、低产组高邮鸭的卵巢进行了RNA-Seq测序分析,为发掘高邮鸭双黄蛋产蛋性能相关SNP位点提供了基础,为进一步研究高邮鸭双黄蛋产蛋性能的调控机制提供了新的数据支撑。     

不同不育比例对布氏田鼠种群增长的影响

在围栏条件下采用重捕法跟踪了不同比例不育个体对种群的影响.结果表明:正常繁殖组(对照)6-8月份均有新生小鼠,9月份以后停止繁殖.其中6月份雌鼠繁殖率为 5 %,7月份雌鼠繁殖率为0%,8月份雌鼠繁殖率为33%.繁殖期后,种群数量下降.在当年数量波动呈单峰型曲线.而各不育比例的试验组则均呈下降趋势;无论雄性或雌性的完全不育组的种群均在3-个月的时间内全部灭绝.说明在没有新生幼鼠的加入种群更替的情况下,由越冬鼠组成的种群将很快消亡;部分不育组的繁殖率均低于对照组.其中1/3雄性不育组及1/3雌性不育组的繁殖率均高于2/3雄性不育组及2/3雌性不育组,这种现象意味着该鼠的婚配制度并非混交制.在试验期间所有部分不育的种群均呈负增长;部分不育组中,当年出生的鼠没有参加繁殖.可能是不育个体干扰了其交配.因此,使用不育剂可能成为控制布氏田鼠种群数量的有效对策.     

基于全长转录组测序的盐生草SSR标记开发及其遗传多样性分析

以盐生草全长转录组数据为基础,用MISA在线软件对盐生草转录组水平SSR位点进行搜索,共鉴定到29640个SSR位点,每SSR的发生频率为4.93 kb。SSR种类包含1～6核苷酸重复类型,重复次数主要为4～20次,其中,三核苷酸重复单位最多,占38.25%;四核苷酸重复单位类型最少,仅占3.26%。鉴定到的327种SSR重复类型中,A/T、AG/CT、ATC/GAT、AAG/CTT重复类型出现次数较多。进一步地,对甘肃18个不同生态点盐生草材料进行SSR标记位点的开发及遗传多样性分析。从检测到的29640个SSR标记中选择218对标记进行多态性筛选,共筛选到多态性较高的33对标记,这些标记共检测得到199个等位基因位点,等位基因数(AN)为3～13个,平均为6.03个;基因多样性指数(GD)为0.583～0.869,平均为0.698;基因型数量(GN)为2～13,平均值为5.88;多态性信息含量(PIC)值为0.527～0.856,平均值为0.623。聚类分析结果表明,18个不同生态点盐生草的遗传相似系数(GS)为0.528～0.859,平均值为0.683。在GS为0.68处,可将供...     

紫花苜蓿细胞质雄性不育恢复基因的初步定位

以紫花苜蓿(Medicago sativa)不育系MS-GN-1A为母本,恢复系MS178为父本组合构建BSA分离群体,获得的F1代均表现为雄性可育,在大田种植了221株F2代群体单株,盛花期将花粉颗粒染色后,显微镜下观察统计出,不育的F2代株数为57,可育F2代株数164,并没有观察到半不育植株。将所有植株划分为可育和不育两组,并构建可育和不育DNA混池,混池DNA从可育和不育植株组DNA中各随机抽取20个样品,以此对恢复基因定位。随机挑选160对已知的四倍体苜蓿SSR引物扩增基因池DNA,获得2个具有多态性的分子标记,分别是Mt2c12、AW166,初步定位Rf基因在类群Composite5上。将类群Composite5上的所有引物进行合成,进一步进行引物筛选,最终获得4个具有多态性的标记BI68、Mt2c12、BG267和AW776153,遗传距离分别为19.0、20.9、44.6和72.1cM。     

桔梗雄性不育花蕾抗氧化及渗透调节物代谢特性研究

在桔梗花器官发育过程中,取不同发育时期的桔梗花蕾,测定其可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、可溶性蛋白质含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性和丙二醛含量,比较分析桔梗不育材料与可育材料花蕾发育过程中生理生化特性差异。结果表明,1)花前花蕾发育的各阶段,桔梗不育花蕾可溶性糖含量、游离脯氨酸含量和可溶性蛋白质含量均低于相应可育花蕾,其中尤以游离脯氨酸表现最为明显,随开花前花蕾的发育,可育花游离脯氨酸含量不断升高,而不育花蕾中其含量较低且变化很小。2)与可育花蕾相比,不育花蕾在发育过程中SOD、POD、CAT活性变化趋势基本相同,但其活性明显高于可育花蕾。3)在桔梗花蕾发育的各阶段,不育花丙二醛含量均明显高于相应可育花。桔梗不育花蕾(开花前)生长发育过程中,体内活性氧代谢紊乱、丙二醛积累及游离脯氨酸等“物质代谢损亏”可能是引起桔梗雄性败育的原因。