桑树1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶基因cDNA片段的克隆及原核表达与植物反义表达载体的构建

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶(RCA)对桑树的光合作用具有重要调节作用。以桑树幼叶为材料分离mRNA,反转录合成cDNA,以cDNA第1链为模板,根据RCA的保守区域设计1对兼并引物,经PCR扩增获得RCA的基因功能区中间片段。对得到的桑树RCA的cDNA片段编码氨基酸进行BLAST分析表明,其与GenBank中其它植物来源的RCA有较高同源性。将RCA的部分编码区插入原核表达载体pET30a(+),并转化到大肠杆菌菌株BL21中,经IPTG诱导,RCA的部分编码区在BL21菌株成功表达。将得到的RCA基因片段反向插入植物表达载体,构建了RCA基因反义表达载体pBI121-RCA,以利于进一步阐明RCA与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶相互作用和调控关系以及用基因工程手段深入探讨桑树光合作用机制。     

杀菌性/通透性增加蛋白的生物学功能及其应用

杀菌性/通透性增加(BPI)蛋白是哺乳动物中性粒细胞中存在的一种碱性蛋白,它能与革兰氏阴性菌脂多糖结合,增加外膜对抗菌药的通透性,具有中和内毒素和杀灭细菌的生物学作用,在革兰氏阴性菌感染的治疗方面有良好的发展前景。文章主要从分子生物学和病理学角度出发,对 BPI 蛋白的生物学杀菌活性和作用机理进行了综述,并展望了其应用前景。     

顶复门原虫类异戊二烯生物合成途径及其关键酶的研究进展

顶复门原虫包括疟原虫(Plasmodium spp.)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、艾美耳球虫(Eimeria spp.)、锥虫(Trypanosoma spp.)、泰勒虫(Theileria spp.)及巴贝斯虫(Babesia spp.)等一大类引起严重人畜疾病的寄生性原虫。顶复门原虫利用2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径合成类异戊二烯前体物质,这些化合物对于维持顶复门原虫的生存具有十分重要的作用。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)还原异构酶是MEP途径的关键酶,对其作用机理及抑制剂的筛选研究已取得重要进展。论文对顶复门原虫类异戊二烯的MEP途径,DOXP还原异构酶的作用机理及靶标研究进展进行综述。     

猪杀菌性/通透性增强蛋白(BPI)的功能及其在抗病育种中应用的研究进展

杀菌性/通透性增强蛋白（bactericidal/permeability-increasing protein,BPI）有较强的杀菌作用（主要为革兰氏阴性菌）和中和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）的活性,以及增强单核细胞和嗜中性粒细胞对病原菌的吞噬功能。近年来,BPI的生物学功能受到广泛关注,被称为机体内的“超级抗生素”,BPI基因被很多学者作为抗病候选基因进行探索。作者综述了猪BPI基因的结构、生物学功能及其与猪抗性的关系等,阐述了BPI基因在猪抗病育种中的研究进展及应用前景,为下一步猪BPI基因的功能研究及其在抗病育种实践中的应用提供理论依据。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测猪血清中非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA方法,本研究以ASFVPig/HLJ/2018株基因组为模板优化合成CP204L基因(1 bp～549 bp),构建pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(rP30),以Ni亲和纯化后...     

鸭疫里默氏杆菌Porin蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

旨在建立一种新型可适用于鸭疫里默氏杆菌(RA)病抗体检测的间接ELISA方法。以血清2型RA贵州分离株为研究对象,将其微孔蛋白Proin编码的基因克隆至pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-32a-porin,在E.coli BL21(DE3)中使用IPTG诱导后表达。以纯化后的Porin蛋白作为包被抗原,通过一系列条件的优化建立一种检测RA抗体的间接ELISA方法,对其性能进行综合评价。结果显示,该方法具有较好的敏感性、重复性及特异性,阳性血清经1∶6 400稀释后检测结果仍为阳性,批内变异系数(CV)在1.27%～4.90%之间,批间CV在2.59%～5.43%之间,该方法可特异性地检测出抗RA抗体,与禽流感病毒(AIV)H5亚型、AIV H7亚型、新城疫病毒(NDV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)及E.coli阳性血清均无交叉反应,与商品化ELISA抗体试剂盒检测相比,两者符合率为97.26%。使用建立的ELISA方法对临床采集的801份样品血清开展抗体检测分析(626份为已免疫鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗“血清1型+血清2型”的样品血清,175份为未免...     

禽网状内皮组织增生症病毒env蛋白的表达及其在ELISA方法中的应用

以pb101质粒为模板,PCR扩增禽网状内皮组织增生症病毒(REV)囊膜糖蛋白env基因片段.构建原核表达质粒pGEX-4T-3-env后,转化入宿主菌BL21,IPTG诱导表达env蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析.结果表明,表达的重组蛋白具有良好的反应原性,相对分子质量约66.4 ku.将表达产物纯化后作为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA方法(Ienv-ELISA).经应用表明该方法具有良好的特异性、可重复性和敏感性,与IFA及iREV-ELISA结果相比其准确率均超过90%.该方法为检测REV抗体提供了一种快速、准确、简便的技术手段.     

表达绿色荧光蛋白的重组人偏肺病毒的构建及其中和抗体检测方法的应用

人偏肺病毒(hMPV)是最新发现的与呼吸道疾病有关的病原体.为构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的B型重组hMPV,本研究利用反向遗传学技术,以表达EGFP的hMPV NL/1/99株全长cDNA质粒重组pPS-hMPV-EGFP,及其4种辅助重组质粒pCITE-N、pCITE-P、pCITE-L、pCITE-M2.1为基础,共转染BHK-21细胞进行重组病毒的拯救.鉴定结果表明拯救的重组病毒rhMPV-NL-EGFP高效表达外源基因EGFP.rhMPV-NL-EGFP与亲本病毒株具有相似的生物学特性,生长滴度可达106.7 TCID50/mL.rhMPV-NL-EGFP在细胞中连续传代10代仍然维持外源基因的高效和稳定表达,病毒滴度于室温条件下可维持长时间稳定.分别利用亲本病毒株和重组病毒rhMPV-NL-EGFP进行免疫小鼠血清中和抗体检测,结果显示两种方法具有较好的相似性(p＞0.05).本研究为病毒中和抗体的检测提供了更为快捷的新方法,同时为hMPV感染发病机制及疫苗研究奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因半定量 RT-PCR方法的建立及其在RNA干扰研究中的应用

为了建立以GAPDH基因为参照的半定量RT-PCR检测方法,根据PRRSV VR2332株病毒基因组和GAPDH序列设计4对特异性引物,分别扩增GP5、M、N和GAPDH基因序列,将shRNA表达质粒和GP5、M、N真核表达质粒共转染HEK293A细胞,应用该法检测了转染孔中GP5、M、N的相对表达量。同管和分管扩增法均建立了以GAPDH基因为参照的半定量RT-PCR检测方法。靶向GP5、M和N蛋白基因的shRNA表达质粒对其各自蛋白的抑制率为36%~69%,其中pSi-N3和pSi-G1抑制效果最为显著。结果表明,建立的半定量RT-PCR可以用于PRRSV主要结构蛋白基因表达水平的检测分析中。     

聚乙二醇胁迫下不同苜蓿品种愈伤组织生理指标的变化

以聚乙二醇(PEG)作为渗透胁迫剂,对5个苜蓿Medicago sativa品种愈伤组织进行干旱胁迫.用生理生化方法对各品种愈伤组织的过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸积累量、质膜相对透性3项抗旱性鉴定指标进行测定,各项结果趋于一致,其抗旱性强弱的顺序为:龙牧803、草原2号、中牧1号、龙牧80l、准格尔.同时,证明了POD活性、游离脯氨酸含量和质膜透性均可作为苜蓿抗旱性鉴定的生理指标.     

不同处理条件对苜蓿叶蛋白凝聚效果的研究

以现蕾期新鲜苜蓿Medicago sativa为材料,采用温度、pH值单因素处理及温度、加热时间、pH值和NaCl质量分数多因素处理,探讨不同方法对苜蓿叶蛋白凝聚效果的影响。结果表明,在单因素条件下,温度以75℃为宜,pH值4.0对苜蓿叶蛋白产量、叶蛋白纯度和粗蛋白提取率有显著影响。而在多因素条件下,叶蛋白的最适凝聚组合条件为温度85℃,时间2min,pH值4.0,以及NaCl质量分数0.4%。     

苜蓿叶蛋白的开发利用现状

着重综述了苜蓿Medicago sativa叶蛋白的营养价值、饲用价值、食用价值、医用价值及其存在的问题和发展前景,指出开发苜蓿叶蛋白是目前解决蛋白质饲料供需矛盾的有效途径之一.     

苜蓿干草提取叶蛋白最佳工艺的研究

采用酸化加热加盐的综合方法提取苜蓿干草中的叶蛋白。分别进行了草粉预浸时间、絮凝时间、絮凝温度、料水比、加盐量和提取液pH值等6个因素对叶蛋白粗蛋白质提取率影响的单因素试验研究,得到各单因素最佳工艺参数分别为:预浸时间24h,絮凝时间10min,料水比1∶30,絮凝温度60℃,pH值3,加盐量2%。对料水比、加盐量、絮凝时间和pH值的4因素3水平正交试验结果表明,影响粗蛋白质提取率的因素依次为料水比>加盐量>pH值>絮凝时间,最佳工艺条件组合为料水比1∶20,加盐量1%,絮凝时间5min和pH值为2.5。     

苜蓿绿、白叶蛋白提取分离及残渣残液营养成分分析

目前苜蓿Medicago sativa叶蛋白提纯为食用叶蛋白需要经过二次加工,进行脱色、去腥工艺,且苜蓿叶蛋白的脱色、去腥技术尚处于研究阶段,工艺还不成熟。为此,将苜蓿叶蛋白在提取阶段直接分离出不同用途的绿白叶蛋白,既饲用叶蛋白和食用叶蛋白,打破了国内苜蓿叶蛋白产品只有混合型粗叶蛋白的单一局面,使叶蛋白的蛋白质含量由45%63%提高到72%,极大地提升了苜蓿深加工产业中的高端产品--叶蛋白的产品档次和利用价值,免去食用叶蛋白中脱色环节,降低成本;同时对残渣、残液中的营养物质进行测定分析,并应用于膳食纤维、饲用等方面。     

碱性蛋白酶水解苜蓿叶蛋白制备寡肽最佳条件的研究

利用碱性蛋白酶水解苜蓿叶蛋白制备寡肽,以水解度表征其反应程度,确定了苜蓿叶蛋白的最佳水解条件:温度50℃,pH值9.0,底物浓度3%,酶活添加量4000U/g(净蛋白),水解时间2.0h。在此条件下,水解液的酸溶性肽得率和水解度分别为51.26%和27.50%,寡肽的平均肽链长度为3.64。     

苜蓿质量预测方法研究进展

苜蓿(Medicago sativa)质量是影响苜蓿干草价格的重要因素,而适时收获是把握苜蓿干草质量的重要环节。在科学种植管理条件下,对田间苜蓿质量提前判断,对准确收获目标质量苜蓿干草、保证经济效益意义重大。苜蓿产业较为发达的美国常用GDD和PEAQ法来预测田间苜蓿质量,以判断春季苜蓿的收获时间。当GDD为700～750时(5℃以上积温),苜蓿的NDF含量接近40%,当GDD增加220(7d后),NDF含量达到45%;PEAQ法中指出,NDF和ADF含量可以通过在具有随机样方中茎秆最高植株的茎长测量和判断样方中最成熟植株的成熟度来预测。GDD和PEAQ法对杂草较少、长势健康的苜蓿田生产质量预测比较准确。     

西北旱区灌溉方式对苜蓿产量及品质的影响

为探究灌溉方式对紫花苜蓿(Medicago sativa)产量及品质的影响,进行苜蓿地下滴灌(SDI)、畦灌(BI)、喷灌(SI)和对照(CK)4种处理的大田试验。结果表明,与其他3种处理相比,SDI的土壤含水量最高,CK最低。SDI的产量及水分利用效率均显著高于其他3个处理(P＜0.05),其中SDI两茬的产量分别为4 815.87、4 300.41 kg·hm-2,相比BI、SI、CK,SDI两茬分别提高了10.56%、14.92%、95.26%和13.64%、23.60%、120.85%。SDI两茬的水分利用效率分别为2.66和2.50 kg·m-3,较BI和SI,两茬分别提高了17.70%、21.46%和20.77%、34.41%。CK的品质显著高于其他3个灌水处理(P＜0.05),3个灌水处理间品质差异不明显,SDI苜蓿两茬的粗蛋白产量分别为816.13和814.07 kg·hm-2,相比BI、SI、CK,SDI两茬分别提高了2.38%、5.84%、61.90%和10.90%、18.83%、100.01%。本研究揭示,相比BI和SI,SDI促进苜蓿生长,且显著提高了苜蓿粗蛋白产量、干草产量及水分利用效率。因此,SDI适合在西北干旱地区苜蓿种植中应用和推广。     

陇东野生紫花苜蓿硬实种子处理方法研究

以陇东野生紫花苜蓿种子为材料,采用机械法、98%浓硫酸处理法和不同浓度NAA引发处理法研究打破陇东野生紫花苜蓿种子硬实的效果.结果表明:用标准发芽法测定的发芽率仅为37%,各处理对破除种子硬实、提高发芽率的效果差异显著(P＜0.05),其中划破种皮处理效果最佳,发芽率达到92%,其次是98%浓硫酸浸种30 min,发芽...     

苜蓿青贮品质评定指标体系及测定方法的概述

苜蓿(Medicago sative)青贮技术成为当前苜蓿草研究的热点,而苜蓿青贮评定指标体系及其测定方法的完善和规范直接影响苜蓿青贮品质,因此适应苜蓿青贮评定的标准急需建立。目前苜蓿品质评定基本是参照青贮饲料的通用标准,由于苜蓿豆科牧草自身的特性和青贮方法的特殊性,传统的评定基准如有机酸、铵态氮、pH值等并不完全适应苜蓿青贮;同样随着青贮技术的发展,有关指标的测定新方法也不断出现,传统的测定方法亟待改进。通过对不同的评定标准和测定方法的分析,V-Score和Kaiser法较适合苜蓿青贮,但评定指标较少,可以将pH值、铵态氮、乳酸等指标加入,进一步细化评定范围;铵态氮可以用比色法测定,有机酸的测定采用离子色谱法和高效液相色谱法测定更准确。