中国牛种布鲁菌弱毒疫苗株A19 SNP位点的研究

为鉴别我国牛种布鲁菌弱毒疫苗株A19与野生菌株,运用生物信息学方法结合基因测序,对疫苗株A19基因组SNP位点分析筛选,选取其中部分SNP位点,通过与布鲁菌常见种、生物型标准参考菌株和弱毒疫苗株基因组SNP位置核苷酸测序比较,验证SNP位点的A19特异性。结果表明,共筛选获得A19基因组29个SNP位点,验证ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503这3个SNP位点为A19（或S19）特异,揭示了A19基因组SNP位点分布情况,为疫苗株 A19与野生菌株鉴别提供了分子依据。     

马鹿特异性SNP分子标记的验证

试验旨在对基于基因分型测序（genotyping by sequencing,GBS）技术筛选出的马鹿特异性SNPs位点的准确性进行验证,为梅花鹿、马鹿及其杂交后代的鉴别提供可靠的分子遗传标记。随机选取30个马鹿特异性SNPs位点,根据SNPs位点前后各200 bp的序列,利用Primer Premier 6.0软件设计特异性引物,以随机选取的验证样本DNA作为模板进行PCR扩增,并进行Sanger测序,对测序结果利用BioEdit软件进行峰图的观察,利用Mega 6.0软件对测序得到的序列进行比对分析并观察每个特异性SNP位点在不同验证群体中的基因型,对每一个马鹿特异性位点的峰图和比对信息进行统计分析。结果表明,30个马鹿特异性位点中有28个和前期研究结果一致,其中1个SNP位点（SNP3）中G等位基因在梅花鹿中的基因频率为0.05,而G等位基因在马鹿中的基因频率为1,G等位基因在马鹿个体中的基因频率比在梅花鹿个体中高,同时,利用SPSS 22.0进行统计分析发现,该位点在马鹿和梅花鹿中基因型分布表现出显著性差异（P<0.05）;另外1个SNP位点（SNP5）中T等位基因在梅花鹿的基因频率为0.15,而在马鹿中的基因频率为1,且这个SNP位点在梅花鹿和马鹿中基因型分布差异显著（P<0.05）,所以这2个位点仍然可以作为马鹿的特异性SNPs位点。研究结果说明了GBS测序筛选出的马鹿特异性SNPs可以作为鉴定的分子标记,对梅花鹿、马鹿及其杂交后代的鉴别奠定了理论基础。     

兴义鸭肌肉生长抑制素基因多态性与屠宰性状的相关性分析

为了解兴义鸭肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因SNPs与屠宰性状的相关性,本研究采用基因克隆及PCR产物直接测序的方法,将MSTN基因作为鸭屠宰性状的候选基因,对兴义鸭的MSTN基因外显子进行多态性检测.结果表明,在60个兴义鸭个体中筛选出8个SNPs,其中,第1外显子有5个突变位点:SNP1(G77A)、SNP2(A91G)、SNP3(G130A)、SNP4(C325T)和SNP5(C331T);在第2外显子中并未发现突变位点;第3外显子有3个突变位点:SNP6(C206T)、SNP7(A235G)和SNP8(C256A);对这8个SNPs与屠宰性状进行关联性分析,结果并未达到显著水平(P>0.05).本研究结果可丰富MSTN基因的研究数据,为鸭的育种提供参考.     

早胜牛钙蛋白酶Ⅰ基因(CAPN1)多态性分析

试验旨在研究CAPN1基因在早胜牛群体中的遗传变异,为进一步寻找与早胜牛肉质性状相关的分子标记奠定基础。采用DNA混合池测序法对早胜牛320个样本CAPN1基因所有外显子的SNPs位点进行筛选,同时进行序列分析,并利用测序图中SNP位点等位基因峰高的比值估算各等位基因的频率。结果表明:在早胜牛CAPN1基因外显子区共筛选到7个多态性位点G3717A、A3854G、C5709G、C6004T、G11058A、G15299A和G15682A,其中G3717A和G15299A为同义突变,其余5个SNPs位点为错义突变。该研究结果将为进一步研究早胜牛肉质性状相关候选基因提供理论依据。     

贵州地方山羊GnRHR基因多态性研究

为了分析山羊GnRHR基因外显子区序列的多态性,筛选出对山羊繁殖性状有显著影响的单核苷酸多态性(SNP)位点,试验以贵州白山羊、黔北麻羊和贵州黑山羊3个地方品种为研究对象,采用DNA池结合PCR直接测序法对GnRHR基因进行SNP检测,同时结合在线软件预测不同基因型mRNA的二级结构。结果表明:在3个山羊品种中共检测到2个SNP位点,即G121A、G15A,其中G121A位于外显子1中且为同义突变,G15A位于内含子中。对外显子1 G121A SNP位点进行生物信息学分析显示,其导致mRNA二级结构发生改变。     

牛布鲁氏菌病活疫苗(A19-△VirB12株)

<正>由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心和新疆畜牧科学院兽医研究所联合研制的牛布氏菌病活疫苗(A19-△VirB12株)以我国布氏菌病活疫苗(A19株)为亲本株,应用基因同源重组方法,构建含有缺失布鲁氏菌四型分泌系统中VirB12基因的自杀质粒,将该自杀质粒电击转化至A19疫苗株中,筛选发生同源重组而缺失VirB12基因的布鲁氏菌A19-△VirB12。该疫苗     

建昌马和安宁果下马3个候选矮基因的SNP检测

为了检测马的3个候选矮基因的单核苷酸多态性(SNP),试验从建昌马(n=16)和安宁果下马(n=4)血液中提取基因组DNA,PCR扩增3个候选矮基因的特定SNP位点并直接测序,对测序结果进行分析。结果表明:在高迁移率族蛋白A2(HMGA2)基因c.83位点仅检测到G等位基因;锌指蛋白(ZFAT)基因BIEC2-1105377位点的G等位基因占绝对优势;配体依赖核受体共抑制物(LCORL)基因BIEC2-808543位点的T等位基因占优势;ZFAT基因和LCORL基因SNP位点的优势等位基因频率均在0.8以上,并与已报道的控制马矮小性状的等位基因相同。说明建昌马和安宁果下马ZFAT基因和LCORL基因的SNP位点均存在明显的优势等位基因,而HMGA2基因可能与建昌马和安宁果下马矮小性状无关。     

太行鸡VIPR-1基因内含子1多态性及其与早期产蛋性状相关性研究

为了探索鸡血管活性肠肽受体-1(VIPR-1)基因内含子1多态性与太行鸡早期产蛋性能的相关性,及应用这些多态标记对保种群保种效果进行初步评价,试验参考鸡VIPR-1基因内含子1序列设计引物,以260只产蛋记录完整的太行鸡基因组DNA为模板进行PCR扩增,对符合测序要求的PCR扩增产物进行测序,通过分析测序结果寻找多态位点,对多态位点的遗传参数进行分析,进而评价保种效果,同时对不同基因型和单倍体型组合与开产日龄、各周龄产蛋量进行关联分析。结果表明:260份太行鸡血液样品经PCR扩增均获得了大小为651 bp的条带,该条带明亮、特异性良好,能够满足DNA测序需要;在VIPR-1基因内含子1中发现了8个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphic,SNP)位点,分别为SNP1(T37748G)、SNP2(G37813A)、SNP3(G37823A)、SNP4(A37962/-)、SNP5(A37973G)、 SNP6(G38013A)、SNP7(C38035G)和SNP8(A38111G);这8个位点均属于中度多态,且均处于Hardy-Weinberg平衡状态,即试验鸡群体未经选择,保种效果良好;SNP4(A37962/-)的各基因型个体间早期产蛋性能存在差异,A0基因型与00基因型在37周产蛋数上显著或极显著高于AA基因型;单倍体型组合为H1H2(TGGAAGCA/GAA-GAGG)的个体早期产蛋数显著高于其他单倍体型组合。说明试验发现了一个与太行鸡早期产蛋显著相关的SNP位点(SNP4)和一个优势单倍体型组合(TGGAAGCA/GAA-GAGG),可作为太行鸡早期产蛋性状的分子标记,用于太行鸡早期产蛋性能的分子标记辅助选择以及保种群保种效果的评价。     

我国已上市动物布鲁氏菌病活疫苗的概况及新型疫苗研究方向

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌引起的重要人畜共患传染病,严重危害公共卫生安全。疫苗免疫是预防布病的重要措施之一。目前我国已经获批上市的布鲁氏菌病疫苗共有七种,分别是S2株、M5/M5-90株、M5-90Δ26株、Rev.1株、A19株、A19ΔVirB12株和BA0711株。对上述疫苗的背景、免疫程序、基因组及保护力等方面进行系统阐述,旨在为动物布鲁氏菌活疫苗选用提供指导,并针对现有疫苗的优缺点,展望未来研发安全、高效、可鉴别诊断、不感染人的新型疫苗方向。     

副猪嗜血杆菌高自然转化效率菌株的筛选及全基因组测序

旨在筛选具有高自然转化效率的副猪嗜血杆菌(HPS)菌株,为自然转化机制及基因功能研究提供生物材料;对所得菌株进行全基因组测序,通过比较基因组分析,挖掘HPS自然转化发生的分子背景。本研究采用自然转化方法对75株HPS田间分离株及15株标准株进行自然感受态菌株的筛选,并测定各自然感受态菌株的转化效率。采用PacBio三代测序技术对具有高自然转化效率的HPS菌株SC1401进行全基因组测序,对测序数据进行组装、基因预测、功能注释及共线性分析。将SC1401株测序结果与NCBI发布的SH0165(CP001321)、SH03(CP009158)、KL0318(CP009237)和ZJ0906(CP005384)进行全基因组比对。结果如下:1)共筛选出11株HPS自然感受态菌株,均为野生型,其中SC1401菌株自然转化效率最高;2)全基因组测序结果显示SC1401菌株整个基因组大小为2 277 540bp,GC含量为40.03%,共编码2 220个基因,占整个基因组序列的87.75%(序列已上传至GenBank数据库,登录号为CP015099);3)基因组共线性分析表明SC1401与其他四株全基因组测序菌株的共线性良好;4)比较基因组分析表明,SC1401菌株含特有基因385个,远多于其他4株菌株所含有的特有基因;5株HPS含有一系列相同的与自然转化相关的基因,且除tfox基因外,各基因氨基酸序列一致性均达90%以上。本研究首次报道了一株强自然转化能力的副猪嗜血杆菌SC1401的全基因组序列,并分析了其基因组基本特征,为后续HPS自然转化机制的研究提供一定理论基础。     

2株温和气单胞菌SNP位点比较分析

通过Illumina HiSeq 2500测序仪对2株温和气单胞菌A1、B2进行全基因组重测序,并与参考基因组(Aeromonas veronii B565,complete genome)序列进行比较,A1、B2与参考基因组之间共获得约100 018个SNP位点,与参考基因组平均比对率为74.46%。根据编码区SNPs分布与参考基因组间进行检测;通过COG和GO的功能注释,寻找A1、B2Diff基因的SNPs位点对2株温和气单胞菌进行注释分析,了解温和气单胞菌致病机制与基因组成,为今后温和气单胞菌的研究提供科学数据。     

中国山羊痘弱毒疫苗AV41株基因组分子标记的比较分析

为鉴别我国山羊痘病毒(GTPV)弱毒疫苗AV41株与牛结节性皮肤病病毒(LSDV)野毒株,运用生物信息学方法将AV41株基因组全序列与GenBank中已发表的LSDV、GTPV和绵羊痘病毒(SPPV)基因组进行比较,筛选AV41株基因组分子标记.采用我国不同厂家来源的AV41株疫苗测序验证分子标记相关序列,并与我国LS...     

1株西藏牦牛巴氏杆菌全基因组测序与比较基因组学分析

为进一步对西藏牦牛巴氏杆菌病基因组学研究提供理论基础,从西藏林芝某地病死牦牛肺脏中分离鉴定出1株荚膜A型牦牛巴氏杆菌,并通过SMRT法对该菌株进行全基因组序列测定,对测序数据组装后基因组组分及比较基因组学进行分析。结果显示,获得大小为2.3 Mb基因组,GC含量40.30%。同时预测2 096个编码基因数量,编码基因序列总长度2 047 410 bp。预测出总长度为4 739 bp的重复序列,重复序列含量0.21%。预测非编码rRNA数量为19、tRNA数量为59。假基因数量为3,假基因总长度为736 bp。此外,对测序的1株菌株和2株参考菌株(Mannheimia haeemolytica、Pasteurella multocica)进行基因组共线性分析,显示测序菌株与参考菌株之间共线性良好。对测序的1株菌株和2株参考菌株进行家族分类,共得到2 105个基因族,其中,3株菌共有的基因族类(核心基因族)有1 483个,占总基因组的70.45%。进化分析研究显示,测序菌株与参考菌株Mannheimia haeemolytica较远。表明本研究对西藏牦牛巴氏杆菌分离菌株进行全基因测序,同时进行基因组组分及比较基因组学分析,为牦牛巴氏杆菌病的进一步研究提供数据支持。     

中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2遗传多态性与布鲁氏菌病易感性的关联分析

本试验采用PCR-SSCP方法对148只布鲁氏菌阴性和60只布鲁氏菌阳性中国美利奴羊白细胞表面抗原DQB1(OLA-DQB1)基因exon 2单核苷酸多态性(SNPs)进行了检测,之后挑选不同等位基因进行PCR产物测序,旨在确定该基因的多态性位点,并对每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率进行统计分析,从而分析其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性.测序结果表明,在270 bp的序列内共检测到43个SNPs,其中G196A位点的等位基因频率在病例组和对照组中的分布存在极显著差异(P< 0.01),其基因型频率存在显著差异(P< 0.05);C211T位点的等位基因频率在病例组和对照组中存在显著差异(P< 0.05).由此表明,OLA-DQB1基因exon 2多态性与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性呈显著相关.     

他留乌骨鸡SLC24A5基因Nhe I mismatch PCR-RFLP标记与羽色及肤色相关性研究

采用PCR测序与PCR-RFLP技术,研究了SLC24A5基因变异与他留乌骨鸡羽色及肤色的关系。通过对他留乌骨鸡麻羽、白羽和黑羽3个品系以及乌骨与非乌骨2个类型的SLC24A5基因个体测序,共检测到19个SNP位点,其中3个位点引起氨基酸变异。采用每个品系或类型PCR扩增池测序技术,确定了每个SNP位点在不同品系或类型的基因频率,在分析基因频率差异及SNP变异特性的基础上,针对G482C位点,建立了Nhe I mismatch PCR-RFLP分子标记。利用该遗传标记对所有受试个体进行基因分型,并分析其与羽色肤色性状的相关性。结果表明,SLC24A5基因Nhe I mismatch PCR-RFLP分子标记与肤色性状显著相关。     

布鲁氏菌强毒株与弱毒株基因组DNA差异基因筛选与鉴定

本研究应用代表性差异分析技术(RDA)对流产布鲁氏菌强毒株544 A和弱毒株104 M进行基因组差减分析.经过3轮差减杂交,获得强毒株特有的9条差异片段和弱毒株特异的17条差异片段.经BLAST分析和PCR鉴定,最终证实3条差异片段,与流产布鲁氏菌经典弱毒株S19同源性在98%～99%之间,只在弱毒株104 M基因组中检测出.而在强毒株544 A中不存在.该实验为建立布鲁氏菌自然感染菌与疫苗株的基因鉴别诊断方法奠定了基础.     

新广黄鸡MCEE基因多态性分析

为探讨MCEE基因多态性及其作为新广黄鸡生长性状遗传标记的可能性,对新广黄鸡进行MCEE基因多态性检测分析。采用Sanger测序法对MCEE基因的CDS和3′UTR区进行单核苷酸多态性(Singer nucleotide polymorphism,SNP)检测,并分析其对新广黄鸡生长性状的影响。结果表明:新广黄鸡MCEE基因的CDS区检测到3个SNP位点,分别为gC4715T、gT4734C和g C4925T。其中:g T4734C为错义突变,导致pSer 34Pro改变;3′UTR区检测到4个SNP突变位点,分别为g G8959A、g A8979G、g G9001C和g C9082T。MCEE基因CDS区3个SNP位点均表现为野生型基因型频率所占比重较高,属于低度多态,遗传变异较小;3′UTR区的4个SNP位点中,g A8979G位点表现为杂合型基因型频率所占比重较高,其余3个位点均表现为野生型基因型频率所占比重较高。MCEE基因3′UTR区的g G8959A、g A8979G和g C9082T三个SNP位点均属于中度多态,遗传差异较大。MCEE基因3′UTR区的g A8979G突变位点显著影响28日龄新广黄鸡体重(P0.05)。MCEE基因其它突变位点与体重无显著性相关。本研究初步揭示了鸡MCEE基因多态性及其与新广黄鸡体重之间的相关性,其对鸡生长性状的遗传效应有待进一步扩大样本量和品种进行验证并深入研究其对MCEE基因表达的影响。     

布鲁氏菌A19株菌影疫苗的构建及其免疫效果评价

为开发一种安全有效的布鲁氏菌疫苗,解决现有A19、S2和M5等弱毒疫苗存在较强毒力可感染人,且无法通过血清学方法将其免疫抗体与野毒感染抗体进行鉴别区分的问题,本试验将含有噬菌体PhiX174裂解酶基因E的质粒转化至A19疫苗株,构建菌影疫苗(A19-BG)菌株,并检验其遗传稳定性及对小鼠的安全性、免疫效果和保护效果。结果显示,构建成功的A19-BG菌株传代20代仍稳定,热诱导48 h后可完全灭活,菌体穿孔明显。A19-BG疫苗免疫小鼠7 d后免疫部位无不良反应,14 d后脾脏无可见病理变化,与空白对照组相比脾脏重量无显著差异(P>0.05)。一免和二免后14 d,免疫小鼠的布鲁氏菌抗体、白细胞介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平持续升高,产生了良好的体液和细胞免疫反应。布鲁氏菌2308强毒株攻毒免疫小鼠,免疫保护率可达87.5%,保护效果良好。结果表明,构建的A19-BG疫苗具有良好的稳定性、安全性、免疫效果和保护效果,有望成为一种极具潜力的布鲁氏菌新型疫苗。     

羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失株的构建及鉴定

为获得毒力较弱且能够区分疫苗免疫与自然感染的羊种布鲁氏菌候选疫苗株,本研究构建羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失突变株。分别扩增Rev.1疫苗株VirB12基因上下游同源臂序列以及卡那霉素抗性基因,采用融合PCR方法将3个基因片段连接构建突变盒,连接至pMD19-T载体,电转化入布鲁氏菌Rev.1感受态细胞筛选阳性克隆,获得Rev.1-ΔVirB12突变株。Rev.1-ΔVirB12连续传代15代未发生回复突变。羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1-ΔVirB12的构建为羊种布鲁氏菌疫苗研制奠定了基础。     

哈萨克羊DQB2基因外显子2多态性及遗传变异分析

试验旨在研究DQB2基因外显子2多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。通过PCR-SSCP技术对146只布鲁氏菌阴性哈萨克羊血液样本和28只布鲁氏菌阳性哈萨克羊血液样本中的白细胞表面抗原DQB2基因外显子2的多态性进行研究,挑取不同的等位基因进行克隆测序,经卡方检验分析每个SNP位点的基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,应用生物信息学软件分析与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性相关的不同等位基因的mRNA二级结构及蛋白质的二级结构、三级结构和抗原表位。结果发现,在270 bp的外显子2序列中共检测到33个SNPs,其中C9G、A180G位点的基因频率在病例组和对照组中的分布具有极显著性差异（P<0.01）,其基因型频率在病例组和对照组中存在显著差异（P<0.05）;A13T、C133G位点的基因频率在病例组和对照组中存在显著差异（P<0.05）;进一步分析发现,A180G突变位点的最小自由能最低,其mRNA二级结构最稳定;A13T和C133G 2个突变位点均引起mRNA二级结构及蛋白质二级结构、三级结构和抗原表位的改变。本试验结果表明DQB2基因外显子2多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性呈显著相关。