猪calsarcin-2基因cDNA的克隆与测序

Z线是多种蛋白质通过蛋白-蛋白的相互作用，构成具有特定结构的蛋白复合体。在肌细胞发育与分化过程中，Z线的结构是不断发生变化的，并且Z线能够调节骨骼肌与心肌细胞的收缩。目前，利用蛋白质一蛋白质相互作用技术已将一些蛋白定位于Z线，根据它们在Z线的位置可分为两类：一类是蛋白的某一部分肽段位于Z线，     

2株猪圆环病毒ORF2基因的克隆测序

对分离到的2株猪圆环病毒PCV-2型的ORF2基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了2个毒株的ORF2基因阳性克隆。序列分析表明,这2个分离株与其他中国分离株同源性高达99%以上,同处于一个基因簇,但和中国BF分离株同源性却只有92.3%。而荷兰分离的NL-PMWS-2株与中国分离株的同源性却在99%以上,表明中国流行的PCV-2和国外分离株有密切关系。     

鸡SGOL2基因的克隆测序和表达分析

本研究通过对前期研究得到的候选鸟类卵巢特异表达基因LOC100857982进行克隆测序和表达分析,检验该基因是否在成年母鸡卵巢高度特异表达并对其功能进行初步分析,为进一步揭示卵巢的生长发育和成熟机制奠定理论基础。本研究采用RACE方法克隆出LOC100857982的cDNA全长,并进一步分析了该基因的序列,利用qRT-PCR方法对该基因进行表达分析。结果表明:LOC100857982的cDNA全长为1 306 bp;比对序列分析发现该基因是鸡SGOL2基因;系统进化树分析表明该基因与非洲爪蛙的遗传距离最近,符合基本的进化规律。qPCR结果显示该基因在25周龄白来航母鸡的卵巢中过表达。本研究表明鸡SGOL2基因是卵巢组织的特异表达基因。结合序列分析和表达分析,本研究推测该基因对母鸡的开产具有重要的作用。本研究还表明了实际克隆测序全长cDNA对基因功能研究的重要性,即使在高质量的鸡基因组中,Ensembl预测基因仍然有很多缺陷,从而导致以此为基础的一些生物学推断发生错误。     

我国部分省份猪流行性腹泻病毒M基因的克隆测序及遗传进化分析

为了解我国部分省份猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传进化情况,试验采用RT-PCR方法对2014—2017年采集的源自河南、河北、山西、山东、甘肃、湖北、江西等地区不同猪场的98份腹泻样品进行了PEDV检测,并对25份PEDV阳性样品进行M基因的克隆与测序和遗传进化分析。结果表明:25株M基因序列长度均为618 bp;25株M基因序列间核苷酸同源性为98.2%~100%,其编码的氨基酸序列同源性为97.8%~99.6%,与经典毒株CV777及国内外流行毒株核苷酸同源性为97.7%~98.6%,氨基酸序列的同源性分别为97.8%~98.7%;25株M基因序列与国内外早期分离株(如CV777、CH/S等代表毒株)不在一个进化分支上,与近年来分离株处在一个进化分支上。说明PEDV M基因一直处于变异进化过程中。     

猪TYR基因外显子1的克隆测序及序列分析

本研究对荣昌猪和内江猪的TYR基因外显子1进行了克隆测序及序列分析，结果发现3个新的突变位点：319C→T，537C的插入，551A→G。部分突变序列已被GenBank收录，登录号为：AY236997。将突变序列翻译成氨基酸序列后发现，319C→T和551A→G是同义交变。537C的插入是移码突变，其是否会对猪的毛色造成影响，还有待进一步研究。     

猪干扰素β基因的分子克隆与测序

采用ＰＣＲ技术扩增和克降了猪β干扰素（ＩＦＮ－β）基因。克隆片段长６６８个核苷酸,编码１８６个氨基酸;其中,７６－６３６位含有１个ＯＲＦ,蛋白分子２１．８ＫＤａ。     

山东地区水貂肠炎病毒VP_2基因的克隆和测序分析

本研究对潍坊、烟台、威海和青岛地区的疑似水貂病毒性肠炎病毒(MEV)粪便样品进行检测,并在9份样品QD1309、QD1407、WH1407、WH1408、WH1508、WH1509、WF1310、WF1408、YT1408中扩增出VP2基因,和Gen Bank上已经公布的4株MEV参考株的VP_2基因进行序列分析,结果显示,13份MEV VP2基因的核苷酸和氨基酸均有较高的同源性,分别为97.5%~99.8%和96.9%~99.7%。系统发育进化树表明,QD1309、YT1408、MEV-Beregovoj-Bincentr(MEV-BB)、MEV-e属于同一个组群,不同毒株主要在第5、62、87、101、232、236、279、300、534位氨基酸发生了替换。本研究对水貂细小病毒流行株的主要衣壳蛋白VP_2的编码蛋白进行遗传变异分析,为更好地预防和控制貂源细小病毒提供基础。     

基于低深度全基因组测序分析内江猪群体结构和遗传多样性

旨在更好的了解内江猪群体结构和遗传多样性,更好的保护和利用内江猪遗传资源。本研究基于低深度全基因组测序,检测了133头(12头公猪,121头母猪)内江猪的SNP,按照SNP检出率大于90%和95%获得两组SNP数据,分别编号为NJ90和NJ95。针对两组数据,通过群体分层、遗传距离、亲缘关系、家系划分等方法分析了内江猪群体结构,通过等位基因频率、有效等位基因数、多态性标记比、杂合度等指标估计了群体遗传多样性,最后利用不同方法评估了群体近交系数。结果显示：1)NJ90共包含135 760个SNPs位点,其等位基因频率为0.87,有效等位基因数为1.27,多态性标记比为0.76,观测杂合度为0.15,期望杂合度为0.21;NJ95包含32 266个SNPs位点,其等位基因频率为0.79,有效等位基因数为1.44,多态性标记比为0.74,观测杂合度为0.30,期望杂合度为0.31。2)NJ90结果显示群体平均遗传距离为0.20,平均亲缘系数为0.9%;NJ95结果显示群体平均遗传距离为0.25,平均亲缘系数为0.7%。3)根据NJ90公猪和群体聚类以及亲缘关系,可将群体分为6个家系。4)根据...     

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。     

华南虎和东北虎β-干扰素基因的克隆与遗传进化分析

采集新鲜东北虎与华南虎的血液,提取基因组DNA,采用PCR技术扩增β-干扰素(IFN-β)基因,克隆到p MD19-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,进行菌液PCR鉴定,筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实,所克隆到的老虎IFN-β基因全长561 bp,编码187个氨基酸,核苷酸序列同源性为99.3%~99.5%。同时将核苷酸序列与其他几种哺乳动物进行遗传进化分析,其同源性在60.8%~98.4%。东北虎和华南虎及其他8种动物的IFN-β基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-β基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高;老虎IFN-β基因的成功克隆,为进一步研究猫科动物IFN-β基因表达、生物学活性和应用奠定基础。     

猪Toll样受体2基因的克隆和序列分析

本研究从猪肠系膜淋巴细胞中，克隆了猪Toll样受体2基因（pTLR2）。基因序列分析表明，克隆的pTLR2基因ORF为2358bp，编码785个氨基酸，合15．01％的亮氨酸，合有一段21个氨基酸的信号肽序列；与GenBank中登录的pTLR2序列（NM213761）的同源性为99．2％；与牛、马、绵羊和人的同源性较高，与家鼠、中国仓鼠相比次之．而与鱼类的最低。蛋白分子结构预测表明，该分子由胞外区（588个氨基酸）、跨膜区（23个氨基酸）和胞内区（174个氨基酸）组成，其胞外结构域由多个串联重复的LRR基序（XLXXLXLXX）组成，而胞内区合有与人白细胞介素1受体（IL-1R）高度同源的区域即TOLL／IL-1受体同源区（TIR），说明pTLR2分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用，这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。     

水貂 β-干扰素基因的克隆、测序与遗传进化分析

根据Genβank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂β干扰素（IFN—β）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT—PCR扩增水貂β干扰素基因,获得了约561bp片段,将其克隆到pEasy—T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂β干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的雪貂（EF581890．1）的IFN—β基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为100．0％,氨基酸同源性为100．0％。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在83．0％～100．0％之间和69．4％～100．0％之间。     

水貂α-干扰素基因的克隆、测序与遗传进化分析

根据GenBank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂α干扰素（IFN-α）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT-PCR扩增水貂α干扰素基因,获得了约564bp片段,将其克隆到pEasy-T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂α干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的水貂的IFN-α基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为94.3%～95.5%,氨基酸序列同源性为89.3%～91.4%。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在78.1%～99.3%之间和69.4%～100.0%之间。     

基于ND2基因的崖沙燕遗传多样性和遗传结构初探

利用线粒体DNA中的NADH脱氢酶第二亚基(ND2)对来自齐齐哈尔市50个崖沙燕(Riparia riparia)样本进行扩增和测序,发现了11条新的单倍型序列。结合从GenB ank中下载的104条序列,对崖沙燕3个亚种种群(154只个体)进行序列变异及系统发育分析。结果显示,3个亚种种群中有2个共享单倍型。群体总的单倍型多样性(Hd)为(0. 885±0. 019),群体总的核苷酸多样性(Pi)为(0. 002 92±0. 000 18)。与其近缘物种淡色崖沙燕(Riparia diluta)相比较,崖沙燕种群表现出较低水平的遗传多样性。分子方差分析(AMOVA)显示变异主要来自种群内(72. 82%)。构建的单倍型系统发育树表明,62个单倍型没有形成明显的亚种分化和地理分化。     

东北民猪Myostatin基因5’调控区的克隆和RFLP分析

东北民猪是我国的地方猪种，具有肉质鲜美、产仔数多的优点，但瘦肉率相对较低，不符合现代人的消费习惯。骨骼肌生长抑制素基因（myostatin，又名GDF8）最先由McPherron A C等通过简并引物PCR法发现，属于TGF-β超家族，仅在骨骼肌中特异表达。通过基因敲除法培育的突变纯合体小鼠骨骼肌重量比野生型小鼠重2-3倍，证明myostatln是骨骼肌生长的负调控元。1998年，SomtegardTS等将猪的myostatin定位于15号染色体长臂的15 q 2．3。该文以东北民猪为研究对象，克隆了myostatin基因的5’调控区，测定了其核苷酸序列，并根据StrailA等发现的突变位点对该区域进行了酶切多态性分析，为进一步研究猪myostatin基因的结构与功能奠定基础。     

猪PNRC2基因的电子克隆和验证

为了研究猪PNRC2基因的电子克隆,试验通过抑制差减杂交获得了猪PNRC2基因的EST序列,利用生物信息学方法进行电子克隆,并设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪PNRC2基因cDNA序列,将其连接到pMD-19T载体上并转化DH5α后测序,得到猪PNRC2基因序列(GenBank登录号为GQ913658)。结果表明:PNRC2基因cDNA大小为750 bp,最大开放式阅读框(ORF)位于68～487位,编码139个氨基酸,其中脯氨酸占8.6%;猪PNRC2基因的氨基酸序列与牛、人、小鼠和大鼠的相似性分别为97%、94%、82%、82%,其中重要的SH3结合域和NR盒状序列与四者完全一致,其蛋白质预测分子式为C687H1081N207O207S4,属于不稳定蛋白。     

野桑蚕肌球蛋白轻链2基因(MLC2)的克隆和序列分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了野桑蚕间接飞行肌(in-direct flight muscle,IFM)的肌球蛋白轻链2(myosin light chain2,MLC2)基因(GenBank登录号:EU332913),其cDNA序列全长979 bp,包括63 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)、603 bp的开放读码框(ORF)、终止密码子TAA和310bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR)。克隆该基因的内含子序列并分析基因结构表明,该基因包括3个外显子和2个内含子,编码201个氨基酸,预测蛋白质分子质量约22.0 kD,等电点4.67。用在线软件SMART分析显示,野桑蚕MLC2蛋白有2个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+,属于肌钙蛋白C超家族成员,并且含有保守的可以磷酸化的氨基酸残基,有可能具有磷酸化过程,参与肌动球蛋白ATPase活性的调节。     

猪GPS2基因的克隆及表达分析

G蛋白途径抑制因子2(G-protein pathway suppressor,GPS2)是近年来新发现的肿瘤抑制因子,是一种多功能蛋白质,参与了多个细胞的进程,能够抑制酵母中由于G-蛋白信号通路持续激活引起的死亡。目前,GPS2基因的研究领域主要分布在人、小鼠等。在人的领域,有最新研究表明GPS2基因调控细胞核中的基因表达。这项研究发现GPS2在细胞膜水平上负调控肿瘤坏死因子-α激活(TNF-α)的信号级联反应中起着至关重要的作用。他们发现增加GPS2的水平会损害细胞对TNF-α的反应,降低炎症反应。鉴于此信息,研究人员分析假如脂肪组织中有更多GPS2的话,是否有助于降低肥胖患者胰岛素抵抗的发展。结果发现,脂肪组织中的胰岛素信号被大大改善。然而在核中过表达的GPS2对肝功能也有负面影响。另外其研究表明GPS2在减轻炎症反应中起着重要的调节功能。这些研究结果揭示了一个针对2型糖尿病和代谢综合征等疾病治疗的潜在的新方向。本实验则是基于实验室前期全基因组关联分析(GWAS)工作,筛选出GPS2基因,针对目前GPS2基因的研究成果,考虑到该基因可能与猪的脂肪沉积有所关联,因而进行初步的基因克隆和序列分析,并研究其在长白猪种的不同组织表达情况差异,从而确定该基因是否对猪的脂肪沉积有确定的规律性影响,为后期的深入工作做探索。     

苏太猪源TTP基因的克隆及其遗传进化分析

为了分析苏太猪源Tristetraproin(TTP)基因CDS序列和遗传进化关系,试验根据Gen Bank公布的野猪源TTP基因设计1对特异性引物,通过RT-PCR从苏太猪血液中扩增出TTP基因CDS区,并进行克隆和遗传进化分析。结果:扩增所得的TTP基因CDS长度为981 bp,共编码326个氨基酸。同源性分析表明:该基因核苷酸编码序列同源性与Gen Bank中公布的野猪源TTP基因一致性最高,为99.8%。系统进化树显示:该基因与野猪源TTP基因在遗传进化树上位于同一分支,亲缘关系最近;与白鱀豚、虎鲸的亲缘关系最远。