大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP17克隆与功能分析

土壤磷多以植物不能直接吸收利用的植酸盐形式存在,而紫色酸性磷酸酶具有分解利用植酸磷,提高磷素利用效率的功能。为进一步发掘该类基因,本研究利用磷高效大豆‘中黄15’与磷低效种质‘牛毛黄’,克隆并分析紫色酸性磷酸酶基因GmPAP17的生物学功能。结果发现:GmPAP17具有996bp开放阅读框,编码331个氨基酸残基,编码蛋白具有较高的酸性磷酸酶与植酸酶活性;植酸磷处理条件下,GmPAP17在磷高效大豆中的表达量显著高于低效种质,且以胁迫处理后30~42d差异最大,说明该基因与大豆开花结荚期磷素高效利用相关;进一步分析超表达转GmPAP17拟南芥发现,3个转基因株系在植酸磷胁迫下的植株生物重与磷浓度显著高于野生型对照,证实GmPAP17具有提高转基因拟南芥植酸磷利用效率的功能。     

转紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14大豆研究

为获得磷高效利用转基因大豆新材料,构建紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14超表达载体pBI121-GmPAP14与pCAMBIA3301-GmPAP14,通过农杆菌介导子叶节转化技术将2个载体分别转入高产优质大豆品种,并分析了GmPAP14在转基因植株内的表达情况。结果显示,利用PCR和DNA测序分析可检测到转化植株中的目的条带,其中,转入p BI121-GmPAP14载体的保豆3号阳性植株有6株;转入pCAMBIA3301-GmPAP14载体的中豆32有9株,冀豆12有11株,农大豆2号20株。进一步将上述T0植株自交,目前已获得T_1转基因后代;经实时定量PCR检测,部分株系的GmPAP14表达量显著高于野生型对照,说明GmPAP14已整合到大豆基因组,并能够在转录水平正常表达。     

植物蛋白融合HA标签通用载体构建与应用

以植物表达载体pCamE(GenBank No.:JX841315)为基本骨架,HA蛋白YPYDVPDYA为标签序列,构建可分别融合目标蛋白N端与C端表达载体pCHAN与pCHAC,并增加有利外源基因插入的酶切位点,使之成为含有7个常见限制性内切酶(PstⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ、Bam HⅠ、KpnⅠ、SmaⅠ、ApaⅠ或SalⅠ)单一识别位点的通用型标签载体;为验证该载体实用性,将项目组自主克隆的大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP14(GenBank No.:JN967626)连接至上述载体,并转入拟南芥;经PCR检测与测序分析获得T2转基因株系,HA标签抗体Western blotting结果发现转pCHAN-GmPAP14、pCHAC-GmPAP14拟南芥可获得目的蛋白融合HA标签杂交条带,而对照无该条带出现,证明2个HA标签载体能够稳定融合外源基因编码蛋白N端与C端,且可在转基因植物中正常翻译表达,为植物蛋白分离纯化及相关领域研究提供了稳定可靠的通用型融合标签载体资源。     

西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因的克隆及分析

旨在利用基因工程手段将AeSePAP1基因转入到小麦,为获得耐低磷胁迫的小麦品种奠定基础。以西尔斯山羊草的叶片为材料,根据小麦和二穗短柄草的PAP1基因设计特异引物,采用同源克隆的方法获得西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因的cDNA序列,并将其命名为AeSePAP1。该基因长1.03kb,编码335个氨基酸,分子质量为37.95ku,等电点为5.55。与小麦PAP1基因相比,西尔斯山羊草PAP1基因的cDNA的编码区有36处发生碱基替代,包括24处转换和12处颠换,有16处编码的氨基酸残基不同,其序列一致性达94.66%。对AeSePAP1基因编码的蛋白质进行生物信息学分析发现,该蛋白具有信号肽和跨膜结构,定位于质膜或分泌到胞外。系统进化树分析表明,西尔斯山羊草紫色酸性磷酸酶PAP1基因与普通小麦、短柄草、谷子的PAP1基因同源性较高。     

玉米LEC1基因家族的鉴定与生物信息学分析

LEC基因家族包含LEC1和LEC2,参与植物的生长发育及储藏物质的积累。LEC1（Leafy Cotyledon 1）是NF-YB9蛋白家族的成员,编码了CCAAT-box结合转录因子HAP3（Heme activated protein 3）亚单位。利用生物信息学方法,获得了16个玉米LEC1基因。分析发现,ZmLEC1蛋白大部分都是酸性的不稳定亲水蛋白,含有1个保守结构域CBFD_NFYB_HMF及10个保守基序。通过与拟南芥LEC1基因和水稻LEC1基因的聚类分析,将玉米LEC1基因家族分为4类:ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ。经RNA-seq等分析发现,玉米LEC1家族基因具有组织特异性,响应非生物胁迫。启动子分析发现,玉米LEC1基因启动子上含有响应激素和非生物胁迫的顺式作用元件。     

苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10的克隆及功能鉴定

【目的】克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10,研究其组织表达模式和低磷响应,并进一步研究MdPAP10在低磷条件下的功能,为深入研究MdPAP10在果树中参与紫色酸性磷酸酶分泌和影响磷吸收的分子机理奠定基础。【方法】本研究以‘嘎啦’苹果（Malus×domestica‘Royal Gala’）为试材,利用同源序列比对和PCR技术,克隆苹果紫色酸性磷酸酶相关基因MdPAP10。通过NCBI分析MdPAP10的蛋白质结构并获得白梨、桃和草莓等10个物种的PAP10氨基酸序列,利用MEGA5.0构建系统进化树。利用qRT-PCR检测MdPAP10在苹果不同组织的表达情况和对低磷胁迫的响应特性。将MdPAP10连接到植物过表达载体pBI121,转化LBA4404农杆菌,用于侵染苹果愈伤组织。通过在抗性培养基上筛选和PCR鉴定,获得MdPAP10转基因愈伤组织。在低磷培养基上培养MdPAP10转基因愈伤组织检测其酸性磷酸酶积累情况以及对低磷胁迫的耐受性和磷含量。最后利用qRT-PCR检测MdPAP10转基因愈伤组织中磷相关基因的表达量。【结果】克隆获得苹果紫色酸性磷酸酶基因MdPAP10（基因序列号：MDP0000272096）,开放阅读框为1 332 bp,编码含有443个氨基酸的蛋白。蛋白质结构分析显示,MdPAP10包含一个信号肽和一个磷酸酶结构域。基因结构分析显示,MdPAP10含有5个外显子和4个内含子。进化树分析显示,苹果MdPAP10与白梨PbPAP10同源性最高,亲缘关系最近。表达分析显示,MdPAP10在根、茎、叶、花、果中均有表达,并且在根中的表达量最高。MdPAP10对低磷条件有明显响应,在根中表达量逐渐升高,在6 h达到最大后逐渐下降;在叶中的表达量始终低于对照组。MdPAP10转基因愈伤组织在低磷条件下能够明显促进酸性磷酸酶的分泌。在低磷条件下培养转基因愈伤组织20 d发现过表达MdPAP10提高了愈伤组织对低磷胁迫的耐受性,并且提高了对磷的吸收。qRT-PCR结果显示,过表达MdPAP10能够明显促进苹果磷相关基因的表达。【结论】MdPAP10能够对低磷胁迫有明显响应,在低磷条件下能够促进磷吸收和酸性磷酸酶的分泌。MdPAP10在响应低磷胁迫过程中发挥着重要的正调控作用。     

小麦植酸酶基因TaPHY1的克隆、分子特征和表达特性研究

利用小麦植酸酶基因PAPhya1进行同源查找,获得1个与该基因高度同源、尚未开展分子特征和生物学功能研究的小麦新型植酸酶基因TaPHY1.TaPHY1的全长cDNA序列为1771 bp,编码548个氨基酸残基,TaPHY1含有紫色酸性磷酸酶(PAP)类植酸酶通常含有的保守域Metallophos、Purple acid...     

正响应盐胁迫的甘蔗6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的克隆

从甘蔗中克隆获得1个6PGDH基因的cDNA序列,记为Sc6PGDH(登录号:KF921299).该基因序列含有1个1467 bp的完整开放阅读框,推导编码488个氨基酸残基.生物信息学分析可知,Sc6PGDH基因编码的蛋白分子质量为53.6561 ku,为酸性稳定的亲水蛋白,含有信号肽,可能定位于内质网膜上,具有该类蛋白典型的保守结构域6PGD,且与分离自谷子、玉米和水稻的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列同源性分别高达96.11%、95.70%和93.24%,表明该基因在进化过程中比较保守.原核生物生长试验结果显示,甘蔗Sc6PGDH基因的表达蛋白可以显著增强大肠杆菌Rosetta菌株的耐盐性,推测该基因可能参与了生物体对盐胁迫的应答过程.     

澳洲坚果蛋白磷酸酶基因MiSTPP1和MiSTPP4克隆与生物信息学分析

[目的] 通过澳洲坚果蛋白磷酸酶基因MiSTPP1和MiSTPP4克隆与生物信息学分析,以期为阐明澳洲坚果蛋白磷酸酶基因的功能及作用机制提供参考依据.[方法] 基于澳洲坚果转录组数据和RT-PCR方法克隆澳洲坚果蛋白磷酸酶基因,利用生物信息学分析基因编码蛋白质的同源性、系统进化、理化性质、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜域...     

红花油酸去饱和酶基因的克隆及序列分析

【目的】对红花油酸去饱和酶FAD2基因进行克隆和生物信息学分析,为深入研究该酶的功能提供理论依据。【方法】提取红花种子总RNA,通过RT-PCR方法进行反转录,PCR扩增得到FAD2基因全长cDNA序列。运用生物信息学方法,对红花FAD2氨基酸序列的理化性质、系统进化、蛋白定位和跨膜区域等进行预测和分析。【结果】成功克隆获得了红花FAD2基因,其开放阅读框cDNA长1 140bp,编码380个氨基酸,预测分子质量43.6ku,理论等电点8.37,带有正电残基(强酸性)30个、负电残基(强碱性)34个。FAD2蛋白含有3个极度保守的His-Box,不存在明显的信号肽,存在6个跨膜结构域,与疏水区域预测结果一致。红花FAD2核苷酸的分子进化树分析显示,其与日本栽培稻的亲缘关系较近。红花FAD2氨基酸序列比对结果表明,不同植物的FAD2具有较高的同源性,同源性平均达72.94%。【结论】成功克隆了红花FAD2基因,并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析。     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4启动子结构与活性分析

【目的】克隆GmPAP4启动子(PAP4-pro),并分析其表达特性,为进一步研究其作用机制奠定基础。【方法】依据GmPAP4 c DNA序列(Gen Bank No.HQ162477),通过比对大豆参考基因组,设计特异引物,克隆GmPAP4启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测该启动子相关调控元件。构建GmPAP4启动子驱动GUS表达载体(PAP4-pro-GUS)并转化根癌农杆菌GV3101;通过Floral dip法将PAP4-pro-GUS转化拟南芥,利用卡那霉素(Kan)抗性筛选和特异引物的PCR鉴定,最终获得T3转基因拟南芥。通过对T_3转基因拟南芥不同组织GUS染色,分析启动子的组织表达特性,将T3转基因拟南芥通过适磷和植酸磷处理,20 d后,取其根部进行GUS活性和表达分析,研究启动子对不同磷环境的响应。【结果】克隆了GmPAP4上游启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测显示,GmPAP4启动子除含有启动子核心的调控元件外,还含有(1)组织特异调控元件:as1(根系特异表达调控元件)和Skn-1_motif(胚乳特异表达调控元件);(2)应答元件:TC-rich repeats(逆境胁迫反应调控元件)和Box-W3(真菌应答相关调控元件);(3)结合位点:MBS(MYB转录因子的结合位点)等。不同组织GUS染色结果显示,转基因拟南芥整个根系GUS染色较深,茎、叶中仅微管组织有较明显GUS染色,花瓣微管组织中也能观察到微弱GUS染色。定量PCR结果显示,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS表达比适磷处理提高了1.3倍(P0.05);同时GUS活性测定显示,与适磷处理相比,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS活性提高了1.9倍(P0.05)。【结论】获得大豆GmPAP4启动子,通过不同组织GUS染色和不同磷环境GUS表达分析显示该启动子主要在根部且受低磷信号诱导表达,为诱导型启动子。     

黑豆NBS类抗病基因同源片段的克隆与分析

根据已克隆的抗病基因保守结构域设计简并引物,以湖南黑豆（HH）为试材,通过RT-PCR,从cDNA中扩增抗病基因同源序列,测序鉴定出2个含有通读阅读框的DNA片段：FNBSl、FNBS3。FNBS1大小为534bp,编码178个氨基酸;FNBS3大小为513bp,编码169个氨基酸。BLASTP分析表明,2个片段均具有NB-ARC结构域（与植物抗病有关）,并且包含p-loop、Kinase-2、HD等结构域。基因FNBSl与大豆基因RPMl-like编码的氨基酸序列的同源性为98％,基因FNBS3与大豆基因N-like 编码的氨基酸序列的同源性为99％,推测FNBS1、FNBS3可能是黑豆NBS-LRR类抗病基因的核心区域。     

禾谷孢囊线虫果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1的鉴定与表达特征分析

【目的】禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是一种严重危害麦类作物的重要植物病原线虫,对农业生产造成巨大的经济损失,然而其致病机制和有效防控方法还有待进一步研究。通过克隆禾谷孢囊线虫的果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1,并对其表达特性进行分析,为后续探究Ha-pel-1的基因功能及其与寄主的互作提供理论依据,并为探讨禾谷孢囊线虫防控途径提供新思路。【方法】采用同源克隆结合RACE技术从禾谷孢囊线虫中克隆出一个新的果胶酸裂解酶基因;采用DNAMAN、Clustal、Signal P 4.0 Server和GSDS等相关生物信息学软件和在线工具分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,并使用MEGA 5.0构建系统进化树;采用原位杂交和半定量PCR方法确定该基因的在禾谷孢囊线虫中的表达部位及其在线虫不同龄期中的表达情况。【结果】从禾谷孢囊线虫中成功克隆出一个果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1(Gen Bank登录号GQ998895),该基因c DNA全长1 717 bp,包含一个长度为1 563 bp的开放阅读框,编码一个长度为521个氨基酸残基的蛋白,其理论分子量为57.5 k D,理论等电点为8.52。从线虫基因组DNA中扩增获得长度为7 199 bp的Ha-pel-1基因组全长,基因结构显示分析发现,Ha-pel-1基因组包含14个外显子和13个内含子,除第3个内含子剪接位点是GC-AG外,其余12个内含子都符合真核生物基因剪接位点GT-AG规则。同源比对结果表明,预测蛋白Ha-PEL-1的C端与大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶HG-PEL-1、甜菜孢囊线虫果胶酸裂解酶HS-PEL-1均有67%的一致性和83%的相似性;此外,其N端信号肽后比报道的其他植物寄生线虫果胶酸裂解酶多出一段长度为254个氨基酸残基的序列,这段序列中,靠近N端的184个氨基酸残基与数据库中的蛋白均无相似性,而靠近C端有70个氨基酸残基(Lys205—Glu274)与韦塞尔斯布朗病毒NS5蛋白(注册号3ELD)的甲基转移酶区域有32%的一致性和47%的相似性。氨基酸序列分析发现,预测蛋白Ha-PEL-1包含一个长度为20个氨基酸残基的信号肽和4个果胶酸裂解酶第3家族(PL3)的高度保守区域以及多个保守的半胱氨酸残基;系统进化分析发现,Ha-pel-1及其他已报道的线虫果胶酸裂解酶基因与细菌和真菌来源的PEL聚在一个大的分支中;原位杂交结果显示Ha-pel-1主要在禾谷孢囊线虫亚腹食道腺中表达;半定量RT-PCR确定Ha-pel-1在寄生前和寄生后的2龄幼虫中大量表达。【结论】通过对禾谷孢囊线虫中一个新果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1的克隆和表达特征分析,揭示该基因与禾谷孢囊线虫的侵染和寄生过程密切相关。     

大豆C4H基因克隆及生物信息学分析

为了从分子水平上揭示大豆C4H的结构特点,并为提高其表达活性提供理论依据,利用RT-PCR技术克隆了大豆C4H基因,并已登录GenBank(登录号为FJ770468),长度为1 766 bp,编码区1 521 bp,编码一个含有506个氨基酸残基的多肽。生物信息学分析显示,C4H理论PI=5.30,Mw=39.092 ku;C4H是易溶、亲水性较强的蛋白,同时有两个明显的疏水峰,有2个跨膜肽段;通过HNN分析表明,C4H各个氨基酸残基对应的二级结构分别为α螺旋(Alpha helix)(Hh):251,49.60%,β折叠(Extended strand)(Ee):52,10.28%,无规卷曲(Random coil)(Cc):203,40.12%;Geno3d模建预测,C4H蛋白中β折叠区有57个折叠,折叠区间有24个α螺旋,此外还有14个卷曲结构。氨基酸序列和结构分析显示C4H蛋白包含了一个保守区,即P450 domain。利用SignalP分析得到信号肽存在几率、信号肽锚定几率均为0.498,切割位点位于28和29位氨基酸之间。     

大豆SBP基因家族的序列特征、表达及进化分析

SBP基因家族是植物所特有的一类重要转录因子,由多个成员组成,主要参与植物生长、发育以及多种生理生化过程.试验在大豆基因组中鉴定49个SBP基因,被命名为GmSBP1~49.基于生物信息学手段,对大豆该基因家族49个成员的基因结构、染色体定位、蛋白保守序列、亚细胞定位、表达情况及进化关系进行分析.序列分析表明,SBP基因家族成员分散于不同染色体上,不同基因具有不同个数的外显子,其数目变异范围为1~14;该家族蛋白含有5个保守基序,尽管与SBP结构域有所重叠,但它们能形成6种不同的组织模式,这说明该基因家族序列变异较为复杂.表达分析结果显示,除GmSBP2和GmSBP11等6个基因没有相应的EST外,其余基因都有转录活性;在具有转录活性的基因中,只有GmSBP46显示出组成型表达模式,剩余基因表现出不同程度的组织特异性表达模式.拟南芥、水稻和大豆SBP蛋白的进化树揭示该家族具有8个类群,其中E类群只包括大豆SBP基因,其他类群中大豆SBP基因数目也是最多,这充分说明大豆SBP基因家族起源与进化的复杂性.研究为大豆SBP基因功能研究提供线索     

延边黄牛转铁蛋白受体2基因克隆与序列分析

【目的】克隆延边黄牛转铁蛋白受体2（transferrin receptor 2,TFR2）基因,并分析该基因在不同组织器官中的表达分布。【方法】通过提取肝脏组织总RNA,采用RT-PCR及RACE方法克隆延边黄牛TfR2基因,采用生物信息学软件进行序列分析,用半定量PCR（SqRT-PCR）方法分析TfR2基因在不同组织器官中的表达分布规律。【结果】①成功克隆出了延边黄牛TfR2基因完整ORF区及3′UTR区（GenBank登录号：GU553087）,该基因全长2 901 bp,ORF区2 412 bp,编码803个氨基酸;②延边黄牛TfR2基因核苷酸序列与其它物种的同源性在80%以上,不同物种间TfR2基因氨基酸序列,尤其是影响其功能的关键氨基酸位点高度保守;③各物种TfR2蛋白功能结构域同样高度保守;④牛TfR2基因主要在肝脏中表达,其它组织,如脾脏、心脏、肾脏和肠道（十二指肠）中也存在少量表达。【结论】不同物种间TfR2基因具有高度同源性,功能结构域及组织分布规律具有高度保守性。     

不同基因型大豆GS1基因的克隆与分析

克隆了6个不同基因型大豆的GS1基因,序列比对分析结果表明,不同基因型大豆的GS1基因序列相似性较高.不同基因型大豆GS1基因序列间仍存在显著的差异,主要集中在非编码区.GS1基因分子进化树显示东农42、半野生大豆基因序列进化距离较近.不同基因型大豆GS1蛋白质序列具有很高的相似性,并且都具有两个保守的结构域、催化结构...     

Isolation and Characterization of NBS-LRR Class Resistance Homologous Gene from Wheat

One resistance gene analog fragment named RGA-CIN14 was isolated from TcLr19 wheat,which contains kinase-2,kinase-3a,and the GLPL motif of the NBS-spanning region,using degenerated primers according to the nucleotide binding site (NBS) conserved domain.Based on the RGA-CIN14,a full-length cDNA,CIN14,which was 2 987 bp encoding 880 amino acids,was obtained by using the method of the rapid amplification cDNA ends (RACE).Bioinformatics analysis showed that the deduced amino acids of CIN14 protein consisted of a NB-ARC conserved domain and many leucine-rich repeats (LRR) domains.The phylogenetic tree analysis indicated a considerable identity of the protein encoded by CIN14 with that of wheat leaf rust resistance gene Lr1,but a lower similarity with Lr21.The expression profile of the CIN14 gene detected by semi-quantitative RT-PCR showed that the CIN14 gene was not induced by Puccinia triticina and it was a constitutive gene with low abundance in the wheat leaf tissue.The resistance homology sequence was successfully obtained,which provides the shortcut for cloning of the resistance gene in TcLrl9 wheat.     

3份小麦品种（系）Gsp 1基因的克隆及序列分析

根据已报道的谷类作物硬度基因grain softness protein-1(Gsp-1)保守DNA序列设计一对特异性引物,以优质小麦品种(系)中国春、SZ-56及M9876基因组DNA为模板进行基因扩增、克隆和序列测定,获得636 bp的Gsp-1全长特异性片段。序列分析显示其含有495 bp完整的开放阅读框,编码全长为164 aa的蛋白,该蛋白含有Gsp-1典型的19 aa信号肽,10个保守的半胱氨酸以及2个保守的色氨酸。序列比对表明,Gsp-1基因不仅含有Gsp-1 a、Gsp-1 b和Gsp-1 c这3种类型,还含有一种新的类型,将其命名Gsp-1 d。进一步对其结构预测分析发现,Gsp-1蛋白可形成5个链间二硫键,含有4~5个α-螺旋。进化树分析显示Gsp-1基因与硬度主效基因Pina和Pinb有着紧密关系。     

枯草芽孢杆菌新抗病基因aiiA的克隆

枯草芽孢杆菌内生亚种BS-1aiiA基因测序结果表明,该基因(GenBank登录号DQ000640)由753个碱基组成,其编码的蛋白质含有250个氨基酸残基,与10个已报道的具有减弱欧文氏菌胡萝卜亚种致病力的AiiA蛋白酶氨基酸序列总的相似性为82%.它们均含有相同的氨基酸序列保守区.Signal P分析结果显示,BS-1 AiiA没有信号肽序列,并利用Swiss-model预测、分析了BS-1 AiiA蛋白的三维结构.