草原龙胆基因工程研究进展

草原龙胆(Eustoma grandiflorum)又称洋桔梗，是目前国际花卉市场上最受欢迎的高档鲜切花和盆花种类之一。近年来，国内外对草原龙胆基因工程的研究越来越多，文中对草原龙胆转基因高效遗传转化体系的建立和利用基因工程技术延长草原龙胆观赏期、增添其花色、增强其抗病虫害能力、提高其耐盐碱性的研究进展进行了综述，并对草原龙胆基因工程育种中出现的问题和草原龙胆基因工程的发展方向进行了讨论。     

草原龙胆采后生理与保鲜研究进展

草原龙胆是十大鲜切花之一，在国内外花卉市场中占据重要地位。切花瓶插寿命直接影响草原龙胆观赏价值及商品价值。文中从采后水分、生物大分子、能量、激素等几个方面阐述了草原龙胆采后生理生化变化，并对国内外切花保鲜技术在草原龙胆上的应用进行概述，以期为草原龙胆采后保鲜提供参考。     

赤峰地区草原龙胆引种观察试验

草原龙胆是一种新兴切花,为了探讨草原龙胆在赤峰地区种植的可行性,引进切花草原龙胆品种在赤峰地区进行栽培试验,通过设施栽培控制生长环境,观察生物学特性和生长发育周期,对不同品种间的差异性进行分析比较,研究草原龙胆在当地的适应性,筛选出赤峰地区的适栽品种。结果表明:草原龙胆在设施栽培条件下,能够正常生长发育。‘美国泛美(浅紫)'‘美国泛美(杂色)',品种株高与茎粗均匀,花形美丽,单株花朵数较多,瓶插时间长等综合性状表现较好,而‘美国泛美(白色)'‘美国泛美(玫瑰边)'表现较差。     

MiRNA－93－5p 对 VEGF 的转录调控及其与梅花鹿茸细胞增殖的关系1）

为了探讨miRNA－93－5p对梅花鹿血管内皮生长因子（ VEGF）的转录调控作用及其与鹿茸细胞生长的关系,分离了鹿茸顶端软骨组织细胞,利用Trizol试剂法提取细胞总RNA,反转录合成cDNA。根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿VEGF基因的3′端非编码区部分序列（3′UTR）特异引物并进行克隆,构建VEGF基因的3′UTR野生型及其突变体序列双荧光素酶报告基因载体并进行荧光素酶活性检测。再将人工合成的miRNA－93－5p模拟物转染鹿茸软骨细胞,MTT法检测鹿茸细胞体外增殖的变化;Western blotting分析VEGF蛋白的表达丰度。结果表明：成功获得了鹿茸组织VEGF基因的3′UTR序列,野生型序列长度为356 bp,突变体长度为336 bp。荧光素酶活性检测结果表明,转染野生型质粒组细胞荧光素酶活性降低,而转染突变体组细胞荧光素酶活性无明显变化。 MTT法和Western blotting结果显示,鹿茸细胞的体外增殖受到抑制,VEGF蛋白的表达水平下降,且呈时间依赖性。     

PDPK13′UTR双荧光素酶报告载体的构建及与gga-miR-148a-5p的靶向验证

本试验通过构建PDPK1基因3′UTR双荧光素酶报告载体,并验证gga-miR-148a-5p与PDPK1的靶向关系。利用生物信息学软件预测gga-miR-148a-5p与PDPK1结合位点;利用PCR扩增PDPK1基因3′UTR序列,将其克隆到PGL3-CMV-LUC-MCS双荧光素酶报告基因载体中;将gga-miR-148a-5p及阴性对照分别与野生型gga-PDPK1-WT-3′UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。Targetscan、miRbase数据库预测结果显示,gga-miR-148a-5p与PDPK1基因3′UTR存在互补结合位点;酶切及测序结果表明,双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性试验结果表明,gga-miR-148a-5p mimics能够与PDPK1基因3′UTR结合并抑制荧光素酶活性。gga-miR-148a-5p能够与PDPK1靶向性结合,PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因。     

草鱼SREBP-1-3'-UTR双荧光素酶报告载体构建及miR-33对其表达的影响

为研究草鱼(Ctenopharyngodon idella)miR-33在固醇调节元件结合蛋白-1(Sterol regulatory element binding protein 1,SREBP-1)调节脂代谢中的作用,构建了草鱼SREBP-1基因3'端非翻译区(Untranslated region,UTR)含miR-33靶序列的双荧光素酶报告基因载体。首先用PCR法获得SREBP-1 mRNA含miR-33结合位点的3'UTR序列(379 bp),与双荧光素酶报告载体pmir GLO重组后转染DH5α感受态细胞。然后经筛选和双酶切鉴定,获得含有SREBP-1基因3'-UTR的双荧光素酶报告载体:pmir GLO-SREBP-1-3'-UTR。最后在草鱼肝细胞L8824共转染miR-33mimics和pmir GLO-SREBP-1-3'-UTR,明确miR-33与SREBP-1基因3'UTR区的靶向关系。结果表明,含有SREBP-1基因3'-UTR序列的双荧光素酶报告基因载体构建成功,PCR、双酶切和基因测序证明序列与目标一致;转染pmir GLO-SREBP-1-3'-UTR的L8824细胞可表达荧光素酶,单独转染载体组的荧光素酶活性显著高于共转染载体和miR-33 mimics组(P0.05)。本研究证实草鱼SREBP-1是miR-33的直接靶基因,miR-33通过和SREBP-1 mRNA 3'UTR结合,调控SREBP-1基因的转录后表达。     

草原龙胆花瓣花色素苷组成及与其花色的关系

为探讨不同品系草原龙胆的花色素苷组成、含量及与花色表型之间的关系,以12个草原龙胆(Eustoma grandiflorum)品系花瓣为研究材料,采用英国皇家园艺学会比色卡(RHSCC)和国际照明委员会CIE L*a*b*系统描述花色,定性定量分析花瓣中花色素含量并采用液质联用技术分析色素苷组成。结果表明:通过花色描述12个草原龙胆品系可分为4个色系:蓝紫色系、粉紫色系、橙红色系和白色系。定性分析中,所有草原龙胆品种的花瓣色素提取液中均含有黄酮类化合物,不含或含有少量类胡萝卜素类物质。除两个品种外均含有花色苷,但不同品种之间花色苷组分和含量存在差异。在10个品系草原龙胆花瓣中共检测到6种花色苷成分,推定成分为:飞燕草3,5-二葡萄糖苷、飞燕草3-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-乙酰-葡萄糖苷、天竺葵素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-乙酰葡萄糖苷及矢车菊素3-O-香豆酰葡萄糖苷-5-O-丙二酰葡萄糖苷。相关分析研究表明不同品种草原龙胆花瓣颜色的呈现与花色苷种类有关,花瓣色彩度与花瓣中花色苷总含量成正相关。研究结果为草原龙胆新品种培育、花色改良育种等研究提供理论依据。     

p53基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miRNA-2127靶向关系的验证

为了验证miRNA-2127与p53基因的靶向关系,利用生物信息学软件预测p53与miRNA-2127的结合位点,全基因合成法合成该结合位点的野生型与突变型模板,并将其克隆到pmiR-RB-REPORT~(TM)双荧光素酶报告载体中,构建野生型与突变型重组双荧光素酶报告质粒。将293T细胞分为4组,分别共转染野生型报告质粒+阴性对照(NC)、野生型报告质粒+miRNA-2127、突变型报告质粒+NC、突变型报告质粒+miRNA-2127。检测各组细胞中荧光素酶活性差异,结果显示:共转染了野生型报告质粒+miRNA-2127的293T细胞与共转染了野生型报告质粒+NC组相比,荧光素酶活性显著降低(P<0.05);且突变型报告质粒+miRNA-2127组的相对荧光素酶活性显著高于野生型报告质粒+miRNA-2127(P<0.05),说明miRNA-2127能够靶向调控p53基因,且结合位点位于3′UTR区369—375间。     

MDR1启动子的克隆及其转录活性的检测

目的 克隆人多药耐药基因1 (MDR1)5'非编码区启动子序列,并检测该段启动子在人肝癌细胞株HepG2中的转录活性.方法 提取HepG2肝癌细胞基因组DNA,PCR扩增人MDR1启动子序列(-1 040～ +288);采用基因重组技术构建由MDR1启动子驱动的荧光素酶报告基因载体,将该载体瞬时转染HepG2细胞,通过双荧光素酶报告基因试剂盒检测该MDR1启动子在HepG2细胞的转录活性.结果 PCR扩增出人MDR1启动子(-1 040～ +288)片段,PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定均证实该段启动子驱动的荧光素酶报告基因载体构建正确;转染实验证实,转染该质粒的HepG2细胞中荧光素酶活性很高.结论 成功克隆了人MDR1启动子(-1 040～ +288),并证实该MDR1启动子具有较强的转录活性.该启动子的成功克隆为后续研究MDR1基因在药物耐药中作用和基因表达调控机制提供了载体.     

草原龙胆无性快繁体系建立的初探

[目的]研究草原龙胆以茎段为外植体的丛生芽的诱导与增殖情况。[方法]以草原龙胆为试材,用生长健壮的草原龙胆植株茎段为外植体建立其高效快繁体系,以MS、MB、N63种培养基及IBA,6-BA,GA 3种激素进行正交试验设计。[结果]结果表明,适宜的脱毒材料为0.1%的HgC l2。当基本培养基为MB(MS大量+B5微量+B5有机+Fe盐),IBA为2.0 mg/L,6-BA为0.5mg/L,GA为2.0 mg/L时,其丛生芽的诱导率、分蘖率最高。[结论]该试验结果可用于组织培养快速繁殖草原龙胆。     

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763~-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763~-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。     

Let-7a负性调控人肾上皮细胞293T中UHRF1基因的表达

目的:探讨人肾上皮细胞293T中let-7a对靶基因UHRF1的负性调控作用.方法:运用生物信息学技术对let-7a靶基因进行预测和分析.构建含有UHRF1 3'UTR全长的野生型(pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt)和突变型荧光素酶报告质粒(pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-mut),分别将pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt,pmiR-RB-UHRF1-3'UTRmut,pmiR-RB-REPORT vector与let-7amimics或mimics control共转染293T细胞,双荧光素酶报告系统检测转染后293T细胞的荧光素酶表达水平.293T细胞分别转染let-7amimics和inhibitor,western blot和real-time RT PCR检测UHRF1基因的表达.结果:生物信息学结果显示let-7a有48个预测靶基因,包括UHRF1,HMGA2,MAPK6等,主要涉及microRNA在肿瘤、细胞周期、PI3K-AKT、p53等信号通路.其中UHRF1 3'UTR含有一个let-7a的结合位点,且在多个物种中呈高度保守.进一步双荧光素酶检测发现,共转染let-7amimics和pmiR-RBUHRF1-3'UTR-wt的293T细胞荧光素酶活性显著降低(p0.01).Western blot和real-time RT PCR结果显示转染let-7amimics的293T细胞UHRF1表达降低,而转染let-7ainhibitor的293T细胞UHRF1表达增高.结论:人肾上皮细胞293T中let-7a能通过与UHRF13'UTR靶向结合,负性调控UHRF1的表达.     

美洲棉铃虫CYP321A1基因启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体的构建及活性测定

【目的】构建美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,为探索CYP321 A1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】设计合成PCR引物,从美洲棉铃虫基因组DNA中扩增并克隆CYP321 A1基因的启动子区;将克隆的启动子片段插入载体pGL3-basic构建萤火虫荧光素酶报告基因载体p(-1 470/+64);用p(-1 470/+64)转染美洲棉铃虫脂肪体细胞系BCIRL-HzFB33,并用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】p(-1 470/+64)经双酶切、PCR鉴定及DNA测序分析鉴定准确无误;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,证实所构建的重组载体p(-1 470/+64)可以反映CYP321 A1启动子活性;黄酮、花椒毒素处理极显著地增强了重组载体p(-1 470/+64)的荧光活性。【结论】成功构建了美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,CYP321A1启动子活性可以被植物次生物质黄酮、花椒毒素高度诱导。     

荧光素酶报告系统检测大肠杆菌代谢产物调控STC-1细胞表达胆囊收缩素研究

[目的]本文旨在筛选出可调控肠道Ⅰ细胞表达胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)的大肠杆菌代谢物,建立可方便检测CCK表达的STC-1细胞模型。[方法]利用分子克隆技术构建含有CCK启动子调控荧光素酶的慢病毒载体,包装慢病毒并感染STC-1细胞,获得STC-1/CCK-Luc细胞系。用大肠杆菌基因敲除株培养液上清处理上述细胞,检测荧光素酶活性,确定可影响CCK表达的大肠杆菌基因及代谢产物。使用纯化的代谢产物处理STC-1细胞及肠道类器官,通过Western blot及免疫荧光法检测CCK表达水平的变化。[结果]酶切鉴定及DNA测序表明慢病毒载体构建成功,荧光素酶活性检测发现大肠杆菌ΔSapD株菌液上清可显著抑制荧光素酶的表达。敲除SapD基因可以使培养液中腐胺水平下降,而腐胺可以上调STC-1细胞及肠道类器官中CCK的表达。[结论]成功构建了能够体外检测CCK表达的细胞系,筛选出1个能够调控CCK表达的大肠杆菌突变体。     

调节猪Smad3 表达的miRNA 鉴定

生物信息学预测猪Smad3为miR-23a的靶基因,为了研究猪Smad3与miR-23a之间的调节关系,人工合成miR-23a双链序列及Smad3基因3'UTR中mR-23a的结合位点序列,分别与带荧光的慢病毒质粒pshRNA-copGFP Lentivector及萤光素酶质粒pPGL3-control连接,构建重组质粒LV-shRNA-miR-23a和pPGL3-control-Smad3-3'UTR.将两重组质粒共转CHO细胞,以慢病毒空质粒与pPGL3-control-Smad3-3'UTR共转作为对照,48 h后收集细胞裂解液检测荧光素酶活性变化,提取细胞总RNA实时荧光定量检测荧光素酶基因mRNA表达变化.结果显示,试验成功构建了重组质粒LV-shRNA-miR-23a和pPGL3-control-Smad3-3'UTR.miR-23a能够显著抑制荧光素酶基因mRNA表达(P＜0.05),并能通过抑制Smad3结合位点序列抑制其上游荧光素酶的活性(P＜0.05).初步证明,猪Smad3与miR-23a有直接的靶向关系.     

靶向猪CLTC基因miRNA的预测与验证

网格蛋白介导的胞吞是病毒侵入细胞的重要途径,网格蛋白重链(clathrin heavy chain,CLTC)是形成网格蛋白小窝结构的重要组成部分。针对CLTC基因的转录后调控特别是调控猪Sus scrofa CLTC的miRNA目前还不太清楚。本研究旨在筛选出调控猪CLTC基因的miRNA。利用生物信息学方法预测出6个靶向猪CLTC基因的miRNA,将猪CLTC基因3′UTR克隆至双荧光素酶报告基因载体psi CHECK2中获得双荧光素酶报告基因重组载体psi CHECK2-CLTC-3′UTR。将预测得到的miRNA分别和重组载体psi CHECK2-CLTC-3′UTR共转染到细胞中,以乱序序列作为阴性对照(NC),检测miRNA对重组质粒荧光素酶活性的影响。结果发现miR-205,miR-1,miR-129-5p和miR-206均能够显著抑制荧光素酶活性(P0.05)。在猪肾上皮细胞系PK15细胞中超表达miR-1和miR-129-5p后,定量PCR(q-PCR)结果显示:猪CLTC基因的表达量显著下调。突变了psi CHECK2-CLTC-3′UTR载体中这4个miRNA的种子序列的结合位点发现:miR-1对突变质粒中的荧光素酶无显著抑制作用。表明miR-1与猪CLTC基因有直接的靶向关系,并通过其种子序列抑制CLTC基因的表达。     

草原龙胆高温诱导莲座化的代谢组学分析

为揭示高温引起草原龙胆莲座化的代谢机制,采用气相色谱-质谱法(GC-MS)结合代谢组学分析技术,研究常温和高温处理下草原龙胆成熟叶片和茎尖的代谢差异。共鉴定出30种代谢产物,偏最小二乘法判别分析显示不同温度下和不同组织中的代谢物均得到很好的分离。方差分析表明,与常温处理相比,高温下草原龙胆茎尖中的糖类含量降低,有机酸含量升高,而成熟叶片内的变化趋势刚好相反。推测草原龙胆在高温胁迫下茎尖的糖类含量下降可能导致其发生莲座化,从而无法正常抽薹开花;而成熟叶片中增加的可溶性糖有利于提高植株的渗透保护能力,从而抵抗非生物逆境。在不同组织间,高温下的差异明显小于常温下代谢物的差异。推测常温下茎尖与成熟叶较大的差异体现了异质性的发育趋势,而高温下组织间差异的缩小体现了机体共同应对胁迫的系统防御机制。     

洋桔梗切花栽培管理技术

洋桔梗(Eustoma russellianum)亦称草原龙胆，由于具花姿优美、花色淡雅、瓶插寿命较长等优点，近年国内切花市场的需求量以年均30％以上的速度急剧上升。     

双荧光素酶报告基因系统验证Nlu-miRNA-8对Ccdc124的靶向调控

构建psi-CHECK2双荧光素酶报告基因载体,验证褐飞虱Nlu-miRNA-8对Ccdc124基因(coiledcoil domain-containing protein 124-like)表达的影响。首先设计合成包含与Nlu-miRNA-8结合序列的Ccdc124基因片段,构建双荧光素酶报告基因载体,转染果蝇S2细胞,通过荧光素酶活性变化观察NlumiRNA-8对Ccdc124表达的影响。结果发现,nlu-miRNA-8对Ccdc124组的荧光表达有非常显著的抑制作用,而对空白对照、阴性对照组的荧光表达没有显著的抑制作用。研究成功构建了psi-CHECK2/Ccdc124 3′UTR载体,并初步证实Nlu-miRNA-8对Ccdc124基因有调控作用。     

不同植物生长调节剂处理对干藏草原龙胆切花品质和花青素的影响

草原龙胆(Eustoma grandiflorum)是近年来鲜切花市场上的新星,由于花色繁多、花型典雅深受人们喜爱。但其采后不耐干藏易出现切花品质的下降,故筛选适宜草原龙胆的保鲜剂成为生产上急需解决的问题。以草原龙胆露西塔紫色重瓣品种为试材,考察含不同植物生长调节剂KT(40mg·L~(-1))、ABA(50mg·L~(-1))、6-BA(25mg·L~(-1))、GA(50mg·L~(-1))和IAA(100mg·L~(-1))的处理液,瓶插预处理24h后,对瓶插寿命、切花品质、衰老生理进程和花青素含量的影响。结果表明:与对照(CK)相比,50mg·L~(-1)GA处理瓶插寿命增加了4.2d,且有效提高切花观赏品质(最大切花直径增大;开放花朵数增加和萎蔫花朵数降低;花茎弯头降低);与CK相比GA处理在抑制可溶性蛋白质的降解和MDA的积累方面具有较好的效果,并且相对电导率在不同植物生长调节剂处理中最低;植物生长调节剂处理有利于草原龙胆切花保持较高的花青素含量,且GA处理的花青素含量较高。综上,50mg·L~(-1)GA处理延长草原龙胆切花的花瓶寿命,提高观赏品质,减少衰老氧化造成的损害,使花朵花色更鲜艳,花青素含量更高。