鸡促性腺激素释放激素对鸡卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响

用不同剂量鸡促性腺激素释放激素（ｃＧｎＲＨ－Ｉ和ｃＧｎＲＨ－Ⅱ）单独或与鸡ＬＨ（ｃＬＨ）协同处理短期（３ｈ）培养的鸡卵泡颗粒细胞，以观察鸡ＧｎＲＨ对颗粒细胞孕酮分泌的影响。结果表明：随着卵泡的成熟，孕酮分泌量逐渐增加，到Ｆ１卵泡时增加最明显；在本实验所用细胞孕酮分泌都有明显促进作用，ＧｎＲＨ－Ⅱ使Ｆ２至Ｆ４卵泡颗粒细胞孕酮分泌量有增加，而对Ｆ３卵泡颗粒细胞作用量明显，用鸡ＧｎＲＨ－Ⅱ的促进作用更明     

cGnRH对鸡卵泡膜细胞增殖的作用

建立鸡卵泡膜细胞体外无血清贴壁培养模型，研究了鸡促性腺激素释放激素（cGnRH－Ⅱ）对鸡卵泡膜细胞增殖的作用。细胞在培养箱内预培养约24h后进行各项处理，继续培养72h后，分别用胰蛋白酶消化成单个细胞，然后计数。结果表明：cGbnRH－Ⅱ能促进膜细胞增殖，作用效果具有剂量依赖关系；该促进作用能被GnRH拮抗剂（G－Ant）所阻断。这提示cGnRH－Ⅱ对膜细胞增殖的刺激作用有可能通过与膜细胞上特异的GnRH受体结合而起作用的。     

鸡促性腺激素释放激素对鸡卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响

用不同剂量鸡促性腺激素释放激素(cGnRH-Ⅰ和 cGnRH-Ⅱ)单独或与鸡 LH(cLH)协同处理短期(3h)培养的鸡卵泡颗粒细胞,以观察鸡 GnRH 对颗粒细胞孕酮分泌的影响。结果表明:随着卵泡的成熟,孕酮分泌量逐渐增加,到 F_1卵泡时增加最明显;在本实验所用剂量范围内,鸡 GnRH 对颗粒细胞孕酮分泌有促进作用,其中 GnRH-Ⅰ对 F_1至 F_4卵泡颗粒细胞孕酮分泌都有明显促进作用,GnRH-Ⅱ使 F_2至 F_4卵泡颗粒细胞孕酮分泌量有增加,而对F_3卵泡颗粒细胞作用最明显,用鸡 GnRH 预处理30min 能加强鸡 LH 对鸡卵泡的颗粒细胞孕酮分泌的促进作用,其中 GnRH-Ⅱ的促进作用更明显。     

IGF-I对体外培养山羊卵泡颗粒细胞增殖与分化的影响

为弄清ＩＧＦ－Ｉ在山羊卵泡不同发育阶段对颗粒细胞增殖与分化的影响,分类采集山羊小腔和大腔卵泡颗粒细胞进行体培养,对培养后颗粒细胞的ＤＮＡ含量和孕酮分泌量进行测定。结果表明,ＩＧＦ－Ｉ对来源于大,小卵颗粒细胞的增殖与分化都有促进作用。     

外源bcl—2基因和脂质体对鸡卵泡颗粒细胞体外分裂和凋亡的影响

选用正在产蛋的罗曼鸡，取其排序第3的卵泡分离层颗粒层细胞，用含血清培养基培养，并用含脂质体每孔0．0，0．6，1．2，2．4，4．8μL和bcl-2基因重组质粒每孔0．2μg转染卵泡颗粒细胞。用流式细胞术等方法分析转基因后的源代细胞和传代细胞的生长与凋亡情况。结果发现，与未转染组相比，转染后的传代细胞分裂速度较快（P＜0．01）、凋亡比率较低，G2／M＋S期细胞极显著高于对照（P＜0．01），且与脂质体浓度有剂量依赖关系。在转染时间为12h、DNA含量为每孔0．2μg的条件下，脂质体最佳转染浓度为每孔1.2μL。这些结果进一步证明，外源bcl-2基因或脂质体具有促进细胞分裂、抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的作用。     

鸡卵泡颗粒细胞转染Bcl-2基因对IGF-1分泌的影响

选用正在产蛋的罗曼鸡,取体积排序第一（F1）和第四（F4）的卵泡,分离颗粒细胞层细胞。采用脂质体介导方法将来源于F1和F4卵泡的颗粒细胞用PBS（对照）、空载体或Bcl-2重组质粒处理,然后在不完全无血清培养基（不添加胰岛素）中培养48和96h,用流式细胞术检测Bcl-2蛋白表达,用放射免疫测定技术检测IGF-1的含量。结果发现,转染Bcl-2重组质粒组的Bcl-2蛋白表达量和IGF-1分泌量均多于其他各组。分析来源于不同卵泡期卵泡颗粒细胞的分泌功能,发现随时间的增加F1细胞IGF-1分泌量减少,而F4的IGF-1分泌量基本不变。结果表明,在鸡卵泡颗粒细胞中转染的Bcl-2基因具有表达功能,表达的蛋白具有调节鸡卵泡颗粒细胞分泌IGF-1的作用;鸡卵泡颗粒细胞IGF-1的分泌还受鸡卵泡的大小和颗粒细胞在体外培养时间的影响。     

鸡卵泡颗粒细胞转染Bcl-2基因对IGF-1分泌的影响

选用正在产蛋的罗曼鸡,取体积排序第一(F1)和第四(F4)的卵泡,分离颗粒细胞层细胞.采用脂质体介导方法将来源于F1和F4卵泡的颗粒细胞用PBS(对照)、空载体或Bcl-2重组质粒处理,然后在不完全无血清培养基(不添加胰岛素)中培养48和96 h,用流式细胞术检测Bcl-2蛋白表达,用放射免疫测定技术检测IGF-1的含量.结果发现,转染Bcl-2重组质粒组的Bcl-2蛋白表达量和IGF-1分泌量均多于其他各组.分析来源于不同卵泡期卵泡颗粒细胞的分泌功能,发现随时间的增加F1细胞IGF-1分泌量减少,而F4的IGF-1分泌量基本不变.结果表明,在鸡卵泡颗粒细胞中转染的Bcl-2基因具有表达功能,表达的蛋白具有调节鸡卵泡颗粒细胞分泌IGF-1的作用;鸡卵泡颗粒细胞IGF-1的分泌还受鸡卵泡的大小和颗粒细胞在体外培养时间的影响.     

卵泡刺激素对原癌基因c-myc在鸡卵泡上表达的影响

[目的]本试验旨在研究c-myc基因在鸡卵泡上的表达及卵泡刺激素(FSH)对其的诱导作用,为明确c-myc在鸡卵泡发育过程中的相关机制提供理论基础。[方法]体外分离鸡小白卵泡(SWF)、大白卵泡(LWF)、小黄卵泡(SYF)、F4和F1卵泡颗粒层和膜层,检测c-myc mRNA和蛋白的表达;应用50 ng·mL^-1FSH处理小黄卵泡36 h,测量卵泡颗粒层的厚度和密度,检测颗粒层和膜层c-myc、标记基因和周期相关基因的表达;体外分离、培养小黄卵泡颗粒细胞,预培养16 h,用siRNA干扰c-myc 24 h后,加入50 ng·mL^-1 FSH处理24 h,检测c-myc mRNA的表达。[结果]c-myc mRNA在等级前卵泡的颗粒层和膜层的表达水平都显著高于排卵前卵泡,卵泡的颗粒层和膜层上都有c-Myc蛋白表达。与对照组相比,FSH处理后,小黄卵泡颗粒层厚度增加约25.5%(P<0.05),密度增加约27.8%(P<0.01)。在小黄卵泡颗粒层上,FSH降低了c-myc和类固醇激素合成急性调节蛋白(star)mRNA的表达水平...     

鸡促性腺激素释放激素对卵泡膜分泌雌二醇的影响

本实验选用性成熟的京白种蛋鸡,从同一产蛋顺序中取其发育不同阶段的各级卵泡(F_1～F_4),分离膜层,消化为单个的膜细胞,进行短期细胞培养,着重观察鸡促性腺激素释放激素(GnRH)对培养过程中膜细胞雌二醇分泌的影响.用放射免疫法测定细胞培养液中雌二醇的含量,得到以下结果:①未加外源激素处理的对照组细胞,随着卵泡从小到大的发育成熟过程,膜细胞雌二醇的分泌量逐渐降低;②适当剂量的鸡 GnRH-Ⅱ对各级卵泡膜细胞雌二醇的分泌均有促进作用,其中 F_4,F_3,F_2比 F_1更敏感;③加前体物(孕酮或雄烯二酮)之后,再加鸡 GnRH-Ⅱ比单加前体物或单加鸡 GnRH-Ⅱ,膜细胞雌二醇的分泌量增加更明显.实验结果提示,在体外细胞培养的条件下,GnRH-Ⅱ对膜细胞雌二醇的分泌不仅有促进作用,还可能促进雌二醇的合成。     

Kisspeptin-10对无血清培养鸡F1级卵泡颗粒细胞孕酮分泌的影响及机制研究

【目的】研究kisspeptin-10对无血清培养的鸡卵泡颗粒细胞孕酮分泌的作用及可能机制。【方法】选取200日龄处于产蛋高峰期的伊莎蛋鸡,于排卵前剖腹收集F1卵泡,分离纯化颗粒细胞,于含胎牛血清培养基中培养24 h,换成无血清培养基稳定培养24 h后,用不同浓度的Kp-10、U73122、EGTA等单独或共同处理细胞,收集细胞上清,放射免疫学方法检测培养基中孕酮含量。【结果】（1）通过免疫细胞化学方法,显示颗粒细胞上有Kp-10免疫活性样物质的阳性表达;（2）Kp-10处理可显著增加无血清培养的颗粒细胞的活力,100 nmol•L-1时可显著促进孕酮的分泌（P＜0.05）;（3）与对照组相比,2 μmol•L-1 U73122（磷脂酶C抑制剂）对孕酮的分泌无显著影响（P＞0.05）,而0.5、2 μmol•L-1 U73122能显著降低Kp-10对孕酮分泌的促进作用（P＜0.05）;（4）钙离子阻断剂Verapamil（1-100 μmol•L-1 ）呈剂量依赖性降低孕酮的分泌,于100 μmol•L-1时达显著降低水平（P＜0.05）;与1 μmol•L-1 Verapamil单独处理组相比,100 nmol•L-1 Kp-10与1 μmol•L-1 Verapamil同时处理可显著增加孕酮的分泌,而与10、100 μmol•L-1 Verapamil共同处理不能逆转其对孕酮分泌的抑制作用（P＞0.05）,且胞内钙离子含量与上清液中孕酮分泌水平相一致;（5）与100 nmol•L-1 Kp-10处理组相比,1和5 mmol•L-1 EGTA共同处理时孕酮分泌显著降低,当再加入1.5 mmol•L-1 Ca2+时孕酮分泌量显著增加。【结论】Kp-10促进体外培养的鸡卵泡颗粒细胞孕酮的分泌,其机制可能与胞内Ca2+信号通路有关。     

牛卵泡微环境对颗粒细胞和卵母细胞及早期胚胎发育的影响

[目的]研究卵泡微环境对颗粒细胞与卵母细胞质量及体外受精胚胎发育的影响。[方法]从不同直径大小的卵泡中收集卵母细胞和颗粒细胞,Hoechst33342染色观察卵母细胞核形态;采用Annexin-V-FITC/PI法染色、流式细胞仪检测颗粒细胞的凋亡情况;进行受精卵体外培养,并计算受精率及受精卵的囊胚率。[结果]大卵泡（〉10 mm）和小卵泡（〈3 mm）内颗粒细胞凋亡率明显高于3～7和7～10 mm卵泡内的颗粒细胞凋亡率（P〈0.05）大卵泡和小卵泡内的大量卵母细胞呈现出染色质固缩、核碎裂及胞浆浓缩等凋亡特征。3～7和7～10 mm卵泡内的卵母细胞成熟率明显高于大卵泡和小卵泡（P〈0.05）。来源于不同直径卵泡的卵母细胞,其卵裂率和囊胚率差异均不显著。[结论]卵泡微环境是影响牛胚胎体外生产的主要环节,直径为3～10 mm卵泡内颗粒细胞质量及卵母细胞的体外成熟率较高,卵泡直径对卵母细胞受精及受精卵的早期发育没有影响。     

大豆异黄酮对牦牛卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响

[背景]大豆异黄酮主要包括染料木素和大豆苷元,发挥类雌激素样作用,能够清除自由基,促进细胞增殖.颗粒细胞是卵泡内重要的细胞群体,其生理状态与卵巢功能直接相关.颗粒细胞凋亡常引起卵泡闭锁.牦牛是青藏高原特有物种之一,但其繁殖率低,其具体机制尚不明确.卵巢颗粒细胞是研究雌性动物生殖调控机制的理想细胞模型.[目的]探讨大豆异...     

生长激素释放肽-2对猪垂体细胞分泌生长激素的影响

 【目的】采用体外试验，研究了生长激素释放肽-2（GHRP-2）在不同处理浓度、不同处理时间和不同处理次数条件下对新生仔猪垂体细胞分泌生长激素（GH）的影响。【方法】分离1～3日龄新生仔猪腺垂体细胞,贴壁培养形成单层后，分别用0、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol•L-1浓度的GHRP-2处理垂体细胞2 h；用10-6mol•L-1浓度的GHRP-2处理垂体细胞5～180 min；连续用10-6mol•L-1浓度的GHRP-2处理垂体细胞6次，每次1h。【结果】10-12～10-5 mol•L-1浓度的GHRP-2都能作用于体外培养的垂体细胞，刺激垂体细胞分泌GH（P＜0.01），10-12～10-8 mol•L-1浓度之间差异不显著（P＞0.05），10-7～10-5组极显著高于10-12～10-8 mol•L-1（P＜0.01）,GHRP-2适宜浓度为10-6mol•L-1；GHRP-2能引起GH的快速分泌，在10～20 min内就可使GH的分泌达到最大；在连续处理的前3次，GHRP-2能促进GH的分泌，从第4次开始，GH的分泌出现抑制状态，并随着处理次数的增加抑制状态更强。【结论】GHRP-2能够促进垂体细胞分泌GH，但其作用效果与处理剂量、时间和次数有关。     

CHO表达生长激素释放因子的生物活性测定

在对生长激素释放因子(GRF)基因改造和化学合成，并构建了其真核表达载体pCDNA3-GRF(1-32)的基础上．用Lipofectin将上述载体转染CHO细胞进行瞬时表达，采用体外单层垂体细胞培养的方法对表达的GRF(1-32)进行了体外生物活性测定，即先将垂体用酶进行消化，再将消化细胞培养，形成单层细胞，利用其能合成与释放生长激素的能力来检测GRF的活性。结果表明：表达产物可刺激生长激素释放，并且比对照组提高3．8倍，     

原核表达梅花鹿IGF-1成熟多肽对鸡CEF和CEK细胞增殖的影响

本实验利用原核表达载体pET-30a对梅花鹿胰岛素样生长因子-1(Insulin Growth Factor,IGF-1)成熟多肽基因进行诱导表达与纯化,经羟胺裂解和复性后获得重组梅花鹿IGF-1成熟多肽蛋白。再通过MTT法检测重组蛋白IGF-1对鸡胚成纤维细胞(Chick Embryo Fibroblast,CEF)及鸡胚肾细胞(Chicken Embryo Kidney,CEK)增殖的影响。MTT法检测结果发现不同浓度的重组IGF-1成熟多肽皆能促进鸡胚成纤维细胞的增殖,其中,在48 h、终浓度为200 ng/m L时对鸡胚成纤维细胞增殖的影响最显著。但不同浓度的重组IGF-1成熟多肽以及不同处理时间对鸡胚肾细胞增殖均无显著影响。本研究结果说明原核表达的IGF-1成熟多肽可显著促进鸡胚成纤维细胞的增殖,但对鸡胚肾细胞的增殖影响不显著。