巴戟天ISSR体系的建立与优化

以巴戟天叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于巴戟天的ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件,即20μl PCR反应体积中含0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,50 ng模板DNA.PCR扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,53.4℃退火45 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸10 min,4℃保存.应用该ISSR体系对6份巴戟天种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

广东紫珠ISSR-PCR反应体系建立及引物筛选

为建立稳定性、重复性好的广东紫珠ISSR-PCR反应体系,以广东紫珠总DNA为试验材料,通过单因子结合正交试验对模板DNA浓度、dNTPs浓度、Mg²⁺浓度、引物浓度和Taq酶用量进行优化,确立了适用于广东紫珠的最佳ISSR-PCR反应体系：0.25 mmol/LdNTPs、1.00 U Taq DNA聚合酶、0.75μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg²⁺、100 ng模板DNA,总反应体积为25μL。同时建立重复性和稳定性均较好的ISSR-PCR扩增程序：预变性94℃,5 min;变性94℃,30 s;退火温度与每个引物相对应,退火45 s;72℃延伸90 s;34个循环;后72℃延伸10 min;4℃保存,扩增结束。用来自不同居群4个个体,以100个ISSR引物进行PCR扩增,筛选出扩增效果较好的20个引物。     

正交设计优化狭叶坡垒ISSR-PCR反应体系

以狭叶坡垒DNA为模板,利用正交试验分别对ISSR-PCR反应的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最佳退火温度和循环次数,最终确定狭叶坡垒最佳反应体系及扩增条件为：25 μL体系中1×PCR buffer,2 mmol/L MgCl2,0.25 mmol/L dNTPs,0.04 U/μL Taq聚合酶,0.2 μmol/L引物,4 ng/μL DNA模板;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s,53℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃最后延伸7 min。     

黄枝油杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

先运用正交设计进行初步筛选,再用单因素设计逐一优化对ISSR-PCR扩增效果有影响的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、模板DNA、循环次数及退火温度.建立了黄枝油杉的最佳反应体系和程序,即25μL体系中含2.0mmol/L的Mg2+、1.5U Taq DNA聚合酶、0.10mmol/L的dNTP、1.0μmol/L的引物、30ng的模板DNA以及2.5μL10×PCR buffer,其余的用灭菌的ddH2O补够25μL.扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～56℃(不同的引物,其退火温度不同,根据具体引物而定)退火45s,72℃延伸90s,以上3个步骤循环50次;最后72℃延伸7min;扩增产物放在4℃冰箱中保存.该体系和程序稳定性良好,结果可靠,可用于黄枝油杉遗传多样性分析.     

枣树RAPD分析体系优化研究

利用随机引物扩增多态性(RAPD)分子标记技术研究不同枣树品系之间遗传多态性,建立起一个基于PCR技术的分子遗传标记RAPD分析的优化体系.设置不同的浓度梯度,从dNTPs、随机引物、Taq酶、Mg2 、缓冲液Buffe,的浓度及模板DNA的质量和用量方面考察,建立了枣树RAPD技术最优体系.结果表明:20μL反应体系组分含量为10×Taq酶Buffer 2μL,Mg2 浓度2.0 mmol/L,dNTPs浓度200μmol/L,引物浓度0.2 μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度0.06 U/μL,DNA模板浓度1.5 ng/μL.最佳扩增程序为94℃预变性4 min,94℃变性30 s,36℃退火40 s,72℃延伸1min,50个循环,最后72℃延伸8 min.     

花吊丝竹ISSR-PCR反应体系的正交优化

本研究利用L16(45)正交试验设计,对影响ISSR-PCR反应体系的5个影响因素(Mg~(2+)浓度,d NTPs浓度,Taq DNA聚合酶浓度,引物浓度及模板DNA含量)进行优化。并在50~60℃范围内摸索引物UBC845的最适退火温度,并建立了花吊丝竹的最佳ISSR-PCR反应体系:2.5 mmol/L Mg~(2+),0.25 mmol/L d NTPs,1.50 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,80 ng模板DNA,2μL 10x Buffer,9.5μL dd H2O,ISSR-PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s;52.7℃退火30 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。利用优化的反应体系从100条引物中筛选出16条多态性较好的引物,该体系的建立有助于花吊丝竹种质资源遗传多样性分析和指纹图谱的构建。     

金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以金银花叶片基因组DNA为模板,通过单因素试验,研究了退火温度、Taq DNA 聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度等6种因素对ISSR－PCR扩增的影响,建立了适合于金银花ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即在20 μL反应体系中,内含1×PCR反应缓冲液（Mg2＋free）、1.5 U Taq DNA 聚合酶、0.15 mmol·L-1 dNTPs、0.4 μmol·L-1引物、1.5 mmol·L-1 MgCl2、60 ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为49.9 ℃。扩增程序为94 ℃预变性5 min ;35个循环为94 ℃变性30 s,49.9 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。利用优化反应体系,从100条ISSR引物中筛选出10条稳定性和重复性高的引物;以这10条引物对22个金银花品种基因组DNA扩增,共扩增出108条带,其中多态性条带96条,多态性条带比率为88.9%。金银花ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。     

块根紫金牛ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交和单因素试验设计方法,研究Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对ISSR-PCR扩增效果的影响,建立块根紫金牛ISSR-PCR反应体系和扩增程序,即25 ul的体系中含Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTP0.15 mmol/L,引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,模板DNA50ng,10×Buffer 2.5μl.适宜的扩增程序是94℃预变性5 min,94℃变性30s,56.6℃退火45s,70℃延伸2.0 min;45个循环;72℃延伸7min,4℃保存.采用正交和单因素试验可快速建立ISSR-PCR反应体系.该体系稳定、可靠,可用于块根紫金牛遗传多样性分析.     

柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系的建立与优化

通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、PCR反应体积、Mg2 浓度、dNTP浓度、Taq酶用量、引物量)、电泳检测方法的系统优化,建立了柑桔SRAP-PCR和ISSR-PCR体系;以此进行大规模引物筛选,从而建立了柑桔SRAP和ISSR分子标记技术体系.SRAP-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10 mmol/L,KCl50 mmol/L,Mg2 1.2 mmol/L,dNTP 120 μmol/L,Taq酶1.5U,引物0.4μmol/L,反应程序为94℃预变性5min,35个循环(94℃ 30s,47℃ 1min,72℃ 1min),72℃延伸10min;ISSR-PCR:25μL体系,模板DNA25ng,Tris-HCl10mmol/L,KCl50mmol/L,Mg2 1.6 mmol/L,dNTP200μmol/L,Taq酶1 U,引物0.8μmol/L.筛选出稳定性好、多态性高的24对SRAP引物和13条ISSR引物.     

狭叶坡垒RAPD-PCR反应体系优化

以濒危物种狭叶坡垒硅胶干燥的叶片为材料,研究其RAPD-PCR体系优化条件.结果表明,优化的狭叶坡垒RAPD-PCR反应体系为:25μL体系中1×PCR buffer,3 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs,0.5 U/25μL Taq聚合酶,0.4μmol/L引物,5 ng/μL DNA模板;最佳扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,35℃退火1 min,72℃延伸1.5min,35个循环;72℃最后延伸7 min.     

金莲花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立金莲花ISSR-PCR最佳反应体系,本研究以内蒙古自治区境内野生金莲花为试验材料,采用L₁₆(4⁵)正交实验设计,对影响ISSR-PCR扩增结果的dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板、Mg²⁺、引物5个因素进行优化筛选,对反应程序进行优化。结果显示,每个因素都具有极显著差异,影响最大的为dNTPs,其余依次为Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物,影响最小的为Mg²⁺浓度。最佳反应体系为:DNA模板30 ng,引物0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶0.075 U/20μL,dNTPs 0.15 mmol/L,Mg²⁺1.0 mmol/L,反应总体积20μL。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52℃退火1 min,72℃延伸100 s,最后72℃延伸7 min,共38个循环,4℃保存。采用优化后的体系对金莲花不同居群进行验证,证明优化后体系扩增出明亮清晰的条带且重复性好,可用于后续金莲花遗传多样性分析。     

无核葡萄SRAP-PCR反应体系的建立和优化

以大粒无核葡萄‘皇家秋天’的基因组DNA为模板,对无核葡萄SRAP-PCR反应体系的主要成分及反应退火温度进行优化。获得的最优SRAP-PCR反应程序为94℃预变性5 min,94℃变性1 min,38℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,56℃复性1 min,72℃延伸1 min,35个循环;72℃终延伸10 min。25 μL体系中,模板DNA 40 ng,Mg2+ 1.5 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.2 μmol/L,Taq DNA聚合酶0.6 U。实验结果表明,优化后的SRAP-PCR反应体系扩增多态性高,带型清晰,稳定性好。     

毛竹ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交和单因素试验设计方法,研究Mg²⁺、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA浓度及退火温度对毛竹ISSR-PCR扩增效果的影响。毛竹ISSR-PCR反应体系为:25μL的体系中含Mg²⁺1.5 mmol/L,dNTP 0.25 mmol/L,引物1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0 U,模板DNA 30 ng,10×Buffer2.5μL。扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性45 s,54℃退火60 s,72℃延伸1.5 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。该体系稳定、可靠,可用于毛竹遗传多样性分析。     

草莓SRAP反应体系优化及引物筛选

为建立草莓SRAP-PCR适宜的反应体系,以草莓品种‘丰香’为实验材料,采用单因素实验设计,对Mg²⁺、dNTPs、Taq DNA聚合酶及引物浓度4个因素4水平进行优化,并在此基础上对模板DNA的浓度和退火温度进行优化。结果表明,草莓SRAP-PCR最佳反应体系为：20μL的反应体系中含10×PCR buffer 2μL,Mg²⁺ 2.0 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,正反向引物各为0.6μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA为100 ng。扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,54℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。利用该优化体系筛选引物,从110对SRAP引物组合中筛选出29对条带清晰丰富、多态性好的引物,证明了此优化体系稳定可靠,能够用于草莓种质资源的鉴定、分子标记辅助育种等研究。     

华北蓝盆花ISSR-PCR引物筛选及反应体系优化

本研究以内蒙古自治区境内8个自然居群野生华北蓝盆花叶片作为供试材料,进行基因组总DNA的提取检测、ISSR引物筛选和引物退火温度的筛选。针对华北蓝盆花ISSR-PCR反应中的模板DNA浓度和引物浓度2个影响因素,在4个水平上对华北蓝盆花ISSR-PCR反应体系进行优化,确定最佳反应水平,最终建立华北蓝盆花ISSR-PCR扩增的最佳反应体系。结果筛选出了8条多态性较好的华北蓝盆花ISSR引物及其退火温度,平均每条ISSR引物扩增出12.3条带,多态性条带占93.88%;华北蓝盆花ISSR-PCR反应的最佳体系为总体积20μL,DNA模板1μL,DNA模板浓度为60 ng/μL,引物0.6μL,引物浓度为0.8μmol/L,Ex Taq DNA聚合酶10μL,ddH_2O 8.4μL,扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性0.5 min,不同引物最佳退火温度下退火1 min,72℃延伸1.5 min,35个循环;循环结束后72℃继续延伸7 min;4℃保存。本研究结果为进一步研究华北蓝盆花居群遗传多样性提供科学依据。     

橡胶草及其近缘种ISSR反应体系及扩增程序的优化

本研究旨在建立和优化橡胶草及其近缘种ISSR (Inter-simple sequence repeat)反应体系和扩增程序。以橡胶草及其近缘种叶片为供试材料,采用单因素试验方法,正交试验方法 L16(44)和极差分析方法,对橡胶草ISSR-PCR反应中4个主要影响因素(dNTP浓度, DNA浓度,引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度)进行优化,并在最优反应体系的基础上进行引物和退火温度的筛选。结果表明:dNTP和DNA对PCR扩增结果有较为显著的影响,引物和Taq酶的浓度变化对扩增结果无显著影响。最后确定橡胶草及其近缘种ISSR-PCR反应体系(20.0μL)为:双蒸水14.2μL,10×Buffer (含Mg2+) 2.0μL,DNA模板50.0 ng,10 mmol/L引物1.2μL,2.5 mmol/L dNTP 1.6μL,5 U Taq DNA聚合酶0.1μL。PCR扩增程序为:94℃5 min,94℃45 s,退火1 min,72℃70 s,45个循环,72℃10 min,4℃保存。本研究为橡胶草及其近缘种的遗传多样性和交配系统等后续研究提供理论参考。     

绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适合绣球的SSR-PCR反应体系,采用正交设计L25(56)对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、d NTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5个水平上进行优化,筛选出每个因素的最佳水平,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系。结果表明,20μL的SSR-PCR反应体系中,DNA模板用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,Taq聚合酶用量为0.8 U。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72℃1 min,33个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。选用10个绣球品种对建立的SSR-PCR反应体系进行验证,结果表明该体系具有较好的稳定性和通用性。建立和优化的绣球SSR-PCR反应体系,为应用SSR分子标记技术开展绣球属植物遗传育种研究提供了理论依据和技术参考。     

橡胶草基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化

为探索适合橡胶草基因组DNA的提取方法和RAPD反应体系。采用改良CTAB法提取橡胶草叶片总DNA,得到的DNA能满足RAPD分析需要。通过单因子实验法分析DNA浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶以及Mg2+浓度对RAPD扩增结果的影响,建立了适合于橡胶草RAPD分子标记的最佳反应体系,即20 μL体系中包括：模板DNA30 ng、Taq DNA聚合酶1.75 U、dNTPs浓度0.25 mmol/L、Mg2+浓度2.0 mmol/L、引物浓度0.5 μmol/L、10×PCR Buffer 2.0 μL。RAPD扩增反应程序为：94℃预变性5 min,94℃ 30 s,37℃ 30 s,72℃ 70 s,45个循环,最后72℃延伸10 min。该反应体系具有较好的稳定性及可重复性。     

花生基因组SRAP-PCR体系的优化

【研究目的】研究花生基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系;【方法】对模板DNA、引物、dNTP mixture、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度设置不同梯度,研究各因素对PCR结果的影响;【结果】扩增程序为:94℃变性2min,1Cycle;94℃变性30s,48℃复性30s,72℃延伸1min,40Cycles;72℃延伸7min。反应体系成份为:DNA模板80ng,左右引物各200ng,dNTP mixture2.0mmol/L,Taq DNA聚合酶3U,10×Buffer8μl,总体积60μl。【结论】建立了满足花生基因组SRAP-PCR的优化扩增体系。     

毛花猕猴桃种质资源ISSR反应体系的建立和优化

以毛花猕猴桃种质资源为试验材料,通过正交实验设计对影响ISSR反应体系各个主要因素进行优化。研究结果表明,最佳ISSR-PCR反应体系为:总体积为20μL,2μL buffer(无Mg2+),1 mmol/L Mg2+,1 U Taq酶,0.25 mmol/L d NTPs,1μmol/L引物,80 ng模版DNA;扩增程序为94℃3 min;94℃30 s,50℃~60℃退火45 s,72℃1 min(40个循环);72℃7 min,12℃保存;引物UBC842的最佳退火温度为58℃。利用该体系,用引物UBC835对46份野生毛花猕猴种质资源进行扩增,扩增结果表明建立的ISSR-PCR反应体系重复性好,稳定性强。