人γ干扰素的高效表达

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含hIFN-γ基因的重组质粒,SDS-PAGE检测不同条件下hIFN-γ基因的表达情况,用Western blot和亲和层析对表达产物进行鉴定和纯化,并对表达条件进行优化。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实重组质粒pET32a（＋）-hIFN-γ含有hIFN-γ基因且阅读框架正确,以IPTG诱导hIFN-γ基因表达的优化条件是：培养基pH7.0,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时hIFN-γ蛋白表达量为52%。从而实现了hIFN-γ基因的高效表达并优化了其表达工艺。从而为hIFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

重组人γ-干扰素表达菌株的构建及纯化

从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出hIFN-γ基因。构建了重组表达菌株BL21（DE3）（pET32a（＋）-hIFN-γ）。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pET32a（＋）-hIFN-γ含有hIFN-γ基因,且基因序列和阅读框架正确。经W estern blot鉴定证实为hIFN-γ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。表达产物占菌体总蛋白的52%。同时对其抗病毒活性进行了测定,从而为hIFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

重组人γ-干扰素表达菌株的构建

从健康人外周血分离单核细胞,并提取总RNA,利用RT-PCR扩增出hIFN-γ基因.构建了重组表达菌株BL21(DE3)(pET32a(+)-hIFN-γ).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pET32a(+)-hIFN-γ含有hIFN-γ基因,且基因序列和阅读框架正确.经Western blot鉴定证实为hIFN-γ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达.表达产物占菌体总蛋白的52%.同时对其抗病毒活性进行了测定,从而为hlFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据.     

利用家蚕杆状病毒表达系统表达人γ干扰素及产物的抗病毒活性检测

干扰素-γ(IFN-γ)是免疫反应中重要的免疫调节因子,对多种免疫细胞具有激活作用.利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达具有活性的人γ干扰素(hIFN-γ),首先根据家蚕密码子偏好性对hIFN-γ的编码基因进行优化合成,将优化合成后的序列克隆到杆状病毒转移载体pBR中,然后与orf1629基因缺失的失活拯救型杆状病毒BmBacmid共转染BmN细胞,获得重组病毒reBmBac-hIFN-γ,最后利用获得的重组病毒感染家蚕并收获表达产物.采用微量细胞病变抑制法,在Vero/VSV-GFP系统中检测到重组hIFN-γ 的效价达到(3.69±2.02)×106 IU/mL.此外,重组hIFN-γ可以抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖.上述结果为利用家蚕生物反应器高效生产具有活性的人γ干扰素奠定了试验基础.     

重组牛IFN-γ蛋白单克隆抗体的制备

本研究以纯化原核表达重组蛋白rBovIFN-γ-PET28a-His为免疫原,以重组蛋白为筛选抗原,通过杂交瘤细胞技术,研制出5株稳定分泌rBovIFN-γ单克隆抗体的细胞株,命名为1C11、6E2、7F7、9F5、10C8;腹水效价分别为1∶12 800、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶12 800。5株单抗中:1C11、7F7、9F5、10C8只与rBovIFN-γ-PET28a-His反应,而不与IFN-α、IFN-β、IL-4、白介素2、鸡IFN-γ等其他细胞因子发生交叉反应;6E2除了与rBovIFN-γ-PET28a-His反应外,还与鸡IFN-γ发生交叉反应。Western blot分析表明,4株单抗均能特异性识别并结合rBovIFN-γ,纯化后的5株单抗的腹水效价分别为1∶6 400、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶6 400;同时,本研究制备的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗效价达1∶25 600。     

藏獒犬IFNγ基因的克隆表达及其生物学活性测定

通过RT-PCR技术从刺激的藏獒犬外周血淋巴细胞中成功克隆IFNγ全基因,其大小为501bp,编码167个氨基酸,前23个AA为信号肽,与GenBank上发表的犬IFNγ((NM001003174.1)比较,序列的同源性为99.4%。构建了原核表达载体pET-30a-IFNγ,转化BL2L,IPTG诱导后表达约23Kd的重组蛋白,经镍琼脂糖凝胶层析柱纯化后,纯度达90%以上;利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬γ干扰素的生物学活性,结果显示纯化的蛋白具有一定的抗病毒活性,本研究结果为进一步研究犬γ干扰素的抗病毒活性奠定基础。     

重组牛γ-干扰素单克隆抗体的研制

为制备针对重组牛γ-干扰素(rBoIFN-γ)的单克隆抗体(mAb),以纯化的原核表达融合蛋白rHis-BOIFN-γ为免疫原,用纯化的rGST-BoIFN-γ为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,研制抗rBoIFN-γ的mAb.结果获得13株稳定分泌抗BoIFN-γ mAb的细胞株,命名为1C12、1F7、1G5、3E6、4D5、5E11、5G4、6F8、6G6、7E9、8D3、8F8和9G11.腹水的效价除单抗9G11外,其余效价都在1:80000以上;除5G4 mAb亚类为IgG2b外,其余均为IgG1.Dot-ELISA结果表明,所得单抗只与融合蛋白rHis-BoIFN-γ和rGST-BoIFN-γ反应,而不与其它重组细胞因子和对照细菌反应,显示其良好的特异性.Western blot显示所获单抗能与相应的融合蛋白发生反应,出现特异性务带.同时所获单抗均能与牛IFN-γ标准品反应.13株单抗均为针对rBoIFN-γ的特异性mAb,为进一步研究rBoIFN-γmAb在牛的免疫调控、牛疫病的致病机制及其诊断中的应用奠定基础.     

一株新城疫重组强毒的分离鉴定与分子特性分析

从患病蛋鸡中分离出1株新城疫病毒(NDV)SRZ/03,经蚀斑纯化后接种40日龄SPF鸡可诱发典型ND病变。蚀斑纯化前、后,MDT分别为55.2和51 h,ICPI为1.7和2.0,IVPI为1.91和2.79,表明属强毒。对其F和HN基因分别克隆测序,进行F基因分型。结果表明SRZ/03属基因Ⅱ型,F蛋白氨基酸裂解位点的序列为112R-R-Q-K-R-F117,与强毒基序完全相同。结合GenBank中发表的其他NDV参考株序列,对F和HN基因推导氨基酸序列进行比较。SRZ/03株与基因Ⅱ型LaSota/46、B1/47、Bingham/87和Texas/48的同源性分别为93.1%、93.0%、94.4%和94.4%;与基因Ⅶ型Taiwan/95、SGM/01和SKY/03的同源性分别为92.2%、92.8%和92.8%;与基因Ⅲ型F48E9/48的同源性为91.2%。然而,SRZ/03株F蛋白前210个氨基酸与基因Ⅱ型LaSota/46和Texas/48的同源性较高,达96.7%和98.1%,后343个氨基酸则与Taiwan/95、SGM/01等毒株的同源性较高,达95.7%~97.4%,推测该株为重组株。此外,SRZ/03株与Taiwan/95、SGM/01等毒株的HN氨基酸同源性高达95.8%~97.6%,显著高于与LaSota/46、B1/47、Bingham/87、Texas/48和F48E9/48的87.2%~89.2%。     

水貂细小病毒单克隆抗体的制备及纯化方法的优化

为了制备并筛选出效价及特异性都较高的水貂细小病毒单克隆抗体,建立一种高纯度、高回收率的水貂细小病毒单克隆抗体的纯化方法,试验将获得的3株稳定分泌水貂细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为G2a-C9、M-C1、M-A5,通过HI、ELISA、Western-blot、间接免疫荧光等方法对这3株单克隆抗体进行生物学特性鉴定,再分别采用辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A亲和层析两种方法对其纯化,并对Protein A亲和层析法进行了优化。结果表明:经生物学特性鉴定后筛选到1株效价与生物学活性都较高的Ig G2a类单克隆抗体G2a-C9,经Protein A亲和层析方法纯化后抗体纯度为90%,回收率为58%;辛酸-硫酸铵沉淀后的抗体纯度仅为80%,回收率为45%。纯化方法优化后,抗体纯度为95%,回收率为65%。说明制备的G2a-C9水貂细胞病毒单克隆抗体可用于后续产品的研发;经试验验证低温无水乙醇沉淀-Protein A亲和层析可用于Ig G2a类抗体纯化。     

新型抗菌肽菌丝霉素纯化工艺研究

为了研究大规模纯化菌丝霉素重组蛋白的方法,本实验以G25-CM离子交换柱和疏水-CM离子交换柱作为两种纯化路线,通过SDS-PAGE蛋白电泳、琼脂孔穴扩散法、质谱与高校液相色谱方法分析。结果表明,G25-CM离子交换柱与疏水-CM离子交换柱方法都能达到较好的纯化效果,其中,G25-CM离子交换柱纯化方法获得蛋白纯度高达94.01%,回收率达到55.21%,疏水-CM离子交换柱纯化方法获得蛋白纯度达到90.01%,回收率达到23.34%。以前一种方法为优。本研究为大规模获得高纯度菌丝霉素重组蛋白提供参考。     

重组鸭γ-干扰素的表达与抗病毒活性分析

为表达重组鸭γ-干扰素(DuIFNγ),并鉴定其在体内、体外抗病毒活性,本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中登录的DuIFNγ序列进行优化并合成,将其克隆至p ET30a-ELP表达载体中进行重组蛋白诱导表达,并利用类弹性蛋白多肽(ELP)的可逆相变循环特性进行纯化,结果显示,重组蛋白(rELP-DuIFNγ)正确表达,纯化后的rELP-DuIFNγ纯度达90%以上。通过细胞病变抑制法,在VSV/MDCK系统和VSV/DEF系统中检测rELP-DuIFNγ体外抗病毒活性,结果显示,rELP-DuIFNγ在VSV/MDCK系统和VSV/DEF系统中的抗病毒活性分别为为4.17×10~4U/mg和4.54×10~5U/mg。利用雏鸭感染DHAV-1,同时灌服rELP-DuIFNγ,观察并计算雏鸭发病时间与存活率,初步研究rELP-DuIFNγ的体内抗病毒作用,结果显示r ELP-DuIFNγ在体内可以延缓雏鸭发病时间、降低其发病率。以上结果表明,rELP-DuIFNγ在大肠杆菌中可高效表达,在体内外均具有一定的抗病毒活性。本研究为基因工程DuIFNγ制剂的研制及临床应用奠定了基础。     

大孔吸附树脂纯化蜂胶总黄酮的工艺研究

[目的]研究大孔树脂纯化蜂胶总黄酮的最佳工艺。[方法]以比吸附量、解析率及总黄酮回收率为指标,通过考察静态吸附及解吸附试验,筛选最佳大孔吸附树脂。并考察该最佳大孔吸附树脂的动态吸附及解吸附条件,包括原液质量浓度、吸附流量、吸附时间、洗脱剂及洗脱剂流量,从而筛选出该大孔吸附树脂分离纯化蜂胶总黄酮的最佳工艺条件。[结果]FL—1大孔树脂为四种树脂中吸附及解吸附性能最佳,因此选择FL-1为分离纯化蜂胶总黄酮的最佳树脂,其最佳工艺参数为:动态吸附质量浓度0.25～0.38mg/mL,吸附速度1mL/min;树脂柱吸附时间1h,洗脱剂为90%乙醇,洗脱流量为1mL/min。蜂胶总黄酮质量分数从13.07%提高到85.25%,总黄酮回收率达79.37%。[结论]FL-1型大孔树脂对蜂胶总黄酮具有良好的纯化效果,优选工艺合理、稳定、可行。     

高速逆流色谱分离制备那西肽

那西肽为动物专用抗生素。以那西肽菌丝体为原料,采用四氢呋喃为提取溶剂,用中性氧化铝进行初步纯化,以乙酸乙酯、甲醇、石油醚和水为两相系统,进行高速逆流色谱纯化,得到含量不低于95%的那西肽产品,总回收率为86%。方法操作简单,回收率高,为那西肽的进一步研究开发打下基础。     

马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)_2的制备及免疫防护效果评价

采用鸡胚成纤维原代细胞培养痘苗病毒天坛株抗原,甲醛灭活后,利用密度梯度离心法和层析法两步纯化抗原,加入等量ISA206佐剂充分乳化,免疫健康马匹,当中和抗体效价达1∶3 200时,采血,分离血清,按照免疫球蛋白F(ab′)_2生产工艺制备治疗性抗体成品,并对其进行中和抗体效价、防护效力、安全性检测。结果显示,鸡胚成纤维原代细胞培养痘苗病毒天坛株滴度均在1.0×10~7 PFU/mL以上;纯化的抗原纯度在90%以上;纯化的F(ab′)_2成品,纯度在90%以上,中和抗体效价超过1∶3 200,有很好的免疫防护效力,安全性符合现行《中国药典》要求。结果表明,建立了马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)_2制品生产工艺,制备的成品符合现行《中国药典》要求,为天花治疗提供了新的救命药。     

猪瘟病毒E2重组蛋白纯化和复性条件的研究

对猪瘟病毒(CSFV)C株、LT株E2基因主要抗原区在pGEX系列表达载体中原核表达的融合蛋白进行了变性、复性和纯化回收试验。用建立的变性、复性和纯化方法，获得了可溶性的纯化蛋白E2，其纯度达70％，回收率为10％。对复性纯化的E2蛋白进行了免疫活性检测，结果表明，其比未纯化蛋白的免疫活性高20倍左右。     

绿豆芽中SOD的分离纯化研究

采用硫酸铵盐析,透析,抽真空,DEAE-纤维素A-52柱层析,从绿豆芽中提纯了超氧化物歧化酶,酶的纯化程度达到每毫克蛋白2 855U,总酶活回收率为38.4%,纯化倍数为27.5.     

H9N2亚型禽流感病毒纯化及病毒HA蛋白定量方法研究

为实现H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)疫苗上下游过程的控制,本研究结合蔗糖密度梯度离心和SDS-PAGE灰度分析建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法。首先将收获的病毒原液经差速离心、PEG6000沉淀和蔗糖密度梯度离心分别进行澄清、浓缩和分离纯化;其次,采用改装过的高效液相色谱仪系统(HPLC)准确定位和收集病毒离心区带,并对该区带进行SDS-PAGE和Western blotting分析,同时考察该收集方式的线性和重复性;然后,在此基础上优化病毒液的澄清工艺以提高病毒回收率;最后,观察还原SDS-PAGE分离的H9N2亚型AIV蛋白条带的共迁移情况并确定糖苷酶PNGase F脱糖基处理的最佳条件,采用Image J软件分析SDS-PAGE图谱中4个主要病毒蛋白条带(NP、HA1、M1和HA2)的灰度以确定流感病毒血凝素的含量。结果表明,HPLC收集的病毒离心区带的蛋白浓度与PEG6000浓缩的上清体积在8～32 mL范围内具有良好的线性关系(R~2=0.994),且该收集方式重复性好,批内和批间变异系数分别为1.29%和4.11%。病毒液经过澄清、浓缩和分离纯化后,最终的病毒回收率为79.55%。纯化的H9N2亚型AIV的蛋白浓度为1 000μg/mL时,经糖苷酶PNGase F脱糖基处理后便能得到条带清晰平整且分离良好的SDS-PAGE图谱。经灰度分析,HA含量占总病毒蛋白含量的46.18%。本研究初步建立了H9N2亚型AIV纯化和病毒HA蛋白定量的方法,为H9N2亚型AIV全病毒灭活疫苗的研发和生产提供了简单、准确的检测手段。     

高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及鉴定

从达乡传统发酵乳制品中分离纯化出13株疑似乳酸菌,其中5株球菌、8株杆菌,利用高效液相色谱法检测13株疑似乳酸菌合成γ-氨基丁酸能力,结果发现其中一株球菌具有很强合成γ-氨基丁酸能力,γ-氨基丁酸产量为2.91g/L;通过形态学和分子生物学鉴定,该高产γ-氨基丁酸菌株为嗜热链球菌QYWLYS-1。此外,考察了实验室保藏的4株双歧杆菌和7株乳酸菌合成γ-氨基丁酸能力,结果发现其中一株植物乳杆菌QYW-L-11具有较强合成γ-氨基丁酸能力,γ-氨基丁酸产量为1.38g/L。     

血红蛋白纯化中不同微滤系统的比较

为了筛选出一种适用于规模化生产高纯度血红蛋白的微滤设备,本实验采用自制血红蛋白,经过三种不同的微滤设备进行纯化,比较纯化后血红蛋白的纯度,以及不同微滤系统的回收率、耐压性和工作效率。结果表明:卷膜微滤系统纯化的血红蛋白纯度为99.98%,高于中空纤维微滤系统和颇尔微滤系统。并且卷膜微滤系统的耐压性最好,最大耐受压为5 bar,工作效率最高为可达3.8 L/min,回收率90.3%,可以有效节约生产成本。     

猪γ干扰素的体外表达及其多克隆抗血清的制备

从健康仔猪前腔静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,用猪γ干扰素(IFN-γ)基因特异性引物通过RT-PCR扩增猪IFN-γ的全长cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中,再亚克隆到pUC18和表达载体pET-30a中,经测序发现其序列与GenBank报道的IFN-γ基因序列基本一致.将重组质粒pET-30a-IFN-γ转化大肠杆菌BL21,于37℃经IPTG诱导表达,IFN-γ基因获得表达,表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39%.经SDS-PAGE及Westernblot分析表明,表达的融合蛋白分子量约为25 ku.将包涵体用8 mol/L脲变性,用ProBondTM Purification Systerm纯化,经透析复性,得到纯化的目的蛋白,含量可达0.3 mg/mL.将复性蛋白免疫新西兰白兔三次,制备了高滴度的猪IFN-γ抗血清.本实验表达和纯化了猪IFN-γ,并制备兔抗猪IFN-γ的抗血清,为下一阶段关于猪γ干扰素重组蛋白其应用奠定了基础.