不同病原性相关分子模式对大黄鱼头肾巨噬细胞免疫功能的影响

为研究不同病原性相关分子模式（PAMP）对大黄鱼头肾巨噬细胞免疫功能的影响,本研究分别将脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、肽聚糖（peptidoglycan,PGN）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid,LTA）、胞壁酰二肽（muramyl dipeptide,MDP）与提取的大黄鱼头肾巨噬细胞进行孵育,测定大黄鱼头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、溶菌酶（LZM）活性和免疫相关细胞炎症因子（TNFα,IL1β,IL8,IL10,CXCL9,MYD88,TLR3和TLR8）的表达情况。结果显示:（1）LPS,PGN,LTA,MDP均能显著提高大黄鱼头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性和LZM活性,同时显著降低SOD和CAT两种抗氧化酶的活性;（2）在LPS和LTA刺激下,8种免疫相关细胞炎症因子TNFα,IL1β,IL8,IL10,CXCL9,MYD88,TLR3和TLR8均呈显著性上调趋势;在PGN和MDP刺激下,除IL8,CXCL9外,其余6种免疫相关细胞炎症因子均显著性上调。结果表明,4种病原相关分子模式LPS,PGN,LTA,MDP均能显著影响大黄鱼头肾巨噬细胞的非特异性免疫应答能力和免疫相关细胞炎症因子的表达。     

家蚕整合素β2的表达、纯化及其免疫功能

【目的】 分析家蚕（Bombyx mori）整合素β2的序列和结构特征及其在家蚕感染病原菌后血细胞中的表达变化,检测其重组蛋白对不同病原相关模式分子识别和病原菌的凝聚作用,为进一步探究家蚕整合素β2的蛋白功能打下基础。【方法】 利用生物信息学对整合素β2的序列和结构特征进行分析,利用实时荧光定量PCR检测家蚕分别注射大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）后整合素β2在血细胞中的表达变化。通过PCR技术扩增获得整合素β2完整的胞外域片段,构建至pET22b原核表达载体后转化至E.coli Rosetta(DE3)表达菌株。经IPTG诱导获得重组蛋白,利用Ni-NTA亲和层析得到纯化的体外重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western blot对纯化获得的体外重组蛋白的纯度和质量进行检测。利用ELISA检测重组蛋白与两种不同病原相关分子模式LPS和PGN的结合情况,运用Western blot检测重组蛋白与不同病原微生物的结合情况,通过凝集试验检测重组蛋白对金黄色葡萄球菌的凝集能力,最后在个体水平探索重组蛋白在体内细菌清理中的作用。【结果】 家蚕整合素β2具有典型的β整合素亚基保守结构特征,即由一个较长的胞外域、一个单次跨膜结构域和一个较短的胞内域构成。家蚕整合素β2具有金属离子结合位点MIDAS、EGF结构域、半胱氨酸重复基序和NPxY等整合素典型的结构特征。实时荧光定量PCR检测结果表明家蚕在受到细菌感染后,整合素β2的表达发生显著变化。通过原核表达和蛋白纯化获得纯度较高的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明纯化的重组蛋白纯度较高,可以用于后续试验。ELISA试验表明重组蛋白对LPS和PGN等病原相关分子模式具有较强的结合能力。细菌结合试验结果显示重组蛋白能够结合多种细菌,但与革兰氏阳性菌的结合能力要高于革兰氏阴性菌。细菌凝聚试验结果显示重组蛋白在Ca ²⁺的存在下对金黄色葡萄球菌具有较强的凝聚作用。细菌清除试验证实重组蛋白可以有效促进机体对外源入侵细菌的清理作用。【结果】 整合素β2具有典型的整合素β亚基的结构特征,可能具有识别病原相关分子模式,如LPS和PGN等的能力,通过与细菌的直接结合而实现对入侵病原微生物的凝聚作用,从而增强有机体的免疫能力,推测在家蚕免疫反应中发挥重要作用。     

液基薄层细胞学检测技术在肺癌诊断中的作用

目的 探讨液基薄层细胞学检测(TCT)技术在肺癌诊断中的应用价值。方法 收集400例肺癌患者和200例非肺癌患者的痰液、胸腔积液、支气管肺泡灌洗液及支气管刷片共600例,同时进行TCT和传统涂片法(CS)检测,比较两种方法的敏感度和特异度。结果 TCT检测的敏感度为73.0%,特异度为97.5%,CS法检测的敏感度为29.0%,特异度为99.5%,TCT检测的敏感度高于CS法(P<0.05)。TCT法在涂片质量、判断癌细胞形态学方面均较CS法好。TCT分类诊断和病理组织学诊断的总符合率为86.6％。TCT分类诊断和细胞蜡块结合免疫细胞化学诊断的总符合率为89.0％。结论 TCT检测法能明显提高肺癌细胞的阳性检出率,值得推广应用。     

Structure of tracheal cytotoxin in complex with a heterodimeric pattern-recognition receptor

Tracheal cytotoxin (TCT), a naturally occurring fragment of Gram-negative peptidoglycan, is a potent elicitor of innate immune responses in Drosophila. It induces the heterodimerization of its recognition receptors, the peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) LCa and LCx, which activates the immune deficiency pathway. The crystal structure at 2.1 angstrom resolution of TCT in complex with the ectodomains of PGRP-LCa and PGRP-LCx shows that TCT is bound to and presented by the LCx ectodomain for recognition by the LCa ectodomain; the latter lacks a canonical peptidoglycan-docking groove conserved in other PGRPs. The interface, revealed in atomic detail, between TCT and the receptor complex highlights the importance of the anhydro-containing disaccharide in bridging the two ectodomains together and the critical role of diaminopimelic acid as the specificity determinant for PGRP interaction.     

Structure and function of lipopolysaccharide binding protein

The primary structure of lipopolysaccharide binding protein (LBP), a trace plasma protein that binds to the lipid A moiety of bacterial lipopolysaccharides (LPSs), was deduced by sequencing cloned complementary DNA. LBP shares sequence identity with another LPS binding protein found in granulocytes, bactericidal/permeability-increasing protein, and with cholesterol ester transport protein of the plasma. LBP may control the response to LPS under physiologic conditions by forming high-affinity complexes with LPS that bind to monocytes and macrophages, which then secrete tumor necrosis factor. The identification of this pathway for LPS-induced monocyte stimulation may aid in the development of treatments for diseases in which Gram-negative sepsis or endotoxemia are involved.     

The vaccine adjuvant monophosphoryl lipid A as a TRIF-biased agonist of TLR4

The inflammatory toxicity of lipopolysaccharide (LPS), a component of bacterial cell walls, is driven by the adaptor proteins myeloid differentiation factor 88 (MyD88) and Toll-interleukin 1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-beta (TRIF), which together mediate signaling by the endotoxin receptor Toll-like receptor 4 (TLR4). Monophosphoryl lipid A (MPLA) is a low-toxicity derivative of LPS with useful immunostimulatory properties, which is nearing regulatory approval for use as a human vaccine adjuvant. We report here that, in mice, the low toxicity of MPLA's adjuvant function is associated with a bias toward TRIF signaling, which we suggest is likely caused by the active suppression, rather than passive loss, of proinflammatory activity of this LPS derivative. This finding may have important implications for the development of future vaccine adjuvants.     

Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS

Shigella, the leading cause of bacillary dysentery, uses a type III secretion system (TTSS) to inject proteins into human cells, leading to bacterial invasion and a vigorous inflammatory response. The bacterium is protected against the response by the O antigen of lipopolysaccharide (LPS) on its surface. We show that bacteriophage-encoded glucosylation of Shigella O antigen, the basis of different serotypes, shortens the LPS molecule by around half. This enhances TTSS function without compromising the protective properties of the LPS. Thus, LPS glucosylation promotes bacterial invasion and evasion of innate immunity, which may have contributed to the emergence of serotype diversity in Shigella.     

草鱼脂多糖结合蛋白的分离纯化(英文)

脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding proteins ,LBP)是机体对革兰氏阴性菌感染产生的可溶性急性期蛋白,结合并提呈LPS给细胞表面的模式识别受体,激发免疫反应。在本试验中,用低浓度嗜水气单胞菌( Aeromonas hydrophila)感染草鱼(Ctenopharyngodon idellus)24 h后,抽取全血,离心,获得血浆。结合LBP活性检测,经硫酸铵沉淀、CMSephadex C-50阳离子交换层析和DEAE Sephadex A-25阴离子交换层析后,分离纯化得到LBP。该蛋白对异硫氰酸荧光素标记的脂多糖(Fluorescein isothiocyanate labeled li-popolysaccharide ,FITC-LPS)有较强的结合能力。在SDS-PAGE电泳后,考马斯亮蓝染色可见3条明显的带,分子量大约为68、53和48 kDa。同时探索一条简便分离纯化脂多糖结合蛋白的方法,为进一步研究LBP的功能奠定了基础。     

浸泡接种疫苗对翘嘴鳜细菌性烂鳃病的免疫效果

用酚灭活的柱状嗜纤维菌（Ｐ－ＣＣ）疫苗，菌体脂多糖（ＬＰＳ）以及将Ｐ－ＣＣ和ＬＰＳ混合后作为抗原，分别浸泡翘嘴鳜使免疫，并检测了受免鱼体的免疫保护力。结果表明，经３次疫苗浸泡接种后的鱼体血清中凝集抗体效价与对照组鱼没有显著差异（Ｐ〉０．０５）；而经活菌攻毒后的存活率，则是免疫组显著地高于对照组（Ｐ〈０．０５），以ＬＰＳ免疫组的免疫保护力（７１．９％）最强。     

不同盐度条件下秋茄根系单宁含量动态变化

对不同盐度(0‰-40‰)栽培下秋茄根的总酚、可溶性缩合单宁、结合缩合单宁、总缩合单宁的含量进行测定,探讨盐度对单宁生产的效应.结果表明:(1)不同盐度下栽培60-135d,总酚含量在相同盐度条件下随栽培时间的延长呈现出先波动而后升高的趋势,其中总酚最高含量出现在高盐度,说明一定的高盐度胁迫可以促进总酚的合成;总缩合单宁与可溶性缩合单宁含量变化趋势相似,其中可溶性缩合单宁含量显著高于结合缩合单宁.(2)在15‰盐度下栽培75-135d,秋茄根不同部位的总酚、可溶性缩合单宁、结合缩合单宁和总缩合单宁含量有相似的变化趋势,即由根尖往远离根尖的部位呈下降趋势.     

内毒素对山羊乳腺组织中与乳腺炎相关的酶和细胞因子的影响

8只泌乳期的健康睢宁白山羊,产后72 h分别用内毒素和灭菌生理盐水经乳头管灌注左右侧乳房.灌注前及灌注后0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、24 h观察山羊整体及乳房局部变化.灌注24 h后,处死动物,取乳腺组织,部分用Bou in氏液固定,部分用液氮保存.临床症状及病理切片观察均显示,山羊表现典型的急性乳腺炎症状.检测两侧乳腺组织中部分与乳腺炎症相关因子的含量及其基因表达水平的结果表明:与灌注生理盐水对照相比,灌注内毒素侧乳腺组织中N-乙酰-β-D氨-基葡萄糖苷酶(NAGase)、髓过氧化物酶(MPO)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的活性及IL-1β、IL-6的含量极显著升高(P<0.01),TNFα-含量显著升高(P<0.05);相同条件下对2种处理组织样中3种细胞因子mRNA表达水平进行PCR扩增,灌注内毒素侧能检到明显的目的条带,对照侧未见明显的目的条带.     

翘嘴鳜细菌性败血症的免疫预防研究

从患细菌性败血症的翘嘴鳜分离嗜水气单胞菌ＢＳ－１菌株，制成福尔马林灭活疫苗（Ｆ－ＡＨ）、酚灭活疫苗（Ｐ－ＡＨ）和提取菌体脂多糖（ＬＰＳ）作为免疫原。注射接种体重为３５．５±５．６ｇ的翘嘴鳜后，通过检测血清中的凝集抗体效价、血液和头肾中吞噬细胞的吞噬活性以及应用活菌攻毒等方法，比较了３种不同免疫原的免疫效果。结果表明，ＬＰＳ的免疫效果最好，Ｐ－ＡＨ次之，Ｆ－ＡＨ较差。用活菌攻毒后，３种受免鱼体的免疫保护力分别为９２．２％，８４．７％和８０．７％。     

气管滴注大肠杆菌对肉仔鸡肝脏抗氧化能力的影响

为研究呼吸道大肠杆菌对肉仔鸡肝脏抗氧化能力的影响,选取24只初始体质量相近、健康状况良好的固始肉仔鸡,随机分为2组,对照组肉仔鸡气管滴注1 m L无菌培养液,大肠杆菌组肉仔鸡气管滴注1 m L大肠杆菌培养液(1×10~9cfu/m L)。滴注后2 h采集血液和肝脏组织,测定血清中细菌脂多糖(LPS)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量,以及肝脏组织中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果表明,气管滴注大肠杆菌后2 h,大肠杆菌组肉仔鸡血清中LPS含量为33.86 U/mg,较对照组升高了26.15%;AST和ALT含量较对照组分别增加了50.89%(P0.05)和298.77%(P0.01);大肠杆菌组肉仔鸡肝脏组织中SOD活性和GSH-PX活性分别为186.60 U/mg和13.20 U/mg,较对照组分别降低了43.83%(P0.01)和31.18%(P0.05);MDA含量增加了51.72%(P0.05)。综上,气管滴注大肠杆菌后2 h,大肠杆菌大量繁殖,释放出的LPS通过血液循环进入肝脏,肝脏中抗氧化酶活性降低,引起脂质过氧化物堆积,破坏肝脏细胞,导致血清中转氨酶水平升高。     

The succession of fecal bacterial community and its correlation with the changes of serum immune indicators in lambs from birth to 4 months

Early bacterial colonization and succession within the gastrointestinal tract have been suggested to be crucial in the development of host immunity. In this study, we have investigated the changes in live weight and concentrations of selected serum parameters in relation to their fecal bacterial communities as determined by high throughput sequencing of the 16S rRNA gene over the same period in lambs. The results showed that lambs’ growth performance, the serum parameters, fecal bacterial community and fecal bacterial functions were all affected (P<0.05) by age of the lambs. Similarity within age groups of fecal microbiota was lower in the preweaning period and increased sharply (P<0.05) after weaning at 60 days. The similarity between the samples collected from birth to 90 days of age and those collected at 120 days of age, increased (P<0.05) sharply after 30 days of age. Some age-associated changes in microbial genera were correlated with the changes in concentrations of immune indicators, including negative (P<0.05) correlations between the relative abundance of Lachnospiraceae UCG-010, Eubacterium coprostanoligenes group, Ruminococcaceae UCG-005, Ruminococcaceae UCG-009, Ruminococcaceae UCG-013, Ruminiclostridium 6, Ruminococcaceae UCG-008, and Oscillibacter with serum concentrations of lipopolysaccharide (LPS), D-lactate dehydrogenase (DLA), immunoglobulin (IgA, IgM, and IgG), and cytokines (interleukin-1β (IL-1β), IL-6, IL-12, and IL-17), tumor necrosis factor-α (TNF-α), and the relative abundance of these genera increased from 45 days of age. In conclusion, these results suggested that the age-related abundances of particular genera were correlated with serum markers of immunity in lambs, and there might be a critical window in the period from birth to 45 days of age which provide an opportunity for potential manipulation of the fecal microbial ecosystems to enhance immune function.     

不同棕榈植物单宁含量的季节性变化(英文)

探讨了3种棕榈植物的总酚、可溶性单宁、结合态单宁和总缩合单宁含量的季节性变化规律。研究结果表明:布迪椰子的总酚、可溶性单宁和总缩合单宁含量在4个季节中几乎没有变化;沼地棕和油棕的总酚含量在冬季显著提高;布迪椰子和沼地棕的结合态单宁在冬季明显下降,而油棕不然;布迪椰子总缩合单宁含量与总酚含量的变化趋势相似,沼地棕和油棕的总缩合单宁含量与总酚含量的变化趋势不同。     

蜂胶提取物对脂多糖诱导小鼠急性乳腺炎及乳腺屏障功能的保护作用

【背景】奶牛乳腺炎是一种常见、多发的奶牛疾病,不仅危害奶牛健康,同时也造成重大经济损失。传统治疗奶牛乳腺炎的药物主要是抗生素,极易造成抗生素耐药与滥用。开发替代抗生素的方法用于奶牛乳腺炎的防治具有现实意义。蜂胶是西方蜜蜂采集植物树脂,混合自身上颚腺、蜡腺的分泌物形成的具有良好抗炎、抗菌活性的天然产物,对防治奶牛乳腺炎具有潜在开发利用价值。尽管近年来国内外有一些有关蜂胶防治乳腺炎方面的报道,但蜂胶如何影响乳血屏障功能,目前国内外尚无相关研究报道。【目的】利用细菌脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）诱导的小鼠急性乳腺炎模型,评估中国蜂胶乙醇提取物对小鼠急性乳腺炎的保护作用及其对乳腺细胞紧密连接蛋白表达的影响,为后续利用蜂胶防治奶牛乳腺炎的深入研究奠定理论基础。【方法】采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UHPLC-QqQ-MS/MS）对中国蜂胶乙醇提取物中主要的多酚类化合物进行种类和含量测定。试验分为空白对照组、LPS模型组、中国蜂胶提取物试验组以及地塞米松阳性对照组。ICR雌性小鼠连续灌胃中国蜂胶提取物或阳性对照药物7d后,模型组、试验组和阳性对照组经第四、五对乳头管注射1 mg·kg^-1体重 LPS,建立小鼠急性乳腺炎模型,24 h后处死,收集乳腺组织样本。以苏木精-伊红（H.E）染色法、天狼星红染色法评估小鼠乳腺组织病理变化;利用酶联免疫吸附法（ELISA）测定炎症因子释放量;利用荧光定量PCR测定小鼠乳腺组织中紧密连接蛋白（Occludin、Cluadin-1、ZO-1） mRNA的表达情况;最后利用免疫组化技术研究小鼠乳腺紧密连接蛋白（Occludin和ZO-1）表达和分布情况,利用以上指标综合评判中国蜂胶乙醇提取物的抗乳腺炎活性及其对乳腺紧密连接蛋白的影响。【结果】基于UHPLC-QqQ-MS/MS,建立了中国蜂胶乙醇提取物中主要的17种多酚类化合物的精确定量方法,检测结果表明含量最高的5种化合物及其含量分别为：高良姜素（12.88±0.57 μg·mg^-1）、短叶松素3-乙酸酯（12.93±0.59 μg·mg^-1）、松属素（8.56±0.27 μg·mg^-1）和短叶松素（8.52±0.25 μg·mg^-1）。动物试验结果表明,灌胃中国蜂胶提取物能够显著缓解LPS注射导致的乳腺组织中炎性细胞浸润、缓解乳腺腺泡结构损伤;同LPS组相比,中国蜂胶提取物灌胃处理可有效抑制LPS导致的小鼠乳腺组织中炎症因子（IL-1β,IL-6和IL-10）的释放,并可提高小鼠乳腺中紧密连接蛋白的mRNA表达,缓解LPS注射所导致的乳腺上皮细胞紧密连接的破坏。【结论】中国蜂胶提取物对脂多糖诱导小鼠乳腺炎具有良好的预防效果,并可有效促进乳腺紧密连接蛋白的表达,维持乳腺中紧密连接结构完整性,保护血乳屏障,但蜂胶对紧密连接影响调控的分子机理还需进一步深入研究。     

Real-time PCR分析免疫应激对肉鸡各肠段微生物区系的影响

【目的】应用细菌的16S rRNA 序列设计双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属( Lactobacillus) 、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和肠球菌属( Enterococcus) 的引物并对肉鸡肠道的这4类细菌菌属进行定量测定,检测免疫应激对肉鸡不同肠段微生物区系的影响。【方法】将180只AA肉公鸡随机分4个处理,每处理设5个重复,每个重复有9只。试验分为NV、CV、LPS和CYP 处理组。免疫应激组分别于18、19、20、32、33和34 d肌肉注射相应剂量的LPS和CYP,NV组和CV组于同日龄注射等体积生理盐水。分别于21、28、35和42 d,每处理组各取6只鸡,无菌操作,宰杀后取十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物。将待测样品中提取的DNA分别进行4类菌属进行Real-time PCR反应。【结果】与NV相比,4类细菌的基因拷贝数发生显著变化。集中在回肠和盲肠,肠杆菌属：5.03—7.88 copies/mg;乳酸杆菌属：5.48—10.34 copies/mg;双歧杆菌属：4.11—7.98 copies/mg;肠球菌属：5.61—8.79 copies/mg。双歧杆菌属含量为4种菌属中细菌含量最低,乳酸杆菌含量高,盲肠含菌最多,十二指肠含量最少,后期各菌群趋于稳定。【结论】免疫应激可引起肠道菌群失调,乳杆菌属和双歧杆菌属的数量在无免疫情况下的含量相对高,LPS和CYP对肉鸡后期的肠道菌群的无显著影响。     

苏钟猪TLR4多态性及编码区C1027A功能分析

【目的】研究苏钟猪TLR4的多态性及其编码区第1 027 bp处突变对TLR4蛋白功能的影响。【方法】采用PCR-SSCP的方法检测TLR4在苏钟猪中的多态性并利用real-time PCR方法检测不同基因型（CC型和AC型）的猪肺泡巨噬细胞经脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导后,TLR4及促炎症因子TNF-α、IL-1β表达量的变化情况,探讨该处突变对TLR4识别LPS的影响。【结果】①共检测到3个突变：G962A、C1027A、G960A,其中前两个为有义突变,且C1027A突变可引起编码氨基酸性质的改变;②LPS能快速诱导猪肺泡巨噬细胞中TLR4及促炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平上调且TLR4编码区C1027A不同基因型（CC型和AC型）的猪肺泡巨噬细胞（pulmonary alveolar macrophages,PAMs）对LPS的敏感性及反应强度存在显著性差异。【结论】苏钟猪TLR4编码区的序列相对保守、多态含量较低,群体遗传变异程度较小。TLR4编码区C1027A突变能影响TLR4识别LPS的能力,等位基因C为苏钟猪抗革兰阴性菌感染的优势基因。