应用马传染性贫血病毒-驴胚肺二倍体细胞系统筛选抗人免疫缺陷病毒药物模型研究 Ⅰ.三种药物对马传贫病毒抑制作用

在马传染性贫血病毒-驴胚肺二倍体细胞(EIAV-DELDC)系统中,采用直接生物素抗生物素(BA)染色法,测定了叠氮胸苷(AZT)、三氮唑核苷(Ribavirin)和磷羟基甲酸钠(PFA)三种药物抗EIAV作用。结果表明,这三种药物在此系统中具有明确的抗EIAV作用,并近似于在人免疫缺陷病毒(HIV)及相应细胞系统中的抗HIV作用。     

应用马传染性贫血病毒-驴胚肺二倍体细胞系统筛选抗人免疫缺陷病毒药物模型研究——Ⅱ.中药制剂对马传贫病毒抑制作用

用驴胚肺二倍体细胞(DELDC)培养马传贫病毒(EIAV),以BA-细胞ELISA检测药物抗EIAV抗原的方法,对30余种中药制剂进行筛选,发现小柴胡汤、甘草浸液、黄芩汤和黄芩甙对马传贫病毒抗原有较明显抑制作用,其ED_(50)分别为717μg/mL、202μg/mL、1089ug/mL、6.6μg/mL.     

马A3Z3V1抑制马传染性贫血病毒早晚期反转录的鉴定

马A3Z3V1是宿主细胞内的一种APOBEC3免疫因子,它可以有效抑制马传染性贫血病毒(EIAV)在马宿主细胞内的复制.为鉴定马A3Z3V1分子对EIAV早晚期反转录的抑制作用,本实验根据EIAV的R/U5和gag基因序列分别设计了检测EIAV早晚期反转录产物的引物并建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,利用该方法评价免疫因子A3Z3V1对EIAV逆转录过程的影响.结果显示,在早期反转录过程中,A3Z3V1可以使EIAV的反转录产物最高减少7倍;在晚期反转录过程中,A3Z3V1可以使EIAV的反转录产物最高减少3倍.本实验结果将有助于进一步研究APOBEC3分子的抗病毒作用机制.     

一般性药物的用法与用量

<正>1抗感染药物1.1干扰病毒复制的药物吗啉双胍(病毒灵)药理及用途:核苷类广谱抗病毒药。本品能抑制病毒的DNA和RNA多聚酶,干扰病毒核酸复制,从而抑制病毒的繁殖,并对病毒增值周期各个阶段均有抑制作用。     

EIAV主要基因的分子生物学研究

马传染性贫血病毒(EIAV)属反转录病毒科慢病毒属。EIAV的RNA基因组是慢病毒基因组中最短最简单的,除了编码结构蛋白gag、pol和env外,EIAV基因组还含有三个开放阅读框架,编码慢病毒中常有的Tat和Rev蛋白及S2蛋白。EIAV最吸引人的特点在于大多数受其感染的动物最终会抑制病毒复制而形成长期的隐性持续性感染,而正是由于慢病毒复杂的分子组成机制导致与其相关的慢病毒基因组中病毒蛋白的差异表达。因此,对EIAV主要基因的分子生物学研究对于其他慢病毒疫苗的研制具有重大的意义。     

马传染性贫血病毒免疫学研究进展

马传染性贫血病病毒(equine infctious anemiavirus EIAV)导致马持续性感染和反复病毒血症,与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属,二者有很多相似的特性[2].EIAV是遗传结构最简单的慢病毒,其感染的潜伏期只有几天至几周,而且在EIAV感染过程中新的抗原变异株的出现与疾病的反复发作相关,这使EIAV有可能作为研究HIV-1分子致病机理及免疫机制的动物模型[3].     

S2基因失活突变马传染性贫血病毒感染性克隆的构建及感染性研究

为研制马传染性贫血病毒(EIAV)标记疫苗株,本研究在EIAV驴胎皮肤(FDD)细胞弱毒疫苗株感染性克隆pEIAVFDDV3-8的S2基因内部引入两个终止密码子,致使S2基因终止表达,构建了一株S2基因突变的感染性克隆pEIAVFDDV3-8△S2。用该重组质粒转染FDD细胞,盲传至第4代时,转染细胞病变明显,电镜下可见细胞内的典型病毒颗粒。反转录酶活性检测和Real-time PCR对病毒拷贝数的检测均证明,获得了EIAVS2基因终止表达的感染性克隆毒株,命名为EIAVFDDV3-8△S2。     

马传染性贫血病毒诱导马胎皮细胞发生自噬的研究

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)感染对马胎皮细胞(FED)自噬的影响,本研究将EIAV感染FED以及过表达GFP-LC3的FED细胞,进行自噬现象的检测。结果显示,通过电镜观察到EIAV感染组细胞出现典型的双层膜结构的自噬小体,western blot检测到EIAV感染组细胞的LC3-II的表达量显著升高,通过激光共聚焦显微镜观察到EIAV感染的过表达GFP-LC3的FED细胞有明显的绿色荧光聚集。上述结果表明EIAV感染FED细胞后可以显著诱导FED细胞发生自噬。该研究结果为进一步研究自噬对EIAV复制和感染的调控奠定基础。     

绿色荧光示踪马传染性贫血病毒样颗粒在活细胞中的组装过程

马传染性贫血病毒(EIAV)gag基因编码的多聚Gag蛋白能够自动组装形成病毒样颗粒(VLPs)。为研究EIAV衣壳蛋白合成、组装及释放过程,本实验通过构建表达EIAV Gag-GFP融合蛋白重组质粒,并将其转染293T细胞,采用western blot检测不同时间点VLPs的产生及释放。并进一步通过活细胞和3D成像技术观察Gag-GFP在细胞中的表达动态及VLPs的组装过程。结果表明:Gag和GFP蛋白融合表达不影响VLPs的组装,转染约6 h后EIAV Gag蛋白进行合成并在细胞胞质聚集完成组装形成VLPs。该实验结果为进一步研究EIAV在细胞中的组装路线和机制奠定了重要基础。     

马传染性贫血病驴白细胞弱毒株的致弱及免疫机理的研究

马传染性贫血病 (EIA)是由反转录病毒科慢病毒属的马传染性贫血病毒 (EIAV)引起的一种马属动物传染病。在慢病毒属中 ,EIAV与人免疫缺陷病毒 (HIV)在传播形式 ,单核细胞为病毒贮存库 ,病毒形态结构 ,病毒持续感染 ,病毒抗原漂移 ,EIAV的 P2 6与 HIV的 P2 4之间抗原交叉反应等都更为相似。至今 ,我国马传染性贫血病驴白细胞弱毒疫苗 (DL V)是目前世界上唯一成功应用的慢病毒疫苗 ,是慢病毒免疫预防很有希望的研究模型。因此 ,揭开 DL V的致弱及免疫机制 ,这使 EIAV有可能作为研究 HIV等慢病毒的致病机理及免疫机制的模型。EI…     

马传染性贫血病毒基质蛋白p15单克隆抗体的制备

为制备抗马传染性贫病毒(EIAV)的单克隆抗体(MAb),本研究用纯化的重组EIAV基质蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术,建立了抗EIAV基质蛋白p15抗体的杂交瘤细胞.应用重组p15和EIAV总蛋白为抗原建立的ELISA以及EIAV感染细胞的间接免疫荧光法,对杂交瘤细胞进行了有限稀释法筛选,获得了7株稳定分泌抗p15抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:1F12、1E2、1E3、4B10、4H7、5E5、4G5.这些抗p15 MAb均能与感染驴胎皮肤细胞的EIAV和经SDS-PAGE分离的EIAV总蛋白中的相应蛋白结合.抗体效价叠加实验表明,这7株MAb中含有至少3种识别不同抗原决定簇的抗体.这些p15 MAb的获得有助于对EIAV和慢病毒的深入研究.     

EIAV反式激活蛋白(TAT)基因的分子克隆与序列测定

以马传染性贫血病毒 (EIAV)疫苗毒感染驴巨噬细胞培养物 ,在病毒繁殖期提取细胞总 RNA,反转录后使用特异引物扩增病毒基因组拼接产物。将扩增产物克隆、测序并与基因组全序列比较 ,确定了编码 EIAV反式激活蛋白(TAT)的转录产物及阅读框架 ,发现至少有 2种拼接产物编码 TAT。比较 2种阅读框架 ,以保守序列作为模板扩增得到完整的编码 EIAV反式激活蛋白的基因。     

马传贫病毒与人免疫缺陷病毒的形态结构比较

马传贫病毒(EIAV)和人免疫缺陷病毒(HIV)同属于反转录病毒科的慢病毒属成员。目前,反转录病毒科包括七个属:哺乳动物B型肿瘤病毒属;哺乳动物C型反转录病毒属;禽C型反转录病毒属;D型反转录病毒属;泡沫病毒属;HTLV-BLV属和慢病毒属。在慢病毒属中主要包括有:梅地-维斯纳病毒、马传贫病毒、牛免疫缺陷病毒、山羊关节炎-脑炎病毒、人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒等。它们是一组形态结构相关的病毒群。EIAV与HIV在病毒分类学上具有特殊的亲缘性。     

中国株马传染性贫血病病毒S2基因的原核表达及其多克隆抗体制备

本实验为表达马传染性贫血病病毒(EIAV)S2蛋白和制备其抗血清,以EIAV感染性分子克隆pFDDV3-8为模板扩增S2基因,将其克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,将S2基因亚克隆于pET-30a表达载体,构建S2基因的重组表达质粒(pET-EIAV-S2),并转化DH5α受体菌.以终浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导,表达的重组蛋白约20 ku.Western blot分析表明,该蛋白可与EIAV的阳性血清反应,具有免疫原性.该重组蛋白通过镍离子亲和层析进行纯化后,免疫新西兰兔.ELISA及western blot分析表明,制备的兔多克隆抗体与EIAV的S2蛋白发生特异性反应.EIAV S2蛋白的重组表达及其抗体的制备为进一步研究S2辅助蛋白在EIAV复制与致病中的作用,以及S2基因反向遗传研究奠定了基础.     

马传染性贫血病毒LTR的研究进展

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)引起马属动物以贫血,持续感染,反复发热为特征的一种急性烈性传染病.与人免疫缺陷病毒(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属的重要成员,二者在基因组结构,复制方式和相似的蛋白种类及功能,传播方式和致病机理方面具有极高的相似性.近年来,随着HIV研究的展开带动了EIAV分子生物研究的发展,EIAV是慢病毒系统中结构最为精确的病毒,为研究人艾滋病提供了绝好的试验模型.     

囊膜基因多样性组成是慢病毒疫苗免疫保护的关键因素

正马传染性贫血病毒(EIAV)属反转录病毒科慢病毒属成员,主要感染马、驴和骡等马属动物。其引起马属动物呈现发热、贫血、出血、黄疸、消瘦、水肿和心脏衰弱等一系列症状的传染性疾病称为马传染性贫血(EIA),简称为马传贫。EIAV与人类免疫缺陷病毒(HIV-1)和猴免疫缺陷病毒(SIV)等慢病毒属成员在病毒基因组结构、复制分子机制、免疫机理及与宿主相互作用等方面都具有相似性。因此,EIAV被认为是研究慢病毒致病机制的重要模型病毒。马传染性贫血病毒弱毒疫苗作为世界上首例成     

马传染性贫血病弱毒疫苗免疫马血清对同源和异源病毒株中和活性的研究

为评价马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗免疫马血清对同源和异源病毒株的中和活性差异,本研究构建了不同EIAV株(EIAV_(FDDV3-8)、EIAV_(LN)、EIAV_(UK)和EIAV_(YN))Env的重组表达质粒,并将这些质粒与包装质粒(pUK-Gag-pol)及表达荧光素酶的转移质粒(pONY8.1)共转染293T细胞;将假病毒与疫苗免疫马(5#、8#)血清共孵育后接种于ELR1-293T细胞单层;通过检测细胞中荧光素酶活性,计算疫苗免疫马血清中和50%假病毒感染的血清稀释倍数,评价血清对病毒的中和活性。结果显示,疫苗免疫马血清对表达不同Env假病毒的中和滴度存在差异,从高到低依次是:pVR1012-FDDV-3-8-Env、pVR1012-LN-Env、pVR1012-UK-Env、pVR1012-YN-Env,而且免疫血清对不同病毒株的中和能力与不同病毒株Env的变异呈负相关(5#,R~2=0.99;8#,R~2=0.96)。虽然免疫马血清中和异源病毒株的能力显著低于同源病毒株,但其对异源病毒株仍具有良好的中和作用,本研究结果表明中国EIAV弱毒疫苗可以激发抗不同病毒株的广谱中和抗体。     

马传染性贫血病毒弱毒株LTR点突变型嵌合感染性克隆的构建

马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）长末端重复序列（Long terminal repeat,LTR）是基因组中高度变异区之一,EIAV LTR的变异对于指导病毒的复制和病毒致病性具有重要的生物学意义。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,由马传贫强毒至弱毒致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,以驴胎皮肤弱毒株疫苗全长感染性克隆pLGFD3-8为父本,选取LTR R区的TAR起始碱基,poly（A）附加位点,采用反向遗传操作对其位点进行PCR体外定点突变,将弱毒序列构建的逆向点突变型全基因克隆转染到驴胎皮肤细胞（FDD）并在FDD上传代,通过逆转录酶活性（RT）检测、RT-PCR方法及real-time RT PCR检测并验证其感染性。检测结果为构建的逆向点突变型感染性克隆在FDD上被拯救,其衍生病毒感染的FDD上出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性;电镜下可见大量典型的EIAV颗粒pLGFD-M点突变型嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8复制水平相似。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。     

对两起猪群利巴韦林中毒病例钧思考

利巴韦林又称三氮唑核苷．其作为广谱抗病毒药，对多种病毒有抑制作用。通常认为利巴韦林是一种疗效确切、毒性较低、副作用小的、比较安全的药物。在医疗界已广泛用于治疗流感、病毒性上呼吸道感染、病毒性感染、病毒性肺炎、疱疹等。