猪链球菌病灭活疫苗安全性与免疫效力试验

我国学者对猪链球菌致病菌的研究证实,国内猪链球菌病的病原主要是C群和D群链球菌,而国外多由R群Ⅱ型链球菌引起猪发生败血型和脑炎型链球菌病.近年来,许多猪场的猪群经猪链球菌疫苗免疫后,猪链球菌病仍时有发生,对分离的致病菌做了分群鉴定后发现,用于免疫疫苗的疫苗株的菌群与当地的流行株不符,结果造成免疫失败.因此在做好该病病原流行株调查基础上,筛选有代表性的、免疫原性好的链球菌作为制苗的疫苗株,研制适合本地区的多价灭活疫苗,已经成为控制该病的有效手段.     

猪链球菌病二联灭活疫苗生产菌株的筛选及培养条件的优化

1997年以来上海地区猪链球菌病的主要致病菌群为马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型，通过动物试验，从l0株马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型分离株中筛选出毒力强、免疫原性好的ATCC35246和HA9801株，作为制备疫苗用的生产菌株。对3种不同培养基、血清浓度、葡萄糖浓度、静置和振荡培养、培养基预热等对细菌生长的影响进行了比较。结果表明，用含有2％犊牛血清、0．2％葡萄糖的改良马丁肉汤培养基较为合适；温度对细菌生长的影响很大，培养基接种前预热可以提高细菌产量；振荡培养对细菌生长的影响不大。     

运用液体通气培养方法制备猪链球菌灭活疫苗试验

猪链球菌病是人畜共患的、由多种致病性链球菌感染引起的急性、热性传染病，其主要特征是急性出血性败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎以及关节炎，发病猪群的死亡率可以达到80％以上，被列为二类动物疫病。猪链球菌还可以感染特定人群发病，严重的可导致死亡，防治该病可用猪链球菌病灭活疫苗。     

猪链球菌病灭活疫苗（2型，HA9801株）的研制（Ⅲ）——疫苗安全性研究

本试验采用实验室研制的3批猪链球菌病灭活疫苗(2型,HA9801株),批号200501、200502、200503,分别用猪进行单次超剂量免疫、多次单剂量免疫、对不同日龄猪单剂量免疫、怀孕母猪单剂量单次免疫试验,以及用Bal/c小鼠和兔进行安全性试验,证实该疫苗对猪及Bal/c小鼠、兔是安全的。     

猪链球菌RAPD-PCR(RAPD)反应条件的优化

研究猪链球菌随机扩增多态性DNA(RAPD)扩增条件。结果表明,当MgCl2浓度为2mmol/L,DNA模板为50ng,dNTP加入量为1.5μL/25μL时扩增效果最好;引物SBSBG07、SBSBG10、SBSBG17及SBSE03、SBSE05、SBSE11号扩增效果较好,即有6条引物可获得理想的扩增结果。     

猪链球菌3型疫苗候选菌株筛选及3＋9型二价灭活疫苗对小鼠免疫效果评估

【目的】 筛选猪链球菌血清3型疫苗候选菌株,制备猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗并评估其在BALB/c小鼠上的免疫保护效果。【方法】 从发病猪病料中分离猪链球菌血清3型菌株,通过蜡螟幼虫和BALB/c小鼠模型筛选出强毒株作为疫苗候选菌株,并对候选菌株进行生物学特性研究。将筛选得到的3型疫苗候选菌株和前期筛选的9型疫苗候选菌株灭活浓缩,使其抗原浓度为2×10¹⁰ CFU/mL,无菌检测后将浓缩抗原液按1：1配比混合,再混合抗原与Summit Poly Solution佐剂按4：1比例混合,制备猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗,疫苗中猪链球菌血清3和9型含菌量均为2×10⁹ CFU/mL。将制备的疫苗免疫6周龄BALB/c小鼠,首免后第14天进行二免,二免后第14天进行攻毒。同时设立商品化疫苗免疫组和阴性对照组,评估疫苗的安全性和免疫保护效果。【结果】 PCR鉴定结果显示,23株临床分离株均为血清3型猪链球菌,依次命名为KQ3-1~KQ3-23。分别通过蜡螟和小鼠进行初筛和复筛,筛选到强毒株KQ3-1。毒力基因检测显示,该菌株基因型为gapdh^＋/sly^＋/fbps^-/orf2^-/mrp^-/89K^-/gdh^＋/epf^-;生长曲线显示,该菌株在37 ℃培养8~10 h时生长达到对数生长后期;BALB/c小鼠致病性结果显示,腹腔接种12 h内可引起小鼠精神萎靡、扎堆、毛发耸立、运动迟缓、死亡等临床症状,该菌株的LD₅₀为5.2×10⁷ CFU/只。制备的疫苗免疫小鼠后,小鼠精神状况、采食等均正常,疫苗注射部位无肿胀、硬块等不良反应,无死亡发生,表明该疫苗具有良好的安全性。免疫后进行猪链球菌血清2型菌株ZYS、猪链球菌血清3型菌株KQ3-1和猪链球菌血清9型菌株YT攻毒,对照组死亡率分别为90%、100%和100%,猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗免疫组保护率分别为30%、80%和70%,商品化疫苗组的保护效果分别为70%、0和10%。【结论】 本研究研制的疫苗能对猪链球菌血清3和9型强毒株提供良好的免疫保护,该疫苗具备疫苗市场开发的潜在价值。     

猪链球菌病灭活疫苗(2型,HA9801株)的研制(Ⅴ)——猪链球菌2型灭活疫苗临床使用效果

广东永顺生物制药有限公司研制生产的猪链球菌2型灭活疫苗, 2005-2008年在全国十多个地区使用,证明该疫苗安全性好,副作用小,免疫效果可靠,是防控由猪链球菌2型引起的猪链球菌病的有力武器,具有非常重要的意义.     

乳酸菌培养条件的优化

1材料与方法 1．1菌种 乳酸菌菌种由广东绿百多生物技术有限公司提供。     

猪链球菌病病原分离及多价灭活疫苗的研制

猪链球菌病（Streptococcosis suis）是猪的一种重要疾病,世界性分布的人、猪共患病,对养猪业危害很大,对人类健康也有一定的威胁.近些年来,我国猪链球菌病的发病率和病死率有明显的上升趋势,造成的经济损失是巨大的,该病已成为猪的主要传染病之一.在国外,多由D群链球菌的某些血清型特别是2型猪链球菌引起猪的败血型和脑炎型链球菌病.……     

副产物乳酸对猪链球菌疫苗株ST171发酵的影响

为提高猪链球菌(S.suis)疫苗的高密度发酵效果,本研究对S.suis疫苗株(ST171)的发酵过程进行检测,利用外源添加试验研究乳酸对ST171发酵的影响,并通过对发酵工艺的优化减少乳酸的生成.结果表明,ST171发酵液中积累有大量对其生长及活菌数量有不利影响的代谢副产物乳酸.经优化确定ST171发酵的最优工艺参数为:溶氧水平20％,初始葡萄糖浓度10g/L,残糖浓度1g/L,最大比生长速率小于0.7 h-1.在优化条件下,发酵过程中乳酸生成量与原工艺相比降低了41.41％,菌体生物量和活菌数量分别提高了70.58％、129.09％,取得了良好的发酵效果.     

猪囊虫病基因工程疫苗的研制及应用

从猪带绦虫六钩蚴cDNA文库中筛选目的基因并进行克隆表达，重组抗原用血清学方法和猪体免疫试验进行鉴定，筛选保护性抗原基因。将具有免疫保护作用的重组抗原纯化，并与免疫刺激复合物佐剂结合，制成猪囊虫病基因工程疫苗。对工程菌的培养发酵、重组抗原的下游纯化及疫苗的配制、疫苗的中间试制进行了研究，确定了一套比较完善的生产工艺。应用昆明小鼠建立了猪囊虫病的实验动物模型，应用该模型进行上述疫苗的免疫预防试验，免疫1次和2次的免疫保护率分别为96．9％和98．4％。本动物的免疫预防试验显示，疫苗安全性好，免疫保护率达92．2％，且免疫组发现的囊虫多数已死亡。在流行区进行了田间和区域试验。免疫猪未有不良反应，囊虫感染率分别由20％降为1．1％和5．4％降为0．21％。用该疫苗对人工感染的囊虫病猪进行免疫治疗，发现在感染早期的治疗效果较好。免疫动物的体液免疫和细胞免疫的检测结果显示，该疫苗刺激机体产生抗体的时间早、持续时间长、效价高；可显著提高淋巴细胞转化率及E－RFC和Ea-RFC细胞、ANAE^ 细胞和粗粒型ANAE^ 细胞、抑制／杀伤性T细胞亚群的数量。以上结果表明，用大肠杆菌表达的重组抗原制备的猪囊虫病基因工程疫苗安全、高效，且成本低廉，可规模化生产，有成为预防猪囊虫病的一种新型生物制剂。     

猪传染性胸膜肺炎与猪肺疫二联亚单位疫苗的免疫效果评价

为了评价猪传染性胸膜肺炎与猪肺疫二联亚单位疫苗(由多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H (OmpH)质粒导入胸膜肺炎放线杆菌(APP)菌影制备)的免疫效果,于某规模化猪场选取30头无上述病原菌和抗体的4周龄(w)仔猪,随机分为安全评估组和试验组进行免疫,试验组包括APP组、OmpH组、APP+OmpH联苗组,分别于4、6w肌肉注射...     

猪支原体肺炎亚单位疫苗的免疫应答

利用分子克隆、定点突变以及重组表达技术获得猪肺炎支原体的主要免疫原蛋白p36、p46、p65和p97R1-Nrdf。设立以重组蛋白p36、p46和p65为试验Ⅰ组,以p36、p46、p65和p97R1-Nrdf为试验Ⅱ组,猪支原体疫苗安百克（M＋PAC）为试验Ⅲ组,PBS＋佐剂为空白对照组来免疫BALB/c小鼠。检测小鼠血清、肺脏以及经蛋白刺激脾淋巴细胞的猪肺炎支原体抗体、IFN-γ和IL-4。结果显示,Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体水平极显著高于Ⅰ、Ⅲ组（P〈0.01）;Ⅱ组IFN-γ水平极显著高于Ⅲ组,而Ⅱ组与Ⅰ组、Ⅰ组与Ⅲ组的IFN-γ水平无显著差异（P〈0.05）;但Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的IL-4水平差异不显著（P〈0.05）,但都极显著高于对照组（P〈0.01）;肺的检测结果中猪肺炎支原体抗体、IFN-γ和IL-4水平呈现一致性,都为Ⅱ组〉Ⅰ组〉Ⅲ组〉对照组;而经刺激脾淋巴细胞检测结果为Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体和IFN-γ水平最高,而IL-4水平为Ⅲ组最高。由此可见,Ⅱ组通过激活体液免疫和细胞免疫途径,产生的猪支原体肺炎抗体水平最高;Ⅰ组亦能通过这2种免疫途径达到与Ⅲ组同样的免疫效果。     

磷酸替米考星对姜曲海品系仔猪的安全性试验研究

为客观评价磷酸替米考星可溶性粉对靶动物猪临床应用的安全性,本试验选取50头40日龄健康断奶姜曲海品系仔猪,分别以1倍、3倍、5倍及10倍剂量10％磷酸替米考星可溶性粉连续饮水给药21 d,喂服受试药物前后受试猪的血常规、血生化、血凝、尿常规、料重比等指标及病理组织学结果表明,受试仔猪没有表现出明显不良症状,除10倍剂量受试猪的血生化指标中血清钙、肌酸激酶与空白对照组相比有明显差异(P＜0.01)外,其他各用药组受试猪的各检测指标与空白对照组没有显著差异或其测定值均位于正常值范围,未出现与用药明显相关的不良状况.结果说明10％磷酸替米考星可溶性粉毒性较小,受试猪体的耐受性高,至少以10倍推荐剂量连续饮水给药21 d对靶动物猪是安全的.本试验对姜曲海品系仔猪进行了血常规、血生化、血凝、尿常规、饲料报酬等方面数据的补充,为其相关指标的进一步研究提供了一定的参考依据.     

猪口蹄疫O型灭活疫苗PD50效检攻毒方式探索

用10 000 TCID50的OR/80株F13细胞毒或用10 000 LD50的OR/80株乳鼠组织毒(ORMF8),通过肌肉注射途径、蹄踵球部或趾间皮内注射途径接种O型口蹄疫抗体阴性架子猪进行攻毒试验,三种途径均不能使试验猪产生规律性发病.     

猪瘟疫苗中牛病毒性腹泻病毒2型的检测

为对上海某猪场送检的一份猪瘟疫苗进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测,本研究将猪瘟疫苗样品接种于MDBK细胞,盲传15代后仍无致细胞病变效应,但间接免疫荧光试验表明接种该疫苗后的MDBK细胞能够被单克隆抗体BZ-53(BVDV-2)识别。采用BVDV-1和BVDV-2的5’-UTR的通用检测引物和针对BVDV E2的引物,对样品RNA进行RT-PCR检测,结果显示,样品能够扩增出约288 bp的BVDV特异性片段;此外,5’-UTR和E2基因片段的测序分析结果表明分离株属于BVDV-2,并且其E2基因与牛源XJ-04株(BVDV-2)的E2基因同源性最高(92.3%),而与猪源ZM-95株(BVDV-1)的E2基因同源性较低(64.5%)。由此证明,该猪瘟疫苗中的确污染有一株BVDV-2株。     

应用定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量评价研究

为进一步验证猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)与兔体定型热试验之间存在正相关性,本研究利用qRT-PCR方法对278批次HCLV疫苗进行检测,分别检测其疫苗含量及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染情况。结果表明,278批次猪瘟疫苗中有66批(24%)疫苗含量达不到规程标准,有42批(15%)疫苗存在BVDV污染;从所检疫苗中抽取6份qRT-PCR检测HCLV含量较低的疫苗,采用兔体定型热试验进行验证,两种方法结果吻合,表明qRT-PCR方法可以作为评价猪瘟疫苗质量的一种备选方法。     

一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检验方法的研究

现有猪瘟活疫苗的效力检验多采用兔体定型热反应法(RID),但该方法存在重复性差、检验周期长、数据不精确等缺点,为克服兔体定型热反应法存在的缺陷,本研究建立了一种快速、准确、稳定的检测猪瘟病毒含量及疫苗效力的间接免疫荧光方法(IFA),该方法以出现特异性荧光作为检测标准,通过添加促细胞感染剂PB增加特异性荧光数量,可以在4d内检测出猪瘟活疫苗成品或半成品病毒含量,该方法检验周期短、数据精确、重复性好,为猪瘟活疫苗效力检验方法的完善提供了有力支持。