脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)检测方法研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是一种霉菌毒素,也是谷物中的主要污染物之一,对农产品生产、人类健康、国际贸易交流和社会经济发展均有重要影响。适宜的检测方法是确定毒素含量是否符合相关限量标准、制定谷物饲料和食品中毒素污染控制措施的关键。本文就脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性特征,分子结构特点,常用检测方法及最新研究进展进行综述。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)理化检测方法的研究

比较了检测饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的3种方法:薄层层析法(TLC)、高效液相色谱分析(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS),建立了TLC的定性检测及HPLC的定量检测相结合的方法。同时通过反复试验,结合HPLC检测,确定了以展开剂氯仿:甲醇(90∶10)展开DON毒素的R f值约为0.45。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇的代谢特征

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对以谷物为基础的食物和饲料的污染是一个全球性问题,严重危害了人和动物的健康。DON在人和动物体内的代谢特征是开展DON暴露评估、毒性作用机制和干预技术等研究的基础。近年来有关DON的吸收、分布、代谢和排泄等毒物动力学的研究引起了国内外广泛关注。本文将DON代谢特征的最新进展进行了全面的综述。     

利用生物酶对脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行生物脱毒

安全有效地去除霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),是确保食品安全的一件迫在眉睫的事。从具有DON脱毒活性的微生物中分离出的酶,为缓解这一问题提供了有应用前景的替代品。然而,在实用性应用这些酶之前,必须解决一些关键挑战。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇提取、纯化及含量检测

本试验通过提取和纯化方法的优化,旨在获得高纯度的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)。首先将禾谷镰刀菌孢子液接种于玉米培养基,于27℃30%湿度的条件下培养25d,收集产毒培养基,制成毒素粗提液。经过层析柱2次洗脱,分段收集洗脱液,用薄层色谱法(TLC)确定含DON的洗脱液,合并洗脱液,运用多重结晶法进行纯化,获得DON的纯品,高效液相色谱法(HPLC)进行分析确认。采用该培养方法,每千克玉米培养基可产生DON 56.65 mg,纯化后可得到DON 29.5mg,纯度达到98.1%;HPLC检测条件为:Waters C18柱(4.6mm×150mm,5μm),流动相为乙腈-水(16∶84),流速0.8mL/min,紫外波长218nm,色谱柱柱温30℃;本方法加标回收率为86.9%~100.6%,日内相对标准偏差≤9.42%,日间相对标准偏差≤5.79%。本试验建立的DON提取与纯化方法简单,不需要任何特殊的试剂与设备,且该检测方法回收率高,准确度和精密度均能满足试验要求,为DON纯品的定量提供了技术支撑。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫胶体金试剂板的研制

建立了一种快速检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的免疫胶体金检测方法.利用柠檬酸三钠还原法制备直径40 nm的胶体金溶液,利用胶体金标记抗DON单克隆抗体制备胶体金免疫复合物,将DON-BSA和羊抗鼠IgG分别固定在NC膜的检测线和质控线上,依次将样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水垫粘贴到PVC膜上,组装成试剂板.该试剂板灵敏度可达到500 μg/kg,15 min内即可完成检测;特异性好,与其他霉菌毒素无交叉反应;稳定性、准确性均较好.该胶体金免疫层析试剂板使用方便、快速,且不需要任何仪器设备辅助,可开发作为一种大批量检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇样本的筛选手段.     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对肠道屏障的影响及其作用机制

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对食物和饲料的污染是一个全球性的问题,它不仅影响了人类和动物的健康,还造成了严重的经济损失。肠道是机体抵御病原体和毒素入侵的第1道屏障,近年来的研究表明DON不仅抑制了肠道对营养物质的吸收,还影响了肠道屏障和细胞紧密连接,并改变了肠道微生物组成。本文将围绕DON对肠道屏障的影响及其作用机制进行综述。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性作用及其机理

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是谷物中最为常见的一种真菌毒素,其降低畜禽的生产性能,并且对动物免疫系统、细胞信号传导和基因的表达均有不同程度的影响。本文从DON的物理特性、代谢,尤其是其对动物采食量、免疫系统、肠道功能、细胞凋亡、基因表达和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路等方面的影响及机理以及降解的一般方法作一综述,以期为DON的进一步研究和谷物中DON的降解提供参考。     

配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的允许量

本刊讯2007年2月16日,国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会发布的国家强制性标准GB20833-2007配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的允许量,于2007年3月1日起实施。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对蛋鸡肠道健康的影响

试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）对蛋鸡肠道形态结构、炎症因子、紧密连接蛋白表达的影响。选取26周龄产蛋率一致的海兰褐蛋鸡80只,随机分为4组,每组4个重复,每个重复5只,对照组每天灌服等量生理盐水,试验组每天分别灌服1、5和10 mg/kg·BW的DON,连续灌服6周。结果显示：与对照组相比,5和10 mg/kg DON组肠道形态结构均受到不同程度损伤,出现黏膜脱落、绒毛数量减少的现象,绒毛长度显著降低,隐窝深度增加,且呈剂量-效应关系（P<0.05或P<0.01）。DON剂量≥5 mg/kg时,白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)和紧密连接跨膜蛋白（claudin-1）的基因表达水平降低（P<0.05或P<0.01）;DON剂量为10 mg/kg时,紧密连接蛋白-1(ZO-1)和紧密连接跨膜蛋白（claudin-1）的蛋白表达也显著降低（P<0.05）;DON剂量为1 mg/kg时,白细胞介素8(IL-8)表达水平显著增加（P<0.01）。表明DON高于5 mg/kg·BW时能显著破坏蛋鸡肠道...     

脱氧雪腐烯醇(DON)对牛卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

本试验旨在探究脱氧雪腐烯醇（DON）对牛卵母细胞体外成熟发育的影响及其作用机制。将牛卵丘卵母细胞复合体分别在含DON浓度为0、50、250、500、1 000 ng·mL^-1的体外成熟培养液中进行体外成熟,检测卵丘细胞扩展程度及第一极体排出率,构建DON毒性模型。然后,借助此模型研究DON对卵母细胞的线粒体分布及后续受精卵裂率、囊胚发育率的影响,探究DON对牛卵母细胞体外成熟及后续发育能力的影响;通过检测体外成熟卵母细胞内的氧化相关因子（ROS、GSH）水平和抗氧化基因CAT、GPx4的mRNA表达量,揭示DON影响牛卵母细胞体外发育能力的分子机制。结果表明,250、500 ng·mL^-1的DON显著抑制卵母细胞的第一极体排出（P<0.05）,1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制第一极体排出（P<0.01）; 250 ng·mL^-1的DON显著抑制卵丘卵母细胞扩展（P<0.05）,500、1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制卵丘细胞扩展（P<0.01）;后续试验选取DON浓度为500 ng·mL^-1作为毒性模型（DON组）,与不含DON组（对照组）进行比较研究,结果发现,对照组与DON组的线粒体均匀分布比例（60.2%vs.40.0%）存在显著差异（P<0.05）;试验组较对照组的受精卵裂率（33.6±3.6%vs.（67.7±2.6）%）及早期囊胚率（（0.0±0.0）%vs.（18.3±2.2）%）均显著降低（P<0.05）;试验组较对照组,卵母细胞内ROS水平（1.6 vs.1.0）显著升高（P<0.05）,GSH相对水平（0.4 vs.1.0）显著降低（P<0.05）,抗氧化基因CAT与GPx4的mRNA相对表达量（0.0 vs.1.0;0.6 vs.1.0）显著降低（P<0.05）。以上研究表明,DON对卵母细胞的体外成熟及早期胚胎发育具有抑制作用,其作用机制与DON破坏牛卵母细胞内抗氧化系统平衡相关。     

猪肉和鸡肉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素酶联免疫吸附检测方法的建立

为保障动物源性食品安全,本研究建立了分别检测猪肉和鸡肉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和T-2毒素残留的间接竞争酶联免疫吸附法.结果显示,该方法在猪肉和鸡肉样本中DON的检测限分别为34.9和43.5 μg/kg,添加回收率为72.7%~97.1%,变异系数小于8.7%;T-2毒素的检测限分别为33.7和28.7 μg/kg,添加回收率为72.1%~95.0%,变异系数小于11.3%.该方法灵敏度高、准确、简便,适用于猪肉和鸡肉中DON和T-2毒素残留的快速检测.     

沙丁胺醇人工抗原的合成与鉴定

通过沙丁胺醇(SAL)与琥珀酸酐的醇解反应制备SAL的琥珀酸衍生物,用EDC法将SAL琥珀酸衍生物偶联于载体蛋白BSA和OVA,合成免疫原BSA-SAL和包被原OVA-SAL,用紫外扫描(UV)、SDS-PAGE进行鉴定;用BSA-SAL免疫BALB/C小鼠,间接ELISA测定多抗上清(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,BSA-SAL的UV与BSA、SAL的相比发生了改变;通过UV分析,SAL-HS与BSA的分子结合比约为7.2∶1;通过系列ELISA鉴定,获得了高价、敏感、特异的pAb,为SAL残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

Effects of ZEA,DON and Their Combined Effects on the Secretion of Cytokines in CTLL-2 Cells

To analyze the effects of ZEA or/and DON on the immunologic function,CTLL-2 cell was used as experimental materials. After exposing the CTLL-2 cell to different concentrations of ZEA (0,5,10,20 μg/mL),DON (0,0.5,1,2 μg/mL) and ZEA+DON (blank group,5 μg/mL ZEA,0.5 μg/mL DON,5 μg/mL ZEA+0.5 μg/mL DON) for 48 h,the concentration of GZMB,PFP,IFN-γ and TNF-α in CTLL-2 cell and supernatant fluid were detected by ELISA method. The result showed that DON and ZEA could reduce the concentration of PFP,GZMB and IFN-γ in the CTLL-2 cells and the culture supernatant fluids,and increase the concentration of TNF-α. The intoxicated group had significant or extremely significant difference compared to control group (P <0.05;P <0.01),which showed the dose effect. The group exposed to the combined of ZEA and DON showed an additive effect. The result indicated that ZEA,DON and the two combined could reduce the killing activity of immunological cell by affecting the secretion of immunological cytokines, and indirectly affect the negative feedback regulation of humoral immunity and cellular immunity,which led to the decline of immune function in animals.     

ZEA、DON及其联合染毒对CTLL-2细胞因子分泌的影响

为研究镰刀菌毒素玉米赤霉烯酮（ZEA）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其联合作用对动物免疫功能的影响,试验以CTLL-2细胞（细胞毒性T淋巴细胞株）为材料,用不同浓度的ZEA （0、5、10、20 μg/mL）、DON （0、0.5、1、2 μg/mL）及联合（空白组、5 μg/mL ZEA、0.5 μg/mL DON、5 μg/mL ZEA＋0.5 μg/mL DON）处理CTLL-2细胞48 h,采用ELISA法检测了细胞内及培养上清液中颗粒酶B （GZMB）、穿孔素（PFP）、干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子的含量。结果显示,ZEA、DON能够降低CTLL-2细胞胞内及培养上清液中PFP、GZMB、IFN-γ的浓度,增加TNF-α浓度,染毒组与对照组相比均有显著或极显著差异（P＜0.05;P＜0.01）,且均呈剂量效应关系;ZEA、DON联合染毒表现为加性效应。结果表明,ZEA、DON及其联合作用可通过影响免疫细胞因子的分泌,降低免疫细胞杀伤活力,间接影响机体体液免疫和细胞免疫的负调节,从而导致动物机体免疫机能下降。     

传染性法氏囊病病毒抗原表位分析--单克隆抗体的制备与鉴定

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)分离毒株ZB和TA3的细胞培养物采用不连续蔗糖密度梯度离心的方法浓缩纯化病毒,免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了6株分泌抗IBDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞系1C1、1E6、2B2、2G8、3A2、3E2。间接ELISA测定,杂交瘤细胞培养上清液的抗体效价为102,诱生腹水的抗体效价为106～107。相加ELISA分析,这6株单克隆抗体对应不同的病毒抗原表位。中和试验结果表明,2G8对病毒有较强的中和能力,腹水的中和效价为105。用2B1和3E2配对建立的夹心ELISA可特异地检测IB DV。     

Diagnostic opportunities for evaluation of the exposure of dairy cows to the mycotoxins deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZEN): reliability of blood plasma,bile and follicular fluid as indicators

To investigate the usefulness of follicular fluid (FF) in relation to blood plasma and bile as indicators of exposure of dairy cows to ZEN, DON and their metabolites, a dose–response study was performed with 30 dairy cows. The cows, 10 in each group (named CON; FUS‐50, FUS‐100), received a diet with three different concentrations of Fusarium toxin‐contaminated maize. Thereby, the following dietary concentration were reached: CON (0.02 mg ZEN and 0.07 mg DON, per kg dry matter, DM), FUS‐50 (0.33 mg ZEN and 2.62 mg DON, per kg DM) and FUS‐100 (0.66 mg ZEN and 5.24 mg DON, per kg DM). ZEN, DON and de‐epoxy‐DON (de‐DON) were detected in FF. Based on the linear regression between toxin concentration in plasma and FF, it seems that about 50 % (m = 0.5) of ZEN present in plasma is present in FF while an increase of 1 ng/ml DON or de‐DON in plasma is paralleled by an increase of 1.5 ng/ml DON or 1.1 ng/ml de‐DON in FF. ZEN, DON and their metabolites, except zearalenone (ZAN), were also detected in bile. Contrary to DON and de‐DON, ZEN and its metabolites were accumulated in bile so that the concentration of ZEN and metabolites was much higher than for DON and de‐DON. The main compound was β‐zearalenol (β‐ZEL). The biliary ZEN, α‐zearalenol (α‐ZEL) and β‐ZEL concentration correlated linearly with each other with an uncertainty of <15 % (r² ≥ 0.86), whereas the ratio between ZEN: α‐ZEL: β‐ZEL was about 1.5:1:11. With the help of established linear relationship between toxin intake and toxin concentration, bile could be used as diagnostic indicator to assess the exposure of cows.     

The first survey and molecular identification of Entamoeba spp. in farm animals on Qinghai-Tibetan Plateau of China

Protozoans of Entamoeba spp. are globally distributed zoonotic parasites that infect diverse animal hosts and humans. Prevalence and species/genotypes distribution of Entamoeba spp. in domestic animals are not fully investigated on Qinghai-Tibetan Plateau (QTP), an animal husbandry and agriculture region of China. In a survey, 528 fecal samples were collected from 7 species of domestic animals on multiple locations across QTP region and analyzed by PCR and sequencing analysis. The overall prevalence of Entamoeba spp. infection in all examined animals was 97.9 %. Four Entamoeba species, E. bovis, E. moshkovskii, E. ecuadoriensis and E. histolytica were found, and majority (94.2 %) of Entamoeba-infected animals harbored E. bovis. Six Entamoeba genotypes, Entamoeba ribosomal lineages (RL) 1, 2, 3, 4, 8 and 9 were identified by sequencing analysis. Two zoonotic species, E. moshkovskii and E. histolytica, were present in horses, while E. ecuadoriensis and E. bovis were found in horses and all species of seven farm animals, respectively. It was also observed that six Entamoeba genotypes were distributed in animals in specific pattern. The results revealed high prevalence of Entamoeba spp. infection in livestock, broad range of hosts as well as diversity and species/genotype distribution of Entamoeba spp. in farm animals inhabiting on the high altitude QTP region.     

鸭茅杂交种的SSR分子标记鉴定及其遗传变异分析

以140个鸭茅杂交种单株及其亲本(01996、YA02-103)为材料,用SSR分子标记技术研究杂种与其亲本间扩增谱带的多态性,以甄别真假杂种。SSR标记在供试材料中的扩增带型表现为互补型、父本型及其他型。利用3对特异引物A01G20、A03N16、A03K22可快速准确地鉴定出杂交种111份。试验所用的100对SSR引物中有13对引物分别在杂种和双亲之间存在扩增多态性。13对引物在供试材料中共扩增出多态性条带76条,平均每对引物扩增出6条,多态性百分率为84.24%。供试材料具有丰富的遗传变异,利用SSR进行鸭茅杂种鉴定及遗传变异分析是可行的。     

抗鸡IBDV Gt株单克隆抗体制备及抗原表位初步分析

采用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化的鸡传染性法氏囊病病毒Gt株免疫BALB/C小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过三次筛选克隆,获得具有分泌抗IBDV抗体的7D_4、5D_2两株杂交瘤细胞系,并对7D_4及5D_2株进行了特异性、稳定性等方面的鉴定。试验表明,两株分泌的抗体能够特异地与IBDV VP2蛋白反应。7D_4株及5D_2株杂交瘤细胞上清ELISA效价分别为1：250、1：50,腹水ELISA效价为6．4×10~6、5×10~3；并运用7D_4、5D_2介导的相加ELISA进行抗原表位的初步定位,这两株单抗针对不同的VP2抗原表位。