cDNA芯片检测棉花纤维发育相关基因的表达

利用cDNA芯片技术分析E6、Lipid transfer protein(LTP)、Proline-rich protein(PRP）、Expansin、Tubulin、Annexin等家族的63个棉花纤维发育相关基因,在陆地棉徐州-142开花后10d纤维组织及其无长绒无短绒突变体开花后10d胚珠中的表达差异,发现属于E6、LTP、PRP、Expansin家族的基因在两种组织中存在显著的表达差异,符合前人的报道。其中E6、LTP家族的基因在两种组织中的表达差异最大,个别基因表达差异甚至达到15倍之多。而Tubulin家族的基因在两种组织中的表达差异不大,检测的24个Tubulin家族基因中,仅2个基因在纤维组织和胚珠中存在显著表达差异。cDNA芯片技术可以高通量鉴定棉花纤维相关基因以及研究棉花发育相关基因的表达谱。     

陆地棉种子发育过程中 microRNA 的挖掘与功能研 究简

 microRNAs (miRNAs)广泛参与调控植物的生长和发育,但这类分子是否对棉花胚珠和纤维的生长发育起到重要的作用,还有待验证。对这些小分子的认识,一般先要从序列信息的获得上开始。应用基因芯片对TM-1 +5 DPA （开花后5 d）胚珠总RNA进行了miRNA 的筛选研究。结果显示,含有352 个探针的芯片成功钓取到199 个陆地棉miRNA,其中绝大多数为首次报道。此外,对miR399 研究发现,它与纤维中磷的含量变化相关; miR169 可能与干旱应激反应有关。     

棉纤维伸长阶段上下调基因及相关通路的分析

棉花纤维细胞是研究细胞发育机制的理想材料，陆地棉Ligon lintless(Li₁)是单基因显性超短纤维突变体, 其性状表现为长纤维极度缩短，分离得到的野生型(li₁)纤维发育正常。本实验通过cDNA芯片的方法对两个材料进行比较分析，采集开花前1 d到开花后7 d即–1 DPA ~ +7 DPA (day post anthesis)材料，检测到多个上调和下调基因，选择两个基因(CIPK和XET)进行RT-PCR和qRT-PCR的芯片验证。应用MAS (molecular analysis system)系统进行GO功能注释和Pathway的分析表明，这些差异表达基因参与脂肪酸代谢(fatty acid metabolism)，甘油脂代谢(glycerolipid metabolism)以及碳固定(reductive carboxylate cycle)等多个代谢途径。这些基因在突变体Li₁中的异常表达可能导致细胞中脂肪酸和脂肪含量变化，影响棉纤维细胞的正常发育。     

棉花纤维次生壁加厚期基因的表达谱分析

本研究以高纤维强度材料0-153和转基因抗虫棉sGK9708为亲本构建的高代重组自交系群体(F608)中纤维强度具有显著差异的两个系(高强材料69307和低强材料69362)作为材料,利用cDNA芯片技术,对纤维次生壁加厚阶段(15 DPA和20 DPA)的基因表达谱进行研究.共检测到差异表达基因3 383个,占cDN...     

棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA的克隆、表达及染色体定位

腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。通过对高品质纤维陆地棉品系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的cDNA序列。该cDNA序列长1 598 bp, 利用5′RACE技术得到上游318 bp的片段,序列拼接获得全长为1 916 bp的cDNA序列, ORF为1 458 bp, 编码485个氨基酸, 其理论上的等电点pI＝5.69, 分子量MW＝53.2 kD。该基因在不同组织、器官中均表达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。根据Southern杂交结果推测GhSAHH基因在陆地棉基因组中为单拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC1作图群体, 将GhSAHH基因定位在第20号染色体上。     

棉花纤维特异表达基因GhF1的分离及鉴定

采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术,克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhF1,该cDNA全长622 bp,含有一个编码66个氨基酸蛋白的开放阅读框。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsutumL.)中含有两个拷贝。Northern杂交分析表明该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhF1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育的早期阶段。尽管未发现该基因与已知基因有任何同源性,但其分布的组织特异性和表达的发育阶段性暗示该基因在纤维伸长中起作用。     

陆地棉果胶甲酯酶GhPME6的克隆及功能分析

结合陆地棉SSH-cDNA文库的测序结果,与棉花EST数据库进行序列比对和分析,获得1条在棉纤维次生壁加厚期特异表达的EST序列,该序列编码果胶甲酯酶(PME)。利用RACE技术获得其全长cDNA序列,命名为GhPME6。基因结构分析表明,GhPME6包含1个长度为1560 bp的开放阅读框、2个外显子和1个内含子,编码含有519个氨基酸的蛋白。其氨基酸序列具有PMEI和Pectinesterase两个保守结构域。通过对不同棉属基因组中的PME6基因进行比对分析,发现PME6在进化过程中具有高度保守性。qRT-PCR分析显示,GhPME6在纤维发育次生壁加厚期大量表达,推测该基因可能对棉纤维比强度有重要影响。构建GhPME6基因的大肠杆菌表达体系,获得与预期大小一致的目的蛋白,为深入研究GhPME6对棉纤维比强度的影响奠定了基础。     

绿色棉纤维类黄酮3',5'羟基化酶基因GhF3'5'H的克隆及实时定量表达分析

以发育18 d的天然绿色棉及其近等基因系白色棉纤维细胞为材料,利用cDNA-AFLP结合cDNA末端快速扩增技术,克隆了1个绿色棉纤维优势表达基因的全长cDNA。序列分析结果表明,该cDNA全长1873bp,含有一个编码509个氨基酸残基的开放阅读框。Blast分析表明,该基因的编码产物为一个类黄酮3',5'羟基化酶,将该基因命名为GhF3'5'H,序列提交到GenBank,登录号为GU062184。实时荧光定量PCR检测结果显示:GhF3'5'H在绿色棉不同组织中的表达量均显著高于其近等基因系白色棉,而且主要在纤维细胞中表达。在纤维发育过程中,GhF3'5'H在纤维发育的早期表达量最高,并随纤维发育逐渐降低。推测该基因可能在绿色棉纤维色素前体物质的形成中发挥作用。     

三个陆地棉水孔蛋白基因的克隆与表达分析

从陆地棉SSH-cDNA文库的测序结果中得到一条具有完整ORF的陆地棉水孔蛋白基因序列,将其命名为GhAQP2。以该基因编码的氨基酸序列为探针,在棉花EST数据库经同源搜索得到2个相似性较高的EST,利用RACE技术获得其全长cDNA序列,将其基因命名为GhAQP3和GhAQP4。基因结构分析发现GhAQP2和GhAQP3各有4个外显子,3个内含子;GhAQP4有3个外显子,2个内含子。生物信息分析表明3个基因编码蛋白均含有6个跨膜区,2个NPA结构域,其氨基酸序列具备MIP超家族典型的蛋白保守区序列特征。多序列比对发现3个基因的氨基酸序列与其他物种PIP2类水孔蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。qRT-PCR分析表明,GhAQP2在纤维伸长后期优势表达,GhAQP3在下胚轴和子叶中高表达,GhAQP4在纤维伸长前期优势表达,推测3个基因在不同的组织中发挥作用。GhAQP2在20DPA优势表达,为研究该基因在纤维伸长向次生壁加厚期转化过程中的表达调控提供了重要信息。     

Cotton PIP 2;3 and PIP 2;4 Preferentially Expressed in Fibers Display High Water Channel Activity and Function in Cell Elongation and Tolerance to Stresses

Aquaporins,which form the main water channels in cells,play important roles in plant development.To investigate the functions of aquaporins in cotton fibers,two cDNA (designated GhPIP2;3 and GhPIP2;4,respectively) were isolated from a cotton fiber cDNA library.The deduced polypeptides contained highly conserved amino acid sequences of PIP2 proteins.     

棉花ADP-ribosylation factor基因(GhARF1)的克隆与表达分析

ADP-ribosylation factor (ARF)是GTP结合蛋白,属于小G蛋白超家族中的ARF亚家族成员,在高尔基体小囊泡形成以及细胞信号传导中起重要作用。棉花纤维的发育需要有高尔基体参与,但ARF基因在棉花纤维发育中的功能尚不清楚。本文利用GHA27作探针,筛选棉花花药的cDNA文库,得到两个序列相同的阳性克隆。核苷酸序列分析表明该基因编码一个有181个氨基酸残基,分子量约20.7 kDa的蛋白,与动物、酵母及其他植物的ARF基因有很高的相似性,命名为GhARF1。采用PCR技术获得该基因序列,该基因含有5个外显子和4个内含子。进化树分析表明该基因更接近人类的classⅠ类ARF基因,在编码的氨基酸序列中具有保守的GTP结合区域,即P（GLDAAGKT）、G（NKQD）以及G’（DVGGQ）。Northern杂交结果显示GhARF1基因在棉花的纤维、花冠和根中表达量较高,特别是在纤维中的表达量最高,在茎、花蕾中也有表达,而在真叶、子叶和胚珠中的表达较微弱。Southern杂交分析表明,ARF基因在二倍体草棉和四倍体陆地棉基因组中均以多拷贝存在。     

陆地棉GAI基因原核表达与多克隆抗体制备

 DELLA蛋白是GA信号响应的关键负调节因子,本文采用基于EST的电子克隆方法,从棉花中克隆了DELLA蛋白家族的一个成员GhGAI。根据电子克隆序列,从陆地棉花胚珠cDNA中扩增得到GhGAI全长基因片段。将其在原核中表达,得到了分子量（Mr）为62000的蛋白质条带。表达蛋白经His-Tag亲和层析纯化后,对兔子进行免疫,制备的抗血清通过间接ELISA检测,具有较高的效价和特异性。     

Genes Expressing Differences in Upland Cotton Fiber Development Between 12 DPA and 16 DPA

Cotton is the major dominant natural fiber crop on the earth.Although some current cotton genetics and breeding programs had made great progresses in cotton lint yield increases and disease resistance (tolerance),fiber quality has little improvement.Global understanding genes expression will benefit to the fiber quality genetic improvement in the future.There are total 929 genes that were differently expressed between 12 DPA and 16 DPA based on the12 K cotton cDNA arrays (CapitalBio Corporation) analysis.There were 357 (38%) up-regulated,and 572 (62%) down-regulated.This work was supported by grants from the China National Basic Research Program (2004CB117306)     

Functional Analysis of Cotton RDL1 Protein

Cotton fiber development is a highly programmed process,involving a large number of genes.Through cDNA array and RT-PCR,we isolated a Gossypium hirsutum RD22-1 like gene (GhRDL1),homologous to Arabidopsis RD22.GhRDL1 was highly expressed in elongating cotton fiber (3～15DPA).The ORF of RDL1 encodes a protein of 335 amino acids,with a 19-amino acid signal peptide at the N-terminal and a conserved plant-specific domain,BURP,at the C-terminal.     

利用马克隆值差异显著的BILs鉴定棉纤维品质相关基因

【目的】马克隆值是衡量棉纤维品质的重要指标之一。利用马克隆值存在显著差异的2个陆海回交近交系材料进行高通量基因芯片分析,旨在筛选和鉴定棉纤维发育相关的关键基因。【方法】从SG747(Gossypium hirsutum L.)和Giza75(Gossypium Barbadense L.)高世代回交近交系(Backcross Inbred Lines,BILs)群体中选取NMGA-140(马克隆值6.2)和NMGA-051(马克隆值4.0)为材料,利用Affymetrix公司的棉花寡聚核苷酸基因芯片对其开花后10 DPA(Days after anthesis)的棉纤维进行了表达谱分析。【结果】获得了2655个差异表达基因,包括功能预测基因(15.57%),翻译、核糖体结构与生物合成相关基因(13.54%)和翻译后修饰、蛋白质转换、分子伴侣相关基因(9.31%)等。推测β-tub10正向调控棉纤维发育过程,β-tub1负向调控棉纤维发育过程,Ghi.3578.1.S1_s_at在棉纤维发育早期起到了作用。【结论】为棉花纤维品质的遗传改良提供了丰富的基因资源,为分子标记辅助育种开发更多新的分子标记。     

一个新的棉纤维表达蛋白cDNA的克隆、表达及功能初步分析

通过陆地棉高品质纤维种质系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序,得到一个开放阅读框(open reading frame,ORF)完整的棉纤维表达蛋白(GhCFE,GenBank登录号:DQ073045)cDNA序列。该cDNA序列全长1274bp,最大的ORF为996bp,编码332个氨基酸,其理论上的等电点pI=6.14,分子量Mw=37.7KD。它的N-末端存在一个长度为27个氨基酸残基的信号肽。RT-PCR分析表明,该基因在根、茎中不表达,在叶片中微弱表达,在不同发育时期的纤维细胞中均表达,且在纤维伸长期表达量最高。进化树显示GhCFE与已报导的3个棉纤维表达蛋白cDNA有很高的同源性。通过构建酵母表达载体,发现该基因对酵母细胞的伸长和细胞壁加厚没有显著影响。利用pBI121质粒构建了含35S启动子的正义表达载体和含棉纤维特异表达启动子E6的正义和反义表达载体,正在通过农杆菌介导的遗传转化,开展该基因的功能验证。     

棉花6个小分子质量热激蛋白基因的序列、表达与定位

利用棉花纤维cDNA文库, 分离到6个小分子质量的热激蛋白基因。序列结构分析发现, 它们分别属于3种不同类型的小热激蛋白。RT-PCR分析表明, 它们在棉花体内具有不同的转录表达特征, 可能行使不同的功能, 它们的转录与棉花特定的发育阶段相关, 线粒体小热激蛋白和细胞质I类小热激蛋白基因受纤维启始和分化的调控, 而细胞质II类小热激蛋白与棉花叶片的生长发育相关。利用本实验室的四倍体棉花遗传图谱, 对这6个小热激蛋白基因进行定位, 其中3个被定位在A4、D8和A6染色体上。     

海岛棉纤维发育相关基因GbPDF2酵母单杂交文库构建及其上游基因解析

为研究棉纤维起始发育的分子调控网络,以海岛棉(Gossypium barbadence L.)品种"海渝"开花当天(0 DPA)胚珠为实验材料,利用酵母单杂交技术来筛选棉纤维起始发育相关基因GbPDF2的上游调控转录因子。首先,克隆GbPDF2的启动子(Accession:KJ475468);构建了该启动子的诱饵融合载体(GbPDF2-PRO)-pAbAi,转入酵母细胞中重组为Y1HGold[Bait-pAbAi]菌株。之后,应用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System系统构建酵母单杂交cDNA文库,转化重组酵母菌株,通过同源重组筛选GbPDF2的上游转录调节因子。构建的cDNA文库库容为2.23×106,重组率为95.8%,插入片段大小为300 bp~2000 bp,其中大于1000bp的阳性克隆为109个。cDNA插入片段经测序和Blast同源性分析,筛选出2个生长素响应因子,1个WRKY7转录因子,1个WD-repeatprotein 40等与纤维发育相关的转录调节因子,为研究棉纤维起始发育的信号转导通路奠定了基础。     

过量表达棉花GhACO2基因增强拟南芥抗逆性研究

乙烯在植物生长发育过程中起到非常重要的作用,ACO基因对于细胞内乙烯的合成起到关键的作用,然而乙烯在植物响应非生物胁迫方面的功能有很大的未知性。研究通过PCR方法从棉花基因组中克隆获得GhACO2基因,构建了植物过量表达载体p35S::GhACO2,通过花序侵染法转化拟南芥,用卡那霉素对转化植株进行初步筛选,进一步对阳性植株进行PCR和GUS组织化学分析检测,结果表明,在转基因拟南芥叶片中有很强的GUS活性,茎和根有微量表达;GhACO2基因已经整合到拟南芥基因组中,成功获得转基因拟南芥。经过纯合筛选后获得转基因T2代拟南芥植株,利用NaCl和PEG6000对T2代植株进行盐胁迫和干旱胁迫处理,结果显示,与野生型拟南芥相比,转GhACO2基因拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性显著性的增强。研究结果为进一步探讨GhACO2的生物学功能和利用基因工程技术进行转基因育种质奠定了基础。