植物RNA干扰的研究进展

RNA干扰(RNA interference。RNAi)是利用双链RNA(dsRNA)特异性地降解相应序列的mRNA,从而特异性地阻断相应基因地表达.在过去10年中,RNA干扰及相关沉默反应的机制研究取得了重大进展, RNAi也发展成为一种强有力的实验工具,用来控制目的基因的表达以获取预期的生物表型。本文详细综述了近年来RNA干扰机制方面的研究进展及RNA干扰在植物中的应用进展。     

RNAi技术在植物改良中的应用

RNA干扰是一种高效的、序列特异的基因沉默现象。文章介绍RNAi技术的研究简史及作用机制，以及在改良植物的体系结构、培育不育系、调控植物的颜色和香味、延长果实的货架期和在无核果实中的研究进展供这一领域的研究者作参考。     

RNA干扰技术在小麦中的应用研究进展

小麦是六倍体,其染色体组中存在着大量的同源基因,其育种的主要目标是获得可遗传的优良性状.RNA干扰(RNAi)是指由双链RNA介导的转录后基因沉默.该技术具有两大特点:一是可同时沉默多基因家族及多倍体中的同源基因;二是其沉默效应可在后代中稳定遗传.这使得RNAi在小麦功能基因组学和品质改良研究中的应用具有独特优势.本文对RNAi在小麦功能基因组学和品质改良研究中的应用及研究进展进行了总结,指出了目前存在的问题,并阐明了RNAi在小麦研究中的应用前景.     

应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体

RNA干扰是近年来生物技术领域新兴的研究热点之一。在作物的研究中,RNA干扰被认为在作物品质改良中具有重要的应用价值,并已在水稻、小麦、玉米等作物中得到成功应用,但在大豆的研究中尚鲜有报道。在研究植物RNA干扰的实验中,构建相应的RNA干扰表达载体是常用手段,但传统构建方法较费时费力。重组PCR是一种利用重叠延伸的方法进行高效和快速的体外基因片段拼接的PCR技术。研究将重组PCR技术应用于构建大豆脂肪氧化酶基因ihpRNA干扰表达载体,一方面探索一条更简便、快捷、适应范围更广泛的大豆基因RNA干扰表达载体构建方法,另一方面所构建的载体为进一步研究RNA干扰在大豆脂肪氧化酶改良中的应用奠定了基础。结果显示应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体是可行的,相比与常规方法此方法更简便、快捷、效率更高。     

RNA干扰技术及在植物抗病研究中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是一项基因沉默新技术,自20世纪90年代被发现以来,现在已逐渐成为分子生物学和细胞生物学研究的有用工具之一.目前该技术已被广泛应用到植物功能基因组研究和植物抗病毒病研究中,在抗线虫病研究中应用较少.现综述了RNAi的分子机制、基因沉默的主要类型以及该技术在植物抗线虫病和抗病毒病研究中的应用.     

大豆7S蛋白β亚基基因RNAi表达载体构建

以大豆7S蛋白β亚基基因为靶基因(基因编号:AB030840),利用RT-PCR克隆得到大豆7S蛋白β亚基基因核心序列398 bp,构建了以抗除草剂基因BAR为筛选标记的安全植物RNAi表达载体BAR-7αp-β.分子生物学检测表明7S蛋白β亚基基因的表达载体构建成功.研究结果为应用RNA干扰技术降低大豆过敏原,提高大豆蛋白品质奠定了基础.     

RNAi研究及在植物中的应用

RNAi（RNA interference）技术可通过降解靶基因的mRNA进行基因干涉，是研究多种生物基因功能的有效手段。概述了RNAi的作用机制、特点及其植物RNAi载体的构建。同时介绍了RNAi在植物的基因功能、抗病性、雄性不育等方面的应用。     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因RNAi载体的构建

采用PCR技术扩增得到胰蛋白酶抑制剂KTi基因正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GUS基因片段,将其分别连入克隆载体pMD18-T Vector中.然后以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,通过AHLG作为中间载体,根据RNAi原理将组成RNAi 结构的4个目的片段分别连入其中,成功构建了种子特异性RNAi表达载体p1301-KTiRi.研究结果为RNAi技术在大豆品质改良中的应用提供了基础.     

利用RNA干扰技术提高大豆脂肪含量

利用冻融法将大豆11S球蛋白GY1基因RNA干扰表达载体转入农杆菌EH105中,以大豆"吉农28"为受体,通过农杆菌介导的大豆子叶节转化法导入大豆,获得T1代转基因苗12株,并对得到的转基因植株进行分子生物学鉴定。PCR和Southern杂交检测表明,RNAi植物表达载体p3301-Gy1已成功插入到转基因大豆植株的基因组DNA中;RT-PCR和SDS-PAGE检测结果表明RNA干扰在转录后水平发挥了作用,11S球蛋白表达含量降低;利用BUCHI N-500型近红外谷物分析仪对转化的大豆蛋白质和脂肪含量进行检测,结果转化植株的籽粒蛋白质含量(36.07%)平均降低1.43个百分点,脂肪含量(21.28%)平均提高0.76个百分点。因此,利用RNA干扰技术提高大豆脂肪含量是可行的。     

RNAi研究及在植物中的应用

RNAi(RNA interference)技术可通过降解靶基因的mRNA进行基因干涉,是研究多种生物基因功能的有效手段.概述了RNAi的作用机制、特点及其植物RNAi载体的构建,同时介绍了RNAi在植物的基因功能、抗病性、雄性不育等方面的应用.     

根结线虫16D10基因与花生FAD2基因RNAi载体构建

针对根结线虫16D10基因和花生△12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因的核酸序列设计了两条含有GUS内含子的RNA干扰结构序列.以pBS-T质粒为中间载体,将这段序列连接进植物转化载体pRI 101-AN中,获得针对两个基因的RNAi载体.经SalI和KpnI双酶切验证,目的序列已准确插入目标载体.此载体可用以培育抗根结线...     

南方根结线虫Mi-eft2基因RNAi沉默效应研究

以南方根结线虫延长因子2基因(Mi-eft2)T克隆质粒为模板,克隆该基因的3个部分片段(各200 bp),作为体外合成ds RNA的模版,利用该ds RNA(F1ds,F2ds,F3ds)干扰南方根结线虫2龄幼虫(J2)的Mi-eft2表达。结果显示,利用real-time PCR作为检测方法,干扰处理后的J2线虫Mi-eft2的表达量(F1、F2、F3),与对照处理的J2线虫Mi-eft2的表达量(F0)相比,分别降低了21%、69%、0.02%。将经过干扰处理的J2线虫和作为对照处理的J2线虫(500头/株)分别接种5株番茄,培养45 d后观察表型。发现干扰处理后J2线虫与对照处理的J2线虫接种番茄后产生的根结数相比较,分别减少了57.09%、68.94%、7.01%。说明Mi-eft2表达的沉默效应会使南方根结线虫对番茄造成的危害程度相应降低,也说明了利用RNAi干扰该基因表达的方法有利于对南方根结线虫病害防治方法的探索。     

番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建

为研究广谱抗环斑病毒（PRSV）海南株系转基因番木瓜育种方案,采集海南番木瓜各主要种植区的PRSV株系,以外壳蛋白（CP）、辅助成分－蛋白酶（HC-Pro）和复制酶（Nib）基因作为靶标基因,通过序列比对和运用Clustalx软件分析,得到干扰基因的保守区域和挑选出海南PRSV典型株系的代表样品。以pUCCRNAi为骨架质粒,利用代表样品的CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi发夹结构,将发夹结构导入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体,构建出抗PRSV植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。实验将PRSV不同株系保守序列的分析与RNAi的高效抗病设计理念相结合,可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。     

块根特异启动的木薯SBE I、SBE Ⅱ基因 RNAi载体的构建及鉴定

利用基因重组技术,分别克隆木薯SBEⅠ基因ORF中的494 bp的片段和SBEⅡ基因ORF中的340 bp的片段;并通过重叠延伸PCR方法,扩增融合SBEⅠ、SBEⅡ基因片段的大片段SⅢ,将其正向、反向插入植物RNAi表达载体pART27中,同时克隆块根特异性启动子取代原来载体上自有的35S启动子,构建块根特异启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体Sp-pRNAiSⅢ,为后续培育高直链淀粉含量的木薯新品种等实验打下基础。     

草莓NCED基因正反义表达载体和RNAi载体的构建

根据草莓（Fragaria ananassa Duch）NCED基因序列（GenBank： HQ399498），克隆NCED基因开放阅读框，将该片段插入植物表达载体pBI 121的CaMV 35S 启动子和NOS 终止子之间，构建了正义表达载体pBI 121NCED。克隆NCED基因正义、反义片段和作为内含子的gusA基因片段，以植物表达载体pBI 121为基础，以pCAMBIA2301作为中间载体，通过多次酶切和连接，成功构建了草莓NCED基因RNAi表达载体pBI 121NCEDRNAi和反义表达载体pBI 121NCEDF。经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后，成功将pBI 121NCED、pBI 121NCEDF和pBI 121NCEDRNA 3个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中。研究结果为进一步研究草莓NCED基因的功能奠定了基础。     

块根特异启动的木薯SBE Ⅰ、SBE Ⅱ基因RNAi载体的构建及鉴定

利用基因重组技术,分别克隆木薯SBEⅠ基因ORF中的494 bp的片段和SBEⅡ基因ORF中的340 bp的片段;并通过重叠延伸PCR方法,扩增融合SBEⅠ、SBEⅡ基因片段的大片段SⅢ,将其正向、反向插入植物RNAi表达载体pART27中,同时克隆块根特异性启动子取代原来载体上自有的35S启动子,构建块根特异启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体Sp-pRNAiSⅢ,为后续培育高直链淀粉含量的木薯新品种等实验打下基础。     

基于RNAi技术转移脂肪酸延长酶基因fae1 及转基因油菜的获得

通过构建RNAi载体抑制油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）表达，获得了油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）功能缺失突变体。经酶切及序列测定证实，成功构建完成油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）反向重复结构RNAi载体；通过农杆菌介导的油菜转化，经RCR及印染检测，获29个油菜转基因再生株系。     

及转基因油菜的获得

通过构建RNAi载体抑制油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）表达，获得了油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）功能缺失突变体。经酶切及序列测定证实，成功构建完成油菜脂肪酸延长酶基因（fae1）反向重复结构RNAi载体；通过农杆菌介导的油菜转化，经RCR及印染检测，获29个油菜转基因再生株系。     

甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的转化

植物中具有A20/AN1锌指结构域的蛋白参与了逆境应答,为研究甘蔗A20/AN1型锌指蛋白基因ShSAP1的功能及在甘蔗抗逆育种方面的价值,本研究通过构建ShSAP1基因的RNAi载体并进行甘蔗的遗传转化,以期通过反向遗传学进行ShSAP1的功能分析。将ShSAP1锌指编码区片段分别以正向和反向插入到中间载体pTCK303内含子的两侧,构建中间载体pTCK-iShSAP1,而后把干扰片段连入pCAMBIA-GUS中,获得RNAi表达载体pCAMBIA-iShSAP1,将该载体转导根癌农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法侵染甘蔗胚性愈伤组织,并对部分转化幼苗进行了初步的PCR鉴定。经过限制性内切酶分析和测序验证,RNAi载体pCAMBIA-iShSAP1构建成功;转化幼苗经PPT抗性筛选后,获得了58株抗性植株,对抗性幼苗进行了Bar基因的PCR检测,得到6株PCR阳性植株。本研究完成了ShSAP1的RNAi载体构建及对甘蔗的遗传转化,为ShSAP1的功能研究打下了一定的基础。     

籼稻背景下抑制不同ALK等位基因表达对稻米品质的影响

【目的】稻米糊化温度是影响稻米品质的重要指标，该性状受主效基因ALK/SSII-3调控，ALK基因具有多个复等位基因，本研究旨在通过RNAi技术明确籼稻亚种中两个不同ALK等位基因的效应。【方法】以分别含有ALKc和ALKb等位基因的高糊化温度品种珍汕97B和低糊化温度品种龙特甫B为试验材料，使用RNAi技术构建ALK表达下调的转基因株系，通过对其稻米理化品质的测定来明确不同等位基因表达下调对稻米品质的影响。【结果】对不同转基因水稻目的基因的表达分析显示本研究中转基因株系的ALK基因受到了不同程度的干扰。重点分析了不同RNAi株系稻米的糊化温度，结果表明珍汕97B的RNAi转基因稻米的糊化温度极显著降低，而在低糊化温度品种龙特甫B背景中下调表达ALK基因后对糊化温度的影响较小；转基因株系与未转化亲本相比，米粉的起始糊化温度都显著降低，表现为提前糊化；在珍汕97B背景下干扰系的峰值温度与未转化亲本相比极显著降低，而在龙特甫背景下米粉的峰值温度与未转化对照相比显著降低。对不同转基因系的理化品质分析表明，ALK下调表达植株稻米的表观直链淀粉含量显著增加，下调表达ALK后会引起米粉峰值黏度和崩解值的改变。高糊化温度品种珍汕97B干扰系与未转化对照相比胶稠度呈现极显著性差异，而低糊化温度品种龙特甫干扰系的胶稠度与未转化对照相比没有差异。【结论】下调表达ALK等位基因对稻米理化品质产生显著影响，并且干扰不同等位基因的效应存在明显差异，即籼稻中的两个ALK等位基因的效应存在显著差异。