柑橘叶片蛋白质高效提取与溃疡病PthA蛋白Western blot分析

利用三氯乙酸-丙酮法、Tris-HCl提取法、改良的PBS法对柑橘叶片进行蛋白质提取比较研究, 发现改良的PBS法提取蛋白质，不仅提取效率高, 质量好，浓度高，而且杂质干扰较少, 技术操作简单。通过研究确定了一套适用于柑橘叶片蛋白质的提取、定量、凝胶制备、电泳、转膜、封闭、抗体孵育以及显色的Western blot方法。 利用这一方法对转pthA-nls基因的糖橙、转pthA-nls基因的冰糖橙叶片蛋白质进行了研究，发现与抗柑橘溃疡病相关的蛋白PthA在48 kD成功表达。     

柑橘溃疡病生物防治技术研究进展

柑橘是我国重要经济作物,且广泛种植于世界其他国家,为各种植地区带来不小的经济效益。然而柑橘经常会遭受到病虫害等侵袭,柑橘溃疡病便是其中较频发的一种。该病对植株造成枯枝落枝、树势衰弱等严重伤害,并使果实产生病疤,品质降低,更甚者会导致果实脱落,产量下降,影响种植户的经济收入,且使得整体柑橘产业发展迟滞。当前已有化学、生物、物理等多种类防治方法,有效抑制了柑橘溃疡病的扩散,但该病尚无法得到根本性的控制。本文总结了几类常用的柑橘溃疡病生物防治技术,并对柑橘溃疡病生物防治技术未来趋势进行展望,以期能为柑橘溃疡病的防治做出贡献。     

Western blot检测家兔动脉组织蛋白质表达条件的优化

蛋白质免疫印记技术是研究和分析蛋白质的重要手段,由于其步骤繁杂、影响因素众多,常出现背景噪音高、非特异条带多、拖尾等问题,严重影响后续蛋白质定量分析。为建立最佳的检测家兔动脉组织中蛋白质表达的蛋白质免疫印记技术实验条件,以家兔动脉组织血管细胞粘附分子-1为目标蛋白,从电泳条件、抗体浓度、抗体孵育时间、温度及方法、免疫显色方法等方面进行了改良,成功建立了快速、灵敏、特异的蛋白质免疫印记技术体系;并比较了3种常用的酶免疫显色技术：3,3’-二氨基联苯胺（3,3’-diaminobenzidine,DAB）显色、增强化学发光法（enhanced chemil luminescence,ECL）X光片曝光及ECL化学发光冷却电感耦合成像系统（cooled charged-coupled device,CCD）成像的敏感性。结果表明ECL化学发光法比DAB显色法敏感性高出2～10倍,其中CCD系统敏感性高于X光片4倍,且操作简便,是最理想的检测方法。     

Western blot检测家兔动脉组织蛋白质表达条件的优化

蛋白质免疫印记技术是研究和分析蛋白质的重要手段,由于其步骤繁杂、影响因素众多,常出现背景噪音高、非特异条带多、拖尾等问题,严重影响后续蛋白质定量分析。为建立最佳的检测家兔动脉组织中蛋白质表达的蛋白质免疫印记技术实验条件,以家兔动脉组织血管细胞粘附分子-1为目标蛋白,从电泳条件、抗体浓度、抗体孵育时间、温度及方法、免疫显色方法等方面进行了改良,成功建立了快速、灵敏、特异的蛋白质免疫印记技术体系;并比较了3种常用的酶免疫显色技术:3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)显色、增强化学发光法(enhanced chemil luminescence,ECL)X光片曝光及ECL化学发光冷却电感耦合成像系统(cooled charged-coupled device,CCD)成像的敏感性。结果表明ECL化学发光法比DAB显色法敏感性高出2～10倍,其中CCD系统敏感性高于X光片4倍,且操作简便,是最理想的检测方法。     

柑橘溃疡病的发生与防治

柑橘溃疡病是柑橘的主要病害之一,为国内外植物检疫对象,是一种细菌性病害.前几年在我县发病较少,近年来由于气候、管理等多方面因素,溃疡病普遍发生,据调查,2002年我县发病率达29%,最高的橘园达89%.     

铜铵合剂防治柑橘溃疡病

药效试验表明,铜铵合剂对柑橘溃疡病有明显的防治效果,对锦橙夏秋梢溃疡病的防治效果分别达85. 92%和90. 45% ,且使用安全,原料简单,配制方便,成本低廉。     

玉溪市柑橘溃疡病的发生与防控

柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞柑橘属亚种引起的致病力最强、蔓延最广泛的危害柑橘产业的重要细菌性病害,被列为国内外检疫对象。近年随着冰糖橙、茂谷柑、沃柑种植面积的不断扩大,云南玉溪市柑橘溃疡病的发生逐年增加。2014—2018年,我们对柑橘溃疡病发生进行监测,分析其发生规律和特点,开展防治技术研究,并有针对性的提出了综合防治对策。     

柑橘溃疡病防治研究进展

从农业防治、化学防治和生物防治3个方面综述了国内外有关柑橘溃疡病的防治方法的研究进展,讨论了各方法在柑橘溃疡病防治中存在的一些问题,并对未来防治该病的前景做出了展望。     

噻唑锌防治柑橘溃疡病试验

田间试验结果表明,20%噻唑锌悬浮剂对柑橘溃疡病具有良好的防治效果,300倍和500倍使用对果实的防效可以达到80.00%和75.67%。针对柑橘溃疡病的发生特点,提出防治柑橘溃疡病的药剂应适当考虑用有机锌类杀菌剂（如噻唑锌）,与目前常用的代森锰锌类和铜制剂进行轮换。     

钙对枳生长发育及柑橘溃疡病抗性的影响

【背景】柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的细菌性病害,可侵染枝、叶、果,危害几乎所有的柑橘主栽品种。前期对湖南省39个柑橘园的调查结果显示柑橘果园土壤酸化和交换性钙缺乏严重,叶片中均存在钙缺乏现象。钙是植物所需大量元素之一,钙缺乏会造成植物营养失衡,生长势下降,植物免疫水平受影响。然而,钙元素对柑橘溃疡病抗性的影响尚不明确。【目的】分析对柑橘溃疡病敏感的枳(Poncirus trifoliata)在不同钙浓度处理下叶片注射接种Xcc后的致病差异,探讨钙在Xcc侵染枳叶片过程中的作用。【方法】采用沙培法对枳实生苗进行0、0.75、3、30 mmol·L^-1钙浓度处理,分别测定枳生长期的生物量、叶绿素a和b浓度、根系和叶片钙元素含量、观察根系活性氧(ROS)的产生和胼胝质沉积,并分析枳叶片接种Xcc后细胞壁合成相关基因及免疫途径相关基因诱导表达变化特征。【结果】以3 mmol·L^-1钙处理为对照,0、0.75和30 mmol·L^-1钙处理后,...     

Western blot detection of PMI protein in transgenic rice

Phosphomannose isomerase(PMI)encoding gene manA is a desirable selective marker in transgenic research.Understanding of its expression patterns in transgenic plant and establishing highly sensitive detection method based on immunoassay have great impacts on the application of PMI.In this study,PMI-specific monoclonal antibodies were generated using recombinant protein as immunogen,and could be used in Western blot to detect as little as 0.5 ng His-tagged PMI protein or rice expressed PMI protein in sample accounted for 0.4%of single rice grain(about 0.08 mg).PMI protein driven by CaMV-35S promoter was detected in dozens of tested tissues,including root,stem,leaf,panicle,and seed at all developmental stages during rice growing,and PMI protein accounted for about 0.036%of total protein in the leaves at seedling stage.The established method potentially can be used to monitor PMI protein in rice grains.     

苹果树腐烂病发生与叶片营养成分的关系

【目的】明确苹果树腐烂病发生程度与树体营养之间的关系,为苹果树腐烂病的防治提供理论指导。【方法】在陕西省苹果主产县白水县选取苹果树腐烂病发生程度不同的24个果园,调查苹果树腐烂病发生程度,测定发病叶片氮、磷、钾元素含量,研究苹果树腐烂病发生与叶片营养成分的关系。【结果】树体营养水平与苹果树腐烂病发生程度有明显相关性:单因子回归分析显示,当叶片K含量9mg/g时,叶片K含量与腐烂病的发生程度呈极显著的负相关关系;多元回归分析显示,N、P、K元素间平衡与腐烂病发生程度关系密切,病情指数与N/K和P/K均呈极显著正相关关系。增施钾肥能提高叶片钾含量,使病斑扩展明显变慢,表明提高钾含量能够提高寄主抗腐烂病菌扩展能力。【结论】从控制苹果树腐烂病角度认为,果园叶片钾含量至少应该≥9mg/g,氮钾比小于2.5,磷钾比小于0.25。     

柑橘油的提取及应用研究

柑橘油是一类重要的天然化合物。报道了柑橘油的提取方法与实际应用等方面的研究进展。     

橘皮中果胶提取工艺研究

以橘皮为原料,用草酸铵萃取高价铁盐沉析法提取果胶。先通过单因素试验探讨草酸铵浓度、提取温度、提取时间、料液比等单因素对橘皮中果胶提取效果的影响,再在该基础上进行L9(34)正交试验,确定橘皮中果胶提取的最佳提取工艺。结果表明:橘皮中果胶提取的最佳提取工艺为:草酸铵浓度0.7%,料液比1∶20,提取时间90 min,提取温度80℃,此条件下果胶的提取率为4.4%。     

柑橘黄酮类化合物提取纯化方法的研究进展

黄酮是柑橘中最主要的活性成分。介绍了近年来柑橘黄酮类化合物提取方法 (碱提取酸沉淀法、有机溶剂法、微波法、酶解法、超临界流体萃取法、超声波提取法),分离纯化方法 (柱层析法、薄层层析法、高速逆流法、大孔树脂吸附法)的研究进展,为柑橘黄酮类化合物的研究和开发与应用提供参考。     

柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

 【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白（CP）基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒（CTLV）分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714 nt, 推导的CP含237个氨基酸。CP核苷酸序列及推导的氨基酸序列最大相似性分别为88.5％～99.9％和91.1％～99.6％。与核苷酸序列G289→A或C、A409→C和G414→T的单碱基突变相对应,CTLV外壳蛋白第97、137、138位氨基酸在强、弱毒分离物之间存在差异,多数弱毒分离物为Q97或K97、Q137、H138,而多数强毒分离物为E97、R137或K137、Q138。在根据CP氨基酸序列构建的系统进化树上,本研究获得的18个CTLV分离物至少可以划分为2个组群,其中,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在第Ⅰ组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物划分在第Ⅱ组群。【结论】CTLV外壳蛋白基因相对保守,其第289、409、414位碱基在强、弱毒分离物之间存在差异,可能与病毒致病性相关。     

Complete genome sequence analysis of two Citrus tatter leaf virus(CTLV) isolates from China

In order to understand molecular characterization of Citrus tatter leaf virus(CTLV) isolated from China,full-length cDNAs of CTLV-MTH and CTLV-XHC from Citrus reticulata and Citrus sinensis were cloned and sequenced based on whole-genome amplification by RT-PCR.The complete nucleotide sequences of CTLV-MTH and CTLV-XHC were determined to be 6497 nucleotides in length and shared 79.9-91.0%and 78.8-98.0%nucleotide sequence identity,respectively,with other Apple stem grooving virus(ASGV) or CTLV strains available in GenBank.Unexpectedly,CTLV-MTH showed the highest nucleotide sequence identity(91%) with an apple isolate of ASGV,followed by 86.5%with ASGV-HH and 85.7%with ASGV-CHN.Furthermore,CTLV-MTH and three ASGV strains were grouped to a separate cluster in the phylogenetic tree,suggesting it has a closer relationship to ASGV than to CTLV.Therefore,it can be concluded roughly that CTLV may be not a distinct strains of ASGV.We proposed that Citrus tatter leaf virus should be renamed Apple stem grooving virus.     

苹果褪绿叶斑病毒的分子杂交检测

[目的]探索检测苹果褪绿叶斑病毒的技术体系。[方法]利用CTAB法提取感病苹果叶片总RNA,以总RNA为模板,利用特异性引物,建立利用cDNA探针检测苹果褪绿叶斑病毒的技术体系。[结果]扩增出了预期片段,经克隆、测序证明该片段为苹果褪绿叶斑病毒的特异性片段。以带有特异片段的质粒为模板,利用PER技术制备出地高辛标记的cDNA探针。[结论]以质粒为模板可高效制备大量探针。地高辛标记探针为非放射性标记探针,安全性较好,灵敏度较高,具有重要的应用价值。     

芦柑皮中果胶提取研究

[目的]研究从芦柑皮中提取果胶的最佳方法。[方法]以烘干的芦柑皮粉末为原料,采用酸水解乙醇沉淀法提取果胶,并应用L9(34)正交试验对提取条件进行了优化。[结果]确定最佳提取条件为pH 2.0、提取温度80℃、提取时间70 min、料液比1∶30 g/ml,在此条件下果胶平均得率为16.60%,果胶纯度为87.6%,甲氧基果胶含量为76.8%。[结论]为芦柑皮的综合利用和我国果胶自主生产提供了参考。