硒对氟中毒雏鸡肝脏细胞色素P450酶系主要亚型的影响

本试验旨在研究硒对氟中毒雏鸡肝脏细胞色素P450酶系主要亚型活性(含量)的影响及CYP3A37基因转录情况.选取180羽7日龄健康雏鸡,随机分为3组,分别为正常组、氟中毒组和加硒组.正常组饲喂全价日粮;氟中毒组在正常日粮中添加氟化钠(NaF),使日粮中氟含量为1 000 mg·kg-1;加硒组在氟中毒组日粮基础上添加亚硒酸钠(Na2SeO3),使日粮中硒含量为4 mg·kg-1.分别在第30、60、90天从各组随机选取20羽鸡,采用比色法测定P450酶系主要亚型活性(含量),利用RT-PCR方法测定CYP3A37 mRNA转录水平的变化.在添加氟化钠后第30天,氟中毒组除细胞色素P450含量和氨基比林-N-脱甲基酶(AND)活性低于正常组外,其余各酶活性(含量)较正常组均有增加(P<0.05);在加硒组中,除NADPH-细胞色素C还原酶和苯胺-4-羟化酶活性低于氟中毒组外,其余各哑型酶活性(含量)均高于氟中毒组(P<0.05).第60天时,氟中毒组酶活性(含量)均极显著高于正常组(P<0.01);在加硒组中,除NADPH-细胞色素C还原酶和氨基比林-N-脱甲基酶活性略高于氟中毒组外(P>0.05),其余各亚型酶活性(含量)均极显著低于氟中毒组(P<0.01).第90天时,氟中毒组除细胞色素P450含量略高于正常组外(P>0.05),其余各亚型酶活性(含量)均极显著低于正常组(P<0.01);加硒组中细胞色素P450含量和NADPH-细胞色素C还原酶活性略低于氟中毒组,其余各亚型酶活性(含量)均高于氟中毒组.在各时间点氟中毒组CYP3A37 mRNA转录水平均明显高于正常组(P<0.01);加硒组中mRNA转录水平介于氟中毒组和正常组之间.结果提示,饲料中添加氟化钠和亚硒酸钠可使鸡肝脏细胞色素P450酶系各亚型活性(含量)及CYP3A37 mRNA转录水平发生明显变化.     

猪肝微粒体中细胞色素P450 CYP2A19和CYP1A的分离

细胞色素P450为一类蛋白质超家族,在许多化学物质的生物转化中起重要作用,如纯化的CYPs可用于结构的研究或测定药物的代谢途径。本研究中,猪肝微粒体细胞色素P450（CYP）经octylamino琼脂糖和羟基磷灰石柱层析,纯化出CYP1A和CYP2A19两种CYPs。经Western blotting鉴定,抗大鼠和人的CYP1A2抗体能识别猪cYP1A;抗人的CYP2A6抗体能识别CYP2A19。     

家蚕细胞色素P450 CYP337A1的原核表达

以含有CYP337A1基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板进行PCR扩增,产物经TA克隆测序鉴定后,亚克隆至原核融合表达载体PET50（b）（含有编码64．3kD的Nus．Tag蛋白标签）中,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达。利用SDS-PAGE方法,以空载和未诱导菌体作对照,对细菌总蛋白进行电泳分析,结果表明：经1mmol／L IPTG诱导2h后,即能看到1条大约120kD的蛋白质特异带,与预计大小一致。进一步利用不同时间、不同温度以及不同浓度的IPTG进行诱导结果比较,发现在诱导时间为2h,温度为32℃,IPTG浓度为0．6mmol／L的诱导条件下,融合蛋白表达量最大。该实验为利用该基因的蛋白产物进行功能分析创造了条件。     

兽药对猪肝细胞CYP450酶系影响的研究进展

细胞色素P450酶系是一类参与机体内内源性和外源性物质以及药物的代谢的血红蛋白酶类,目前对于研究食品性动物猪的细胞色素P450酶的研究比较少,但是却越来越受到人类重视。研究兽药对于猪的细胞色素P450的影响,对指导兽医临床上合理用药、防止兽药相互作用、新型兽药设计以及其剂型改进、种属外推用药、兽药残留消除分析及人类食品安全评价,都具有十分重要的意义。     

地塞米松和利福平对鸡肝CYP450酶系的影响

采用体外肝微粒体酶生化测定方法,研究地塞米松(DEX)和利福平(RFP)对鸡细胞色素P450酶系的影响。将36羽公鸡随机等分为对照组(生理盐水)、DEX处理组(5 mg.kg-1,腹腔注射7 d)和RFP处理组(15 mg.kg-1,口服7 d),第8天处死实验动物,提取肝微粒体,进行微粒体酶活性分析。结果显示:与对照组相比,DEX组相对肝重、肝微粒体蛋白浓度、细胞色素P450总含量和红霉素-N-脱甲基酶(ERND)的活性均显著升高(P<0.01),而RFP组各项指标没有统计学意义(P>0.05)。结果提示:腹腔注射地塞米松对鸡肝CYP450产生明显诱导作用,口服给予利福平对鸡肝CYP450无明显诱导作用。     

野桑蚕细胞色素P450基因CYP9A20V1的克隆与序列分析

研究和比较家蚕与野桑蚕细胞色素P450基因的结构和功能,可从分子生化机制上探索家蚕对农药的抗性。基于此,利用RT-PCR方法从野桑蚕中肠组织中克隆了一个P450家族基因CYP9A20V1(GenBank登录号:FJ378716)。序列分析表明,该基因的开放阅读框(ORF)为l 596 bp,编码531个氨基酸,预测分子质量约61.4 kD,等电点8.1。在线Blast分析结果表明:野桑蚕CYP9A20V1基因与家蚕CYP9A20的同源关系最近,同源性达到98.7%;与棉铃虫CYP9A12基因的同源性也达到57.1%。根据已知的P450蛋白序列结构进行比较分析,野桑蚕CYP9A20V1与家蚕CYP9A20编码氨基酸序列在底物识别位点SRS1、SRS2、SRS4、SRS6区域完全相同,在SRS3和SRS5区域的同源性分别是88.9%和94.1%,推测这2个基因具有相同的底物识别能力;野桑蚕CYP9A20V1与棉铃虫CYP9A12在SRS1、SRS4、SRS5、SRS6区域的同源性分别为47.1%、88.2%、76.5%和60%,在底物识别区域的同源性较高。初步推测野桑蚕CYP9A20V1基因可能与抗除虫菊脂类农药有关。     

锰中毒诱导鸡肝细胞凋亡及细胞内Fas基因mRNA转录分析

为初步探讨染锰对公鸡肝细胞凋亡的影响,将400只50日龄海兰褐公鸡随机分为4组,分别在饲料中添加0、600、900、1 800 mg·kg~(-1) MnCl_2建立亚慢性锰中毒模型,于染毒第30、60、90天采取肝脏观察肝细胞形态学变化,检测肝细胞凋亡指数以及分析Fas mRNA的转录水平.结果显示,在第90天时,高剂量组与对照组相比,锰中毒诱导出现典型凋亡形态变化,随着染毒剂量的升高,凋亡细胞的数量逐渐增多;不同时间点,随着染锰剂量的增加,Fas基因mRNA转录水平基本呈升高趋势.     

微量菊酯类农药对家蚕细胞色素P450酶9家族基因转录水平的影响

昆虫细胞色素P450酶广泛分布于各种需氧生物,是一类参与机体代谢解毒或代谢活化作用的超家族酶系。分析家蚕细胞色素P450酶基因表达对微量菊酯类农药的响应,有助于从分子水平阐释家蚕对农药的生理代谢机制,以及探讨细胞色素P450酶活性与家蚕对农药耐受性的关系。以对菊酯类农药耐受性不同的2个家蚕品种为材料,采用实时荧光定量PCR方法,检测分析2个家蚕品种5龄第3天幼虫添食微量(0.02 mg/L)氰戊菊酯后主要解毒组织中肠和脂肪体中3个P450酶9家族基因的转录水平变化及在品种间存在的差异,结果表明:敏感性家蚕品种Lan5的幼虫脂肪体组织中CYP9a19和CYP9a20基因m RNA的转录水平与对照组幼虫相比显著下调,在中肠组织中2个基因的转录水平变化不大,而CYP9a22基因m RNA在中肠和脂肪体中的转录水平均无显著变化;耐受性家蚕品种Mysore的幼虫中肠组织中CYP9a19和CYP9a22基因m RNA的转录水平与对照组幼虫相比均显著上调,CYP9a20基因m RNA在脂肪体组织中的转录水平也显著上调。研究结果提示:细胞色素P450酶9家族基因的转录水平变化,可能与家蚕不同品种对菊酯类农药的耐受性差异有关。     

小型猪肝脏细胞色素P450基因CYP3A29克隆与序列分析

设计引物通过RT-PCR扩增巴马香猪和贵州小型猪香猪药物代谢关键P450基因CYP3A29基因的全长编码区,纯化并克隆入pMD 18-T载体,通过序列测定和比对分析其序列变异情况。17头小型猪共发现CYP3A29基因的5个单核苷酸变异位点,均表现为同义替换,对编码的氨基酸序列无影响;猪CYP3A29的单核苷酸变异和品系相关,在不同品系中可表现出品系特有的单核苷酸变异;贵州小型香猪G3 a2902发现1个可变剪接,缺失89 bp并产生移码,改变编码蛋白。本研究克隆的巴马香猪和贵州小型香猪CYP3A29基因及其序列变异情况,可为其作为药物代谢模型的应用提供技术资料。     

Research Progress on Cytochrome P450 2E1

Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) is one of the body's metabolite of drugs and low molecular weight compounds mainly enzymes, and the increasing of activity or expression of CYP2E1 is closely related with the clinical variety of diseases. This paper reviews the research progress of protein structure, function, positioning mechanism and other aspects of genetic polymorphisms of CYP2E1 at home and abroad. Thereby the paper could lay the foundation for further exploration of the biological effects of CYP2E1 and its relationship with clinical disease.     

泰妙菌素对人CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6酶活性的影响

本研究通过建立人肝微粒体体外孵育试验,考察泰妙菌素对4种CYP450亚酶的探针底物睾酮、非那西丁、氯唑沙宗、氢溴酸右美沙芬代谢的影响,以反映泰妙菌素对人CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2D6酶活性的作用。试验分为3组：药物试验组、阳性对照组（不含NADPH）、阴性对照组（不含CYP450抑制剂）,孵育体系为100 μL,孵育试验在96孔板中进行。终止反应后使用高效液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS）,以内标法检测96孔板中孵育液的剩余探针底物浓度。根据药物试验组与阴性对照组的探针药物代谢浓度之比,计算药物试验组的探针药物代谢率。使用Graphpad Prism 6.0软件,以药物试验组相对代谢率为纵坐标,药物浓度对数值为横坐标作图,计算试验组药物IC₅₀值。针对泰妙菌素与CYP3A4的孵育试验设置多个孵育时间点观察孵育时间对IC₅₀值的影响。试验结果显示,酮康唑对CYP3A4的IC₅₀值为0.044 μmol/L,α-萘黄酮对CYP1A2的IC₅₀值为0.030 μmol/L、4-甲基吡唑对CYP2E1的IC₅₀值为0.022 μmol/L、奎尼丁对CYP2D6的IC₅₀值为0.096 μmol/L。泰妙菌素对CYP1A2及CYP2D6的IC₅₀值均大于50 μmol/L,对CYP2E1的IC₅₀值为0.045 μmol/L,对CYP3A4的IC₅₀值为1.609 μmol/L。延长泰妙菌素与CYP3A4的孵育时间（10~50 min）后,泰妙菌素对CYP3A4的IC₅₀值由1.609 μmol/L增加至 8.657 μmol/L。本研究中4种亚酶常用抑制剂的IC₅₀值与参照值相近,表明所建立人肝微粒体体外孵育试验方法可靠。以IC₅₀值为指标显示泰妙菌素对CYP1A2和CYP2D6无抑制作用,对CYP2E1和CYP3A4存在强抑制作用,泰妙菌素可能是CYP3A4的可逆性抑制剂。     

家蚕P450基因CYP305B1的基因组序列克隆及结构分析

为了研究家蚕P450基因CYP305B1的结构,采用反向PCR技术克隆了家蚕CYP305B1基因的基因组序列,经序列测定,拼接得到家蚕CYP305B1全基因序列,发现家蚕CYP305B1的第1内含子位于5′端非翻译区序列(5′-UTR)中间。将家蚕CYP305B1与野桑蚕P450基因CYP305B1V1序列进行同源性比较的结果表明,二者在5′-UTR上游-400～-770 bp序列间的同源性只有40.4%,序列差异最大的是第1内含子和第6内含子。在第1内含子中,野桑蚕CYP305B1V1在翻译起始密码ATG上游-340之前存在330 bp的插入序列,在-110～-340 bp间二者的同源性也只有46.9%;在第6内含子中,家蚕CYP305B1比野桑蚕CYP305B1V1多了一段约300 bp的插入序列。研究结果有助于进一步探究该基因的转录和调控机制。     

野桑蚕细胞色素P450家族CYP4M5基因的克隆和诱导表达

细胞色素P450单加氧酶系在生物体对外源化合物的代谢和内源化合物的调节中都起着非常重要的作用,昆虫对杀虫剂产生抗性与单加氧酶系介导的代谢反应有关。以野桑蚕(Bombyxmandarina)中肠为材料,依据家蚕(Bombyxmori)基因组P450基因预测序列设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆了一个P450家族基因的cDNA序列,命名为CYP4M5(GenBank登录号:EU273876)。序列分析表明,野桑蚕CYP4M5基因编码区长度为1 512 bp,编码503个氨基酸,相对分子质量约为58 kD,等电点7.8。同源性分析表明该基因与家蚕CYP4M5的同源性最高,达97.42%。分析鉴定了该基因在野桑蚕各组织中的mRNA表达水平以及溴氰菊酯诱导24 h后mRNA的表达水平,结果显示:在正常野桑蚕幼虫体内,CYP4M5在脂肪体中的表达水平最高;野桑蚕经5 ng/μL溴氰菊酯药液处理后,CYP4M5在中肠和脂肪体中表达量分别增加1.1倍和4.4倍。推测该基因可能参与野桑蚕对杀虫剂的解毒代谢作用。     

Analysis of polymorphisms of canine Cytochrome P 450-CYP2D15

Cytochrome P450 (CYP) proteins constitute a large ancient family of oxidative enzymes essential for the efficient elimination of a wide variety of clinically used drugs. Polymorphic variants of human CYP2D6 are associated with the conversion rate and efficacy of several drugs such as antidepressants. Polymorphisms of the canine orthologue CYP2D15 are of interest because these antidepressants are also used in dogs with behavioral problems and the outcome of the treatment is variable. However, the annotated CYP2D15 gene is incomplete and inaccurately assembled in CanFam3.1, hampering DNA sequence analysis of the gene in individual dogs. We elucidated the complete exon–intron structure of CYP2D15 to enable comprehensive genotyping of the gene using genomic DNA. We surveyed variations of the gene in four diverse dog breeds and identified novel polymorphisms in exon 2 in border collies. Further investigation to establish the impact of these canine CYP2D15 polymorphisms on interindividual variability in expression and function of this metabolizing enzyme is now feasible. Further knowledge of CYP pharmacogenetics will help individualize therapy and thereby increase therapeutic efficacy, especially in the use of antidepressants in veterinary behavioral medicine.     

中药对黄曲霉毒素B1引起肝损伤过程中细胞色素P450影响的研究进展

黄曲霉毒素Bl(AFBl)会对人和动物的肝脏产生损伤,还会引发肝癌。它还与其他致肝癌的因素,如乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染等协同作用而促进肝癌的发生和发展。AFBl可能通过影响DNA修复系统、药物代谢酶系统及细胞色素P450(CYP)代谢酶基因的异常表达导致肝癌的发生。有研究报道,许多中药能通过影响细胞色素P450酶而起到保护肝脏的作用。论文就黄曲霉毒素B1对肝损伤过程中P450代谢酶活性变化及一些中药显著降低AFB1诱发肝癌发生率的机制进行综述。     

家蚕细胞色素P450基因CYP6AE2的分子克隆与序列分析

为了在分子水平上研究家蚕(Bom byx mori)细胞色素P450基因的特性,更好地探讨该基因与家蚕抗性的相关机制,依据已有的家蚕基因组数据,通过BLASTP比对,选择与抗性相关的6家族中含有预测基因数量最多的CYP6AE亚家族的1条序列,并设计1对引物,用RT-PCR方法克隆了家蚕细胞色素P450家族基因CYP6AE2(Gen-Bank登陆号:EF415296)。该基因的ORF为1 572 bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为60.2 kD,等电点为8.50。将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,结果表明该基因只有1个内含子;与已知的同亚家族基因CYP6AE1(欧洲防风草结网毛虫Depressaria pastinacella)、CYP6AE12(棉铃虫Helicoverpa armigera)编码的氨基酸序列比对,同源性同为53%。