BmNPV多角体蛋白片段引导外源蛋白固定入多角体的研究

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)晚期产生大量多角体,其主要作用是包埋病毒粒子免受外部恶劣环境的影响,为次代感染提供保障。将BmNPV多角体基因分段克隆并与报告基因——增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合,利用BmNPVPolh+Bac-to-Bac表达系统构建重组病毒,使多角体蛋白与融合蛋白在BmN细胞内共表达。分析感染细胞和形成的多角体中融合蛋白的含量,研究不同的多角体蛋白片段引导EGFP固定入多角体的效果,结果表明构建的5种重组病毒都能大量表达融合蛋白,每种多角体蛋白片段都能引导EGFP固定入多角体内部,且外源融合蛋白在多角体总蛋白中占有较高的比例,其中,以多角体蛋白N末端100个氨基酸和完整多角体蛋白序列作为信号固定EGFP的效率最高。这一现象为解决活性蛋白长期保存提供了新思路,同时对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体也具有较好的参考价值。     

BmNPV多角体对稳定转化细胞表达荧光蛋白的包埋现象初探

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体对外源蛋白的包埋特性,构建了含有绿色荧光蛋白基因(gfp)和红色荧光蛋白基因(DsRed)的表达载体pIZT-DsRed,用该载体转染家蚕卵巢细胞系(BmN),并以吉欧霉素(zeocin)筛选得到稳定表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的BmN细胞系。进一步以野生型BmNPV感染pIZT-DsRed转化BmN细胞,发现部分多角体可以发出绿色荧光和红色荧光,Western blot检测证明多角体中含有GFP蛋白,显示BmNPV多角体可以包埋进病毒粒子以外的其他蛋白成分,表明BmNPV多角体蛋白的包埋机制中存在非特异性识别包埋的现象。     

家蚕核型多角体病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表达及引导外源蛋白进入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。     

苜蓿尺蠖核多角体病毒对家蚕核多角体病毒在蚕体内复制的干扰

昆虫杆状病毒具有相对狭窄的宿主域.虽然苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)两者DNA序列的同源性在95%左右,但AcMNPV不能在家蚕细胞中很好的复制,对家蚕幼虫不具有致病能力,但其基因组中个别基因可在被接种该病毒的家蚕幼虫体内表达.这些基因的表达可能对共感染的优势病毒BmNPV复制所需原料蛋白及转录因子形成竞争,进而抑制BmNPV在家蚕幼虫体内的复制表达.     

家蚕核型多角体病毒gp41基因的融合表达及功能鉴定

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。     

利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统在BmN细胞中可溶性表达PRG-1蛋白

杆状病毒Bac-to-Bac表达系统由于操作简便等优点,被广泛应用于外源蛋白的表达。利用新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac系统可溶性表达一个大分子质量的融合蛋白———piwi相关基因编码蛋白PRG-1。为了提高目的蛋白的表达量,对重组病毒感染剂量及产物收获时间进行优化,并利用GST亲和层析纯化融合蛋白。结果表明在家蚕卵巢培养细胞BmN中表达的重组GST-PRG-1是可溶性蛋白;最佳的感染条件是病毒粒子对BmN细胞的感染复数(MOI)=1,并在感染后96 h收获细胞。试验结果表明,新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统可用于大分子蛋白的可溶性表达。     

利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染

尝试将红色荧光蛋白(RFP)作为昆虫表达体系的分子标签,克隆了rfp基因的读码框,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将该基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中,获得重组杆状病毒BmNPV-rfp。对家蚕细胞的感染表明,rfp适于在昆虫细胞中表达,在显微镜下红色荧光很明显,说明RFP可以作为杆状病毒表达的分子标签。BmNPV-rfp和另一种插入绿色荧光蛋白基因gfp的家蚕重组杆状病毒BmNPV-gfp混合感染家蚕细胞和幼虫的实验表明,二者的荧光很少在同一细胞中发生重叠,说明昆虫细胞大多只感受1次同一来源的病毒。BmNPV-rfp、BmN-PV-gfp与AcNPV混合感染Sf21细胞的结果也证明了该推断,并且还显示AcNPV可以协助BmNPV来源的病毒基因在Sf21细胞中表达以及协助病毒增殖或产生杂交病毒,但尚未明确其机制。     

BmCPV多角体蛋白对异源蛋白的包埋

为了解家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的多角体蛋白对异源蛋白的包埋作用,将BmCPV的多角体蛋白基因克隆至昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,转染家蚕卵巢培养细胞(BmN)后通过吉欧霉素(zeocin)筛选获得稳定表达多角体蛋白的细胞株。倒置荧光显微镜观察发现,转化BmN细胞有轻度的病理变化,细胞质中有呈绿色荧光的多角体蛋白结晶,但从转化BmN细胞中纯化的多角体无明显的绿色荧光。以修饰型线性化家蚕杆状病毒BmPAK6感染稳定转化BmN细胞,96 h后纯化多角体,回复感染显示多角体裂解液能感染家蚕BmN细胞,表明BmCPV多角体蛋白能包埋BmPAK6。纯化的多角体及多角体裂解液均能用X-gal显色,表明BmPAK6表达的β-半乳糖苷酶也能被BmCPV的多角体蛋白包埋。研究结果可为获得具有多角体的重组杆状病毒以及开发利用质型多角体蛋白包埋异源蛋白的功能提供新的技术途径。     

多角体蛋白基因核苷酸序列对HBsAg(PreS2+S)在家蚕中表达的作用

应用PCR突变的方法 ,在乙肝病毒表面抗原 (HBsAg)前S2序列的 5’端融合了BmNPV多角体蛋白基因5’端的 12个碱基 ,获得了融合乙肝表面抗原中蛋白基因 (HBMp) ;通过同源重组将其插入到BmNPV基因组多角体启动子后 ,构建了重组杆状病毒BmPAK HBMp。用重组病毒BmPAK HBMp和BmPAK HBM(带有非融合乙肝表面抗原中蛋白基因 )感染家蚕细胞及蛹 ,对两种病毒的表达产物用ELISA进行了跟踪检测 ,结果表明融合蛋白比非融合蛋白HBsAg活性提高了 6 0 %～ 80 % ,作为HBsAg构成部分的PreS2抗原性提高了 8～ 10倍 ;并且HBsAg和PreS2 Ag表达的时相曲线不同 ,PreS2 Ag的表达量比HBsAg早 1～ 2d达到最大值。ELISA检测和Westernblotting分析表明 ,多角体基因序列的存在更有利于中蛋白全基因 (PreS2 +S)的表达。     

家蚕BmVNCP基因表达与BmNPV感染增殖相关性的鉴定分析

为解析家蚕AN品系高抗BmNPV的分子机制,采用家蚕抗性品系AN与易感品种C108杂交及多代回交,结合累代BmNPV攻毒选择,构建了高抗BmNPV的近等基因系C108＿AN;在5龄起蚕经口添食BmNPV多角体1×10⁸ mL^-1悬浊液浸渍桑叶对C108及C108＿AN攻毒,对感染后12、24、36、48、60 h的中肠组织进行转录组测序发现,C108＿AN样本中检出BmNPV基因个数与表达量均大幅减少,病毒虽然能够侵染但不能完成复制;转录组中编码230 aa的家蚕病毒核衣壳蛋白基因(命名为BmVNCP)在C108＿AN样本中显著高表达,表明与BmNPV抗性可能具有关联性。在BmN细胞中过表达BmVNCP基因可以抑制BmNPV的增殖,在BmN细胞中进行靶向BmVNCP的CRISPR/Cas9基因编辑,未能观察到BmNPV增殖和vp39基因表达的稳定增加;BmN细胞内过表达BmVNCP基因可以明显提高宿主IMD信号通路中Dredd基因的表达水平,对FADD基因转录水平无影响,PGRP-LB和PGRP-LF基因表达量极低以致qRT-PCR无法检出。...     

CPA-LTB融合基因的构建与表达

利用PCR技术，从A型产气英膜梭菌染色体和pEWD299中分别扩增出a毒素（CPA）基因和LTB基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了含CPA—LTB融合基因表达质粒的重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实，构建的重组质粒pET—CPA含有CPA—LTB融合基因，其基因序列和阅读框架均正确。经EISA检测和SDS—PAGE分析，重组菌株表达的CPA—LTB融合蛋白能够被α、LT毒素抗体所识别。重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）经IPTG诱导后，融合蛋白CPA—LTB的表达量占菌体总蛋白相对含量的12.5％。     

表达无毒性大肠杆菌ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用基因突变技术，将形成ST1分子内二硫键的半胱氨酸碱基进行突变，使ST1失去本身毒性，进而将其与含有LTB基因的pET-28b( )连接，转化至受体菌BL21(DE3)，重组菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)经IPTG诱导后，其表达产物免疫的小鼠能够抵抗大肠杆菌强毒菌的攻击并且消除了ST1的毒性，表明构建的工程菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)可作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选菌株。     

猪流感病毒多表位融合蛋白对小鼠的免疫原性分析

作者拟利用表位多肽的抗原性及黏膜佐剂免疫增强作用,设计可通过黏膜途径免疫接种的猪流感病毒通用型疫苗.体外合成H1N1、H3N2亚型猪流感病毒表位抗原基因,C末端串联大肠杆菌热敏性肠毒素LTb基因,构建pET30(a)-ep-LTb表达载体,利用SDS-PAGE、Western blot分析重组融合蛋白表达及生物学特性,小鼠免疫试验分析融合蛋白免疫原性.SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约38 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白可与抗His-tag抗体和CTB抗体发生特异性反应.ELISA及HI试验检测,经黏膜途径免疫的小鼠产生了针对重组表位模拟抗原蛋白及H1N1、H3N2亚型猪流感病毒的血清抗体及局部黏膜分泌型IgA抗体.利用猪流感病毒表位抗原与LTb基因串连获得的融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,且在黏膜接种局部产生理想的分泌型IgA抗体,能有效阻断病原由黏膜局部感染,为研制猪流感病毒通用型疫苗奠定了基础.     

A型产气荚膜梭菌重组菌株BL21（DE3）

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含α毒素突变基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下α毒素突变基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因且基因序列和阅读框架正确。同时以IPTG为诱导剂诱导α毒素突变基因表达并对其表达条件进行优化。优化表达的结果是：培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5 h,此时重组菌株pXMCPA02蛋白表达量为35%。从而实现了α毒素突变基因的高效表达,为A型产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

Expression and Immunological Character Research of Three Kinds of Food-poisoning Vibrio Poly-recombinant Toxin Gene

In this study,tdh-vvhA-ctB was constructed using the flexible Linker sequence (Gly₄Ser) in order to construct three kinds of food-poisoning Vibrio poly-recombinant toxin gene and recombinant expression vector. The recombinant expression plasmid pET-22b(+)-TVC was constructed and expressed in prokaryotic expression vector. The animals were immunized using the expressed protein after purification to get serum antibody. The specificity and sensitivity of the antibody were verified by agar diffusion test and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The results showed that the recombinant expressing plasmid pET-22b(+)-TVC was constructed and expressed successfully in prokaryotic expression vector, the expression level was 11.38%. The expressed protein was mainly inclusion body and a small amount of soluble protein. The gene length was 2 196 bp, encoding 731 amino acids with molecular weight of 81.7 ku. The results were 99.6% homologous to the designed sequence. Agar diffusion reaction and ELISA tests indicated the poly-recombinant toxin TVC could product different immune intersect reaction with other food-poisoning Vibrios but not react with some no-objective bacteria. Expression plasmid of poly-recombinant toxin gene was constructed and serum antibody was prepared successfully. It might be used to check the objective toxin based on the poly-recombinant toxin gene and established the board-spectrum, quick, special detecting way to lay the theoretical and technical basis.     

3种中毒性弧菌融合毒素基因的表达与免疫学性质研究

为构建3种中毒性弧菌多联融合毒素基因及重组表达载体,制备多联融合毒素的血清抗体,本试验采用柔性Linker序列（Gly₄Ser）对目的基因进行串联（tdh-vvhA-ctB）,构建重组表达质粒pET-22b（+）-TVC并在原核表达载体内进行表达,将表达蛋白纯化后免疫动物制备多联融合毒素血清抗体,利用琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验验证抗体的特异性与敏感性。结果表明,试验成功构建了多联融合毒素重组表达质粒pET-22b（+）-TVC,并在原核表达载体内成功表达,表达量为11.38%,表达蛋白主要为包涵体,少量为可溶性蛋白,基因序列全长2 196 bp,编码731个氨基酸,蛋白分子质量为81.7 ku,测序结果与设计序列同源性为99.6%。ELISA和琼脂扩散试验表明,融合毒素TVC与3种目标中毒性弧菌均发生反应,与多种非目标菌均不反应。本试验成功构建了多联融合毒素基因的表达质粒并制备了抗血清,为利用重组毒素的方法检测目标毒素,进而建立更广谱的食物中毒菌快速检测方法奠定基础。     

The immunogenicity of fusion protein linking the carboxyl terminus of the B subunit of Shiga toxin 2 to the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin

To augment the immunogenicity of the subunit B of Shiga toxin (Stx2e B) produced by Escherichia coli and protect piglets from edema disease in china, a fusion gene was constructed consisting of Stx2e B genetically linked at the N-terminus of the B subunit of heat-labile enterotoxin (LTB) in a translational fusion. After being induced with IPTG, the expressed fusion protein of Stx2e B-LTB was about 8.8% of total proteins, approximately 13 microg/ml of the bacteria culture. The Stx2e B-LTB fusion protein was found to be nontoxic to Vero cells at the dose higher than 1 microg/ml and to mice less than 100 microg/ml. Antibody titer against the fusion protein Stx2e B-LTB was 1:76,800, much higher than that of the recombinant Stx2e B protein (1:12,800) alone. All of the mice immunized with the Stx2e B-LTB fusion protein survived when challenged with a lethal dose (LD) of Stx2e toxin. The results showed that the poor immunogenicity of Stx2e B was overcome by conjugating the stx2e B to ltB. The immunogenicity of the constructed fusion protein Stx2e B-LTB in the present study was highly qualified to protect animals against Shiga toxin produced from Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). The fusion protein of Stx2e B-LTB could be a candidate for a vaccine against edema disease and post-weaning diarrhea simultaneously in piglets.     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白与幽门螺杆菌铁蛋白基因融合PCR扩增及其真核表达载体的构建

为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌（Hp）铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。