黑豆多酚氧化酶的分离纯化及其酶学特性研究

试验用磷酸缓冲液提取黑豆粉中的多酚氧化酶,经30%～80%饱和硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、DE-52阴离子交换层析对黑豆多酚氧化酶进行分离纯化。酶学特性研究结果表明,在30 min以内,酶活与反应时间基本呈线性关系。在磷酸盐缓冲液中黑豆多酚氧化酶的最适pH为6.8,最适反应温度为50℃,最适底物浓度为0.1%。在供试浓度范围内,高浓度Cu2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Na+、Ca2+及抗坏血酸、EDTA、Na2SO3均是黑豆多酚氧化酶的抑制剂。     

枯草芽孢杆菌酸性内切葡聚糖酶的分离纯化及酶学性质

将来源于藏猪粪便的枯草芽孢杆菌BY-4菌株接种于含4%麸皮的产酶培养基中,37℃、220r/min培养48h,发酵上清液经HiTrap Phenyl HP疏水作用层析、HiPrep 16/60Sephacryl S-100凝胶过滤层析分离纯化得到一个内切葡聚糖酶组分,纯化倍数为15.5,回收率为25.0%。经SDS-PAGE、酶谱分析鉴定,两步分离纯化后为电泳纯的纤维素酶,相对分子量约为55 000。酶学性质研究表明,该酶的最适反应pH为4.5,最适反应温度为60℃。Mg2+、Zn2+对该酶有一定的激活作用,而Mn2+、Co2+、Ag+对该酶产生了抑制作用。     

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶在E.coli中的表达及酶学特征研究

磷酸吡哆醇氧化酶(pyridoxine-5′-phosphate oxidase,PNPO)是维生素B6(VB6)代谢的关键酶。采用重组质粒pET32a(+)-PNPO原核表达家蚕(Bombyx mori)PNPO,经Ni2+亲和层析纯化后对其基本酶学性质进行分析。结果表明,纯化后的家蚕重组PNPO经SDS-PAGE鉴定为单一条带,比活力为529.81nmol/(min·mg)蛋白,纯化倍数为7.1倍;该酶的最适反应温度为40℃,在50℃以下稳定;在pH8.0～9.0之间酶活力最高,pH6.0～10.0之间活力保持稳定。该结果有助于进一步开展家蚕PNPO的催化作用和表达调控机制的研究。     

大麦芽阿魏酸酯酶的分离纯化及其部分酶学性质的测定

本试验采用硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52离子交换层析对大麦芽中的阿魏酸酯酶(FAE)进行了分离纯化,并测定了其部分酶学性质。结果显示,分离纯化后获得了阿魏酸酯酶纯品,纯化倍数达34倍;经SDS-PAGE电泳显示为单一条带,并测定其相对分子质量约为29.3 ku;最适反应温度为50℃;最适pH为5.5,但阿魏酸酯酶在60℃以下,pH 4.5~7.5之间有较好的稳定性;Zn2+、Cu2+、Fe3+对酶活有很强的抑制作用,Na+和EDTA对酶有一定的激活作用。     

家蚕微孢子虫N.bombycis分离纯化方法的优化

对家蚕微孢子虫的分离纯化条件进行了探索。微孢子虫的分离，采用差速离心法或自然沉降法的效果均可。蔗糖平衡密度离心法的较优条件为50％－60％的蔗糖连续梯度、23000rpm离心30min,而Percoll法的最佳条件为25％、50％、75％和100％的Percoll不连续梯度、17500rpm离心20min；两种纯化方法相比较，Percoll法的效果为好。     

家蚕孵化酶样基因BmHEL的原核表达及蛋白纯化与功能鉴定

孵化酶(hatchingenzyme,HE)是后生动物卵孵化过程中起关键作用的一类蛋白酶。在已完成全长967bp的家蚕孵化酶样基因(BmHEL)克隆及其转录特性分析的基础上,研究了该基因在原核表达系统的表达、产物纯化及其对家蚕卵壳的降解功能。以全长BmHEL质粒DNA为模板,用PCR方法分别获得了该基因的开放阅读框(BmHELORF,885bp)、缺失信号肽编码区(BmHELa,834bp)和推测成熟酶功能编码区(BmHELb,624bp)的3个片段,并亚克隆入原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌(E.coli)BL21中进行表达。表达的3种外源蛋白均以包涵体形式存在,获得含有6×His-Tag标签的融合蛋白,其分子质量分别为33.4、31.8、24.0kD。通过Westernblot方法检测到了用Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白。纯化复性后的3种孵化酶对家蚕卵壳底物有一定降解活性,其中BmHELORF的活性最高,BmHELb的活性最低。在pH7.1反应条件下3种酶的活性比pH9.5时高。研究结果在蛋白质水平上进一步证实家蚕孵化酶样蛋白参与了蚕卵孵化这一重要生命过程。     

家蚕体液碱性小分子蛋白Bm8K的序列分析和纯化鉴定

对NCBI公布的一种家蚕碱性小分子蛋白(GenBank登录号:AY655143.1)进行序列分析,发现该蛋白与胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding protein,IGFBP)的氨基酸序列具有相似性,特别是与IGFBP的N端功能区域匹配程度较高,推测此蛋白可能是IGFBP家族中的一员。采用凝胶过滤层析和弱阳离子交换层析从家蚕5龄幼虫体液中纯化目的蛋白,经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和Western blotting检测鉴定为家蚕Bm8K蛋白,为蛋白的功能分析奠定了基础。     

牛乳中乳过氧化物酶的分离纯化技术

牛乳经离心脱脂、酶凝乳除酪蛋白后,通过强阳离子交换色谱分离纯化得到乳过氧化物酶,利用考马斯亮蓝、SDS-PAGE定性定量检测.结果表明：每毫升牛孔能提取乳过氧化物酶0.027 mg,纯度为97%.     

牛白细胞髓过氧化物酶的分离纯化

应用分子筛层析(Sephadex G-200凝胶)和亲和层析(ConA-Sephrose 4B)从奶牛全血中分离纯化髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)。分离出的MPO活性为0.068 U/mL,分子质量为64.7、47.9、13.4 ku,纯度为94.2%,蛋白质浓度为147.3 μg/mL。本研究建立了MPO分离纯化方法,对于深入研究MPO具有重要意义。     

家蚕卵巢膜结合海藻糖酶的纯化及性质研究

用TritonX-100把海藻糖酶从卵巢膜上溶解下来,在缓冲液中含6%甘油的条件下.通过DEAE-SCphaccl柱层析、HPLC、Native-PAGE等步骤,从家蚕卵巢膜上纯化得到了家蚕卵巢膜结合海藻糖酶.该酶是海藻糖的特异性酶.分子量为18 000道尔顿,最适pH是6.5,米氏常数(Km)是1.25mM,且被竞争性抑制剂Validoxylamine A 抑制活性.     

家蚕BmAWD基因的表达和蛋白纯化

家蚕BmAWD与家蚕翅膀发育密切相关,控制其翅膀发育的完整性及可用性。在对本实验室构建的家蚕蛹期cDNA文库测序中,我们筛选到-条编码AWD蛋白的cDNA序列,将其命名为BmAWD基因。通过生物信息学分析,发现该基因序列全长为689bp,ORF框为465bD,编码154个氨基酸残基,含有-个NDPK保守结构域。通过PCR扩增获得该基因ORF框并克隆到表达载体pGEX-5X-1上,得到重组表达质粒pGEX-5X-1-AWD,将该重组子转化大肠杆菌BL21,经PCR、酶切鉴定证明重组正确,在37℃下以IPTG诱导表达后收集菌体并裂解,SDS-PAGE分析发现在43kD左右处有一特异性蛋白条带,与预期值相符,但目的蛋白主要以沉淀即包涵体形式存在,25℃下诱导表达,SDS—PAGE分析表明目的蛋白主要存在于上清中。采用亲和层析法纯化融合蛋白GST-AWD,目的蛋白通过与层析柱上的GST磁珠结合而被纯化分离。     

家蚕病原性微孢子虫的蛋白质化学性质的研究

抽提了微 孢子虫的总 蛋白和选择 性分离纯 化了主要 蛋白组 分。对 总蛋白 进行了 酸性 Ｐ Ａ Ｇ Ｅ、碱性 Ｐ Ａ Ｇ Ｅ、 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 和氨基酸组成分析，并对 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 结果进行了薄层扫描分析。发现每一样品总蛋白在 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 图谱上均分离出３０ 多条蛋白带，均有５ 条主带，但位置不同，各条蛋白带的相对含量不同。氨基酸组成分析结果中发现各种孢子总蛋白所含的氨基酸种类基本相同，均含有１６ 种氨基酸，但各种氨基酸的相对含量不同。对主要蛋白组分进行了 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 氨银染色法纯度鉴定、薄层扫描分析和氨基酸组成分析，发现彼此之间有共同点，但也存在一定的差异。     

SSR标记在中国野桑蚕和家蚕的遗传多态性分析中的应用

采用25个微卫星标记(SSR)对中国5个不同地区的野桑蚕及2个家蚕品种进行了多态性分折,共产生58个等位基因,平均每个位点多于2个等位基因。表明微卫星标记能反映各品种之间丰富的多态性,品种间的聚类结果较好地反映了家蚕和野桑蚕之间的遗传特性。     

家蚕灰僵病病原的鉴定

家蚕灰僵病(grey muscardine)是一类不常见的真菌病,其病原一直未能确定。从感染灰僵病的家蚕体中分离获得一株棒束孢(Isaria),菌株编号为RCEF197,测定了该菌株的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA区域序列,研究了该菌株的菌落和显微形态特征。与一些近似的棒束孢和拟青霉(Paecilomyces)的ITS序列进行比较,该菌株和爪哇棒束孢菌株CBS134.22的相似性为99.8%,在构建的棒束孢属部分种的系统发育树中,该菌株与爪哇棒束孢聚为一类,再结合该菌株具有的淡灰紫色菌落和长椭圆形分生孢子大小等形态学特征,将家蚕灰僵病的病原确定为爪哇棒束孢Isaria javanica。     

人工诱导家蚕ZZWW型三倍体的细胞遗传学分析

试验以探讨ZZWW型四倍体雌蚕在减数分裂中性染色体行为为目的 ,用玉泽的过冷却处理方法诱发的四倍体雌蚕 (ZZWW )与带有伴性赤蚁基因的二倍体雄蚕 (ZschZsch)交配 ,发现有ZZWW型三倍体发生。根据ZZWW型三倍体发生 ,分析四倍体雌蚕减数分裂中形成配子的种类和比例、遗传学行为及ZZWW型三倍体蚕的形成机制     

家蚕γ-谷氨酰转肽酶和谷胱甘肽的研究

膜结合的γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP),广泛地分布于家蚕的中肠、马氏管、脂防体、体壁、后丝腺和脑组织中,马氏管和中肠的酶活力较高.产丝量较高的品种苏6×苏5,中肠γ-GTP活力也较高,各品种中肠γ-GTP活力峰均在5龄中期.大部分必需氨基酸是该酶很好的氨基酸受体,但谷氨酰胺等几种氨基酸明显抑制该酶活力.蚕中肠组织的GSH含量变化与γ-GTP活力变化有关.γ-GTP活力较高的苏6×苏5品种,其中肠GSH浓度也较高.以上结果反映出,家蚕中肠γ-GTP和GSH在吸收氨基酸,尤其是必需氨基酸中起重要作用.     

家蚕微卫星标记的筛选及其在遗传多样性分析中的应用

利用插入片段长度在 7kb以上的家蚕基因组文库 ,采用目标重复序列杂交法筛选微卫星位点 ,获得了 8个微卫星标记。用这 8个微卫星标记对 6个家蚕品种 (菁松、兰 10、C10 8、P5 0、5 4A、法 5 0B)进行多态性研究 ,共产生 2 3个等位基因 ,平均每个位点近 3个等位基因 ,杂合度范围 0～ 0 .75 0 ,平均杂合度为 0 .5 0。表明微卫星标记能反映各品种之间丰富的多态性 ,品种间的聚类结果较好地反映了家蚕品种的化性和地理分布特性。