实时荧光定量PCR对瘤胃纤维分解菌定量方法的构建

试验构建了白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌及产琥珀酸丝状杆菌等3种瘤胃纤维分解菌实时荧光绝对定量PCR的标准品及标准曲线,以用于纤维分解菌的定量测定。提取瘤胃微生物总DNA,以各菌特异性引物进行PCR扩增,回收纯化PCR产物,与pMD18-T Vector连接并转化到大肠杆菌。用氨苄青霉素培养基筛选阳性重组质粒,提取含目的片段质粒DNA,通过PCR及测序鉴定重组质粒。根据OD值确定浓度,将梯度稀释的质粒作为模板,进行荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果表明:所构建的3条标准曲线具有很高的相关性(R2>0.999),并获得了高扩增效率产物(白色瘤胃球菌为101%、黄色瘤胃球菌为98.0%、产琥珀酸丝状杆菌为97.7%),说明成功构建了瘤胃纤维分解菌实时绝对定量PCR的标准品和标准曲线,为定量研究瘤胃纤维分解菌奠定基础。     

3种瘤胃纤维分解菌实时定量PCR方法的建立

为探索以减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫对宿主动物胃肠道微生态的影响,本试验以白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌3种主要瘤胃纤维分解菌16S rRNA分别设计引物,以山羊瘤胃液提取细菌总DNA,分别扩增3种纤维分解菌目的DNA片段,并连接至pMD-18 T Vector上,经PCR和测序鉴定后,以不同稀释度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应。结果显示,扩增得到的3种瘤胃纤维分解菌目的片段与已知菌种相应片段的同源性大于99%;以不同稀释度重组pMD-18 T为模板建立的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,绘制标准曲线的相关系数均接近1,熔解曲线均呈单一峰值。因此,本试验成功建立了3种瘤胃主要纤维分解菌的实时定量PCR方法,为减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫研究奠定了基础。瘤胃纤维分解菌;Real-time PCR;标准曲线;     

山羊瘤胃嗜淀粉瘤胃杆菌16S rDNA序列体外扩增鉴定

以嗜淀粉瘤胃杆菌(Ruminobacter amylophilus) 目的菌种,依其16S rDNA序列(Y15992)设计特异引物,进行PCR扩增,并测序后进行同源性分析.结果表明,特异性引物成功扩增出的嗜淀粉瘤胃杆菌DNA的特异性片段.与基因库中原序列具有较高的同源民性(96.9%).说明利用这种方法可以对山羊瘤胃微生物进行鉴定和分析.     

运用Real-time PCR方法研究日粮添加豆油与胡麻油对肉牛瘤胃纤维分解菌数量的影响

本研究分别以产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminobacter albus)和溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)16S rDNA序列设计引物,运用Real-time PCR技术研究日粮中添加豆油与胡麻油对肉牛上述4种瘤胃纤维分解菌数量的影响.结果表明,与对照组(CK)相比,添加豆油组(LOC1)和胡麻油(LOC2)组,产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminobacter albus)和溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisol-vens)数量显著减少(P<0.05),分别降低了78%和31%、30%和36%、27%和23%、6%和13%.通过该方法的结果表明日粮中添加4%的豆油和胡麻油显著减少了瘤胃中纤维分解菌,对产琥珀酸丝状杆菌的影响明显.而且采用Real-time PCR方法对瘤胃纤维分解菌进行定量,可以快速有效反映出在日粮改变的情况下菌的数量变化趋势,相对于传统计数方法更直观、快捷与准确.     

瘤胃纤维分解菌对钙离子需要量的研究

产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌3种主要的瘤胃优势纤维分解菌表现出对Ca2+的需要。本试验评价了Ca2+在纤维分解菌生长和纤维素降解中的作用。采用最大生长量或生长率、降解度和延滞时间为评价标准确定Ca2+的需要量。除了产琥珀酸丝状杆菌A3c,其它菌群在无Ca2+的培养基中重复接种都不能生长。随着纤维二糖培养基中Ca2+浓度的增加,产琥珀酸丝状杆菌A3c的生长速率加快,滞后时间减慢,而产琥珀酸丝状杆菌S85的最大生长量和生长率都有所增加。瘤胃球菌在纤维二糖培养基中以上检测指标都没有变化。在以纤维素作为唯一底物的培养基中,两种产琥珀酸丝状杆菌都表现出对Ca2+的绝对需要。菌株A3c的需要量为0.36～0.42 mg/kg,菌株S85的需要量大于0.64 mg/kg。当Ca2+浓度增加时,所有瘤胃球菌菌株对纤维素的降解率都增加,然而,瘤胃球菌在无Ca2+存在的培养基中与产琥珀酸丝状杆菌添加Ca2+对纤维素的降解率相似。虽然瘤胃球菌组成中可能需要Ca2+以降解纤维素,但本研究中没有得到证明。尽管Ca2+在黄色瘤胃球菌降解纤维素中作用还不知道,但有可能与纤维素酶的分泌和活化有关。根据对瘤胃中Ca2+浓度的报道,体内这种菌可能不会出现Ca2+缺乏。     

驼绒藜和苜蓿对苏尼特羊增重及瘤胃细菌区系的影响

试验旨在通过二代测序技术分析饲喂驼绒藜和苜蓿对苏尼特羊增重以及瘤胃细菌区系的影响。分别以驼绒藜和苜蓿作为饲料主要成分,选择 4 对 3 月龄断奶雌性双胞胎苏尼特羊进行分组饲喂试验,试验结束后提取瘤胃内容物微生物的总 DNA,PCR 扩增细菌 16S rDNA 并通过二代测序技术获得序列信息,分析比较驼绒藜和苜蓿 2 种颗粒饲料对瘤胃细菌结构的影响。结果表明:2 个组样品测序共鉴定出 12 个门、28 个属的细菌;相对丰度最高且具有显著差异的细菌为拟杆菌门普雷沃菌属,饲喂苜蓿比驼绒藜增重效果显著并且可显著提高瘤胃拟杆菌门的相对丰度(P<0.05);多样性分析结果表明,饲喂驼绒藜会显著增加瘤胃中细菌多样性(P<0.05)。综上,饲喂苜蓿一类高蛋白饲草能够促进苏尼特羊增肥,但降低了羊瘤胃细菌多样性,瘤胃细菌优势细菌为拟杆菌门,优势菌种为普雷沃菌。而饲喂驼绒藜一类高纤维饲料对羊的增肥效果不明显,但提高了瘤胃细菌多样性和微生态环境,可能更有利于羊的健康。     

一株致病性丝状支原体山羊亚种支原体的分离鉴定

通过培养纯化、形态学观察、生化试验、生长抑制试验、代谢抑制试验、人工感染试验、间接血凝试验,对疑似山羊传染性胸膜肺炎病原分离株SY2进行初步鉴定,参考国际已知支原体16S r RNA序列,选取共同保守性强的片段设计出1对引物,提取人工感染分离株SY2培养物的菌体DNA进行PCR扩增并克隆、测序。将该序列与NCBI中已知支原体序列比较,结果证明SY2株与丝状支原体山羊亚种标准株PG3同源性为99%,故确定疑似山羊传染性胸膜肺炎病原分离株SY2为丝状支原体山羊亚种。     

16S rDNA序列分析法鉴定鸡源肠道乳酸菌

从北京郊区某散养鸡场健康成年鸡肠道中分离纯化得到12株未知菌,分别提取DNA,采用16S rDNA扩增通用引物,经PCR扩增后,测定其16S rDNA序列,测序结果与Gen Bank数据库中的序列作对比,根据序列相似性,利用MEGA软件,对12株未知菌序列构建进化树。经鉴定5株为乳酸杆菌、3株为唾液乳杆菌、2株为肠球菌、1株为罗伊氏乳杆菌及1株为葡萄球菌。结果表明,16S rDNA序列分析技术与传统方法相比具有简便和快速等优点,提高鉴定效率,可进行乳酸菌种级水平鉴定,适合用于实验室内对乳酸菌的鉴定。     

应用PCR-DGGE分析鸭场土壤细菌群落结构

为了解贵州省三穗县8个养鸭场环境土壤中细菌群落结构多样性概况,本试验采用试剂盒提取土壤样品细菌总DNA,PCR扩增细菌16S rDNA V3可变区,并通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对扩增产物进行凝胶分离,回收测序共得到43条特异性条带,其中7、8号养鸭场条带数相对较少.DGGE图谱经Quantity One软件分析,结果显示,同一鸭场样品相似性存在差异,绝大部分鸭场样品间相似性均高于50%,所测序列与GenBank中相应原核生物16S rDNA序列经同源性比对可见相似性在90%~100%之间,共包括5个大纲的细菌种类:变形菌门(Proteobacteria)的α,β类群、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes).     

一株益生芽孢杆菌Pab02的16S rDNA测序鉴定

利用16S rDNA分析对Pab02芽孢杆菌型益生菌进行系统进化鉴定.首先提取菌株Pab02的基因组DNA,根据不同种属细茵的16S rDNA序列两端的保守性设计通用引物,对茵株Pab02的16S rDNA的进行PCR扩增,并对扩增到的目标片段进行测序.将测序结果与NCBI上已知茵种的16S rDNA序列进行BLAST对比,初步构建系统进化树进行分析,再结合传统的形态观察及生理生化特性综合鉴定.最终确定为枯草芽孢杆菌.