长柱金丝桃ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为筛选可用于长柱金丝桃遗传分析的最适ISSR-PCR反应体系,采用正交试验对影响ISSR-PCR反应的5个重要因素(Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg~(2+)、引物和模板DNA浓度)进行4水平正交优化,并对退火温度、循环次数进行筛选。结果表明,20μL ISSR-PCR最佳反应体系包括Taq DNA聚合酶1.0 U、dNTPs 0.2 mmol·L-1、Mg2+3.0 mmol·L~(-1)、引物0.4μmol·L~(-1)、DNA模板40 ng,对ISSR-PCR反应的影响程度由大到小为:Taq DNA聚合酶、引物、Mg2+、dNTPs、DNA模板;引物UBC822的最佳退火温度52.7℃,最佳循环次数41,利用优化的反应体系从61条引物中筛选出12条稳定性好、多态性高的引物,验证试验表明优化的反应体系具有较高的稳定性。     

桂郁金SSR-PCR反应体系的建立及优化

目的:对桂郁金SSR-PCR反应体系进行建立与优化,使其适合分析桂郁金遗传多样性等研究内容。方法:通过正交设计法对PCR反应体系的引物,模板,2×Taq PCR MasterMix(包括Tap DNA聚合酶,dNTPs,缓冲液等)以及扩增程序进行建立和优化。结果:桂郁金SSR-PCR反应的最佳体系是在15μL的反应体系中,DNA模板2.5μL (25 ng·μL~(-1)),引物1.0μL(1.0μmol·L~(-1)),2×Taq PCR MasterMix6μL,其中Tap DNA聚合酶0.05 U·μL~(-1),Mg~(2+)3.0 mmol·L~(-1),dNTPs0.3 mmol·L~(-1),加ddH_2O至15μL。PCR反应程序的最佳参数设定为变性30 s,退火30 s,延伸45 s,循环35次。结论:建立了桂郁金SSR-PCR反应体系,并通过10份桂郁金材料进行验证,结果显示该体系稳定可靠,可以为桂郁金引物开发,良种选育繁育等相关研究提供参考。     

籽用西瓜SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

采用L_(25)(5~6)正交试验设计,对影响目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)的5个因素(Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度和引物浓度)进行优化试验,建立了籽用西瓜SCoT-PCR反应体系:Mg~(2+)2.5mmol·L~(-1)、dNTPs 0.15mmol·L~(-1)、Taq酶1.5U、引物0.5μmol·L~(-1)、模板DNA 20ng,总体积20μL。比较各因素对扩增反应的结果,其中以Mg~(2+)浓度的影响最大,Taq酶用量的影响最小。应用22个籽用西瓜品种验证该体系稳定可靠,并从41个SCoT引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的22个引物,并逐一筛选出最适退火温度。该反应体系的建立为今后利用SCoT标记技术对籽用西瓜种质遗传多样性评价、指纹图谱构建、种质鉴定、分子标记辅助选择育种等研究提供了新的技术手段。     

普通菜豆SSR反应条件的优化

在作物育种中,SSR是主要农艺性状分子标记及标记辅助育种的一项重要技术。以紫花、八月绿、将军、73-8、96-9、9z622等6个普通菜豆品种为试材,采用改良的SDS法提取了高质量的基因组DNA。为建立适宜的SSR反应体系,对影响SSR-PCR扩增的模板DNA浓度、Mg~(2+)的用量、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等因素进行了优化。结果表明,在25μLPCR反应体系中,DNA模板的最适浓度为0.8ng·μL~(-1),Mg~(2+)的优化浓度为1.5mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶的最适浓度为0.05μmol·(μL·min)~(-1),dNTPs的最适浓度为0.2mmol·L~(-1)。     

小桐子SSR-PCR反应体系的优化

采用改良的CTAB法从小桐子嫩叶中提取基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和SSR-PCR扩增检测,结果表明,改良CTAB法提取的小桐子基因组DNA完整性好,纯度较高,可作为SSR分子标记的模板。同时,对影响小桐子SSR-PCR扩增的d NTPs、Taq DNA聚合酶、引物及Mg2+浓度等4个因素进行了优化,优化后的小桐子SSR-PCR扩增的最佳反应体系为:在20μL的反应体系中含有模板DNA 100 ng,d NTPs 0.2 mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶100 U·m L~(-1),引物0.6μmol·L~(-1),Mg~(2+)1.5 mmol·L~(-1)。适宜的扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性1 min,51~53℃(退火温度随引物不同而改变)退火1 min,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸10 min。     

蝴蝶兰RAPD反应体系的建立

为建立一个稳定的蝴蝶兰RAPD反应体系,对RAPD反应体系中模板DNA、Taq DNA聚合酶用量、随机引物浓度、Mg2+浓度和dNTPs浓度等各项参数进行筛选比较。结果表明,最佳反应体系为:25μl反应体系中,其中含模板DNA(20 ng/μl)1.5μl,Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.4μl,随机引物(20μmol/L)1μl,Mg2+(25 mmol/L)2.5μl,dNTPs(10 mmol/L)0.5μl,10×PCR Buffer2.5μl,ddH2O 16μl。     

濒危植物蒙古扁桃ISSR反应体系优化

为利用简单重复序列区间(inter simple sequence repeat,简称ISSR)技术研究蒙古扁桃资源遗传多样性评价和种质资源鉴定,利用正交试验法进行L_(16)(4~5)正交设计,从Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶活性和模板DNA质量5种因素和4个浓度水平来优化蒙古扁桃ISSR-PCR反应体系。结果表明,最佳反应体系如下:在25μL反应体系中加入2.0 U Taq聚合酶,引物浓度0.80μmol/L,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,dNTPs浓度0.25 mmol/L,模板DNA质量50 ng。对蒙古扁桃ISSR-PCR反应影响程度排序依次为Taq聚合酶活性引物浓度Mg~(2+)浓度dNTPs浓度模板DNA质量。     

蛇莓RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

采用单因素试验结合正交试验,对PCR反应体系中的5种主要反应因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度进行优化筛选,确立了适合蛇莓基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系,RAPD反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2μmol/L、DNA模板60 ng;ISSR反应体系(20μL):Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1μmol/L、DNA模板60 ng。利用确立的体系对24份蛇莓种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好。     

芒果CDDP分子标记正交优化设计及引物筛选

以芒果基因组DNA为模板,选择正交设计试验对控制DNA保守序列多态性——聚合酶链式反应(CDDP-PCR)的4个因素(模板DNA浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg~(2+)DNA聚合酶用量)进行正交试验,构建了较佳的芒果CDDP-PCR反应体系,含0.50 U Mg2+DNA聚合酶、0.40 mmol·L~(-1)d NTPs、1.00μmol·L~(-1)引物、0.50 ng·μL~(-1)模板DNA,加双蒸水使得总体积达20.00μL.对比四因子对PCR反应的影响,影响最强的因素是含Mg2+的DNA聚合酶,影响最弱的因素是模板DNA.利用供试的20个芒果品种验证了该体系的稳定性和可行性,21条CDDP引物均可扩增出明晰整齐的条带.     

甘薯RAPD-PCR反应条件的优化

以徐薯22的基因组DNA作为PCR反应模板,以随机引物进行RAPD-PCR反应,通过设置ToqDNA聚合酶加量、MgCl2 浓度、dNTPs 浓度、模板DNA加量、引物加量的不同梯度,探索出一套适合甘薯RAPD-PCR的最优反应条件.试验结果表明,最优反应条件为反应体系25.0μL,2.5μL的PCR 10xBuffer、0.15U 的Taq DNA 聚合酶、3.0 nmol·μL-1的MgCl2、0.6 nmol·μL-1的dNTPs、40 ng的DNA模板、40 ng的RAPD引物.