绵羊抗菌肽GNLY基因多态性分析及合成多肽的生物学功能研究

试验旨在分析绵羊抗菌肽颗粒溶素（granulysin,GNLY）基因多态性,检测合成多肽的抑菌活性和抑制肿瘤细胞活性,明确绵羊抗菌肽GNLY的生物学功能。通过对GNLY基因RT-PCR产物进行测序,分析GNLY基因多态性,推导其氨基酸序列信息合成功能区多肽,利用径向扩散试验和MIC试验检测合成多肽对大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用;利用MTT试验观察合成多肽对人食管癌细胞（EC109）、人肾癌细胞（X786-0）的抑制作用。结果发现,MIC试验中浓度>250 μg/mL的G16对大肠杆菌、葡萄球菌均有抑制作用;浓度 ≥ 7.82 μg/mL的GS16对大肠杆菌抑制作用明显,对沙门氏菌、葡萄球菌和金黄色葡萄球菌无明显抑制作用;62.5 μg/mL GC16对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,其中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制作用较为明显;G22对4种细菌均无明显的抑制作用。MTT试验结果表明,合成多肽G16、GS16对癌细胞无抑制作用,G22和GC16对EC109、X786-0具有显著抑制作用,其中1 mg/mL G22和1 mg/mL GC16对EC109生长抑制率分别为88.21%和57.21%,对X786-0生长抑制率分别为96.37%和81.87%。研究显示,合成GNLY多肽对细菌和肿瘤细胞具有一定的抑制活性,本研究结果为绵羊抗菌肽作为候选抗菌药物的开发奠定了基础。     

构树叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用及机理研究

为了研究构树叶提取物的抑菌作用及其机理,以金黄色葡萄球菌为供试菌,采用牛津杯法测定构树叶提取物的抑菌效果,通过测定供试菌生长曲线、细胞膜渗透性和蛋白质合成来研究构树叶提取物的抑菌机理。结果表明,构树叶水提取物和75%乙醇提取物抑菌圈直径分别为17.5和18.0 mm,最小抑菌浓度均为6.8 mg/mL,最小杀菌浓度均为12.50 mg/mL。构树提取物能显著抑制金黄色葡萄球菌蛋白质合成,从而抑制其生长,但对其细胞膜的通透性影响不大。因此,构树叶提取物通过抑制金黄色葡萄球菌蛋白质合成发挥其抑菌效果。     

不同蜜粉源植物蜂王浆抗菌作用的初步研究

采用抑菌圈实验方法测定不同蜜粉源植物蜂王浆对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌作用。试验用蜂王浆分别是产浆型意蜂和产蜜型意蜂所产的油菜蜂王浆和荆条蜂王浆;受试菌株包括革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性细菌(沙门氏菌和大肠杆菌)。研究结果显示:油菜蜂王浆对革兰氏阳性菌有明显的抗菌作用,且产浆型意蜂所产的油菜蜂王浆对受试细菌的抑菌效果优于产蜜型意蜂品系所产油菜蜂王浆,两种意大利蜂所产的油菜蜂王浆对金黄色葡萄球菌的抗菌作用优于枯草芽孢杆菌;油菜蜂王浆对革兰氏阴性菌的抑菌作用也较强,两种蜂王浆对沙门氏菌的抑菌效果优于大肠杆菌;产浆型意蜂所产的荆条蜂王浆对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果均高于产蜜型意蜂所产的荆条蜂王浆,然而,二者的抑菌效果弱于油菜蜂王浆。研究表明,不同蜜粉源植物的蜂王浆抗菌效果不同,油菜蜂王浆对受试革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌效果均比荆条蜂王浆强,产浆型意蜂所产的蜂王浆对受试菌的抗菌效果优于产蜜型意蜂所产的蜂王浆。     

Antibacterial activity of thionin Thi2.1 from Arabidopsis thaliana expressed by bovine endothelial cells against Staphylococcus aureus isolates from bovine mastitis

Bovine mastitis is mainly caused by Staphylococcus aureus and antimicrobial therapy, commonly used for its control, has resulted in an increase in the frequency of resistant staphylococci in recent years. Thus, alternative therapies are desirable and the antimicrobial peptides represent attractive control agents. In this work, we expressed the antimicrobial peptide thionin Thi2.1 cDNA from Arabidopsis thaliana in the bovine endothelial cell line BVE-E6E7 and evaluated its activity against bovine mastitis S. aureus isolates. A polyclonal population from BVE-E6E7 cells transfected with the pThi2.1 construct was obtained and thionin Thi2.1 expression was confirmed by RT-PCR. From this population, eight stably transfected cell clones were obtained and their conditioned media (CM) were evaluated against the S. aureus ATCC 27543 strain. Clones showed high antibacterial activity (>95%) relative to the activity of the polyclonal population. The C8 clone showed the highest antibacterial activity (>99%) and its CM was evaluated against eleven bovine mastitis S. aureus isolates. A 2.5microg aliquot of total protein from the C8 clone's CM inhibited the growth of S. aureus isolates (>40%) relative to the CM from BVE-E6E7 cells used as control. Growth inhibition of S. aureus isolates was dose-dependent, showing a total inhibition at concentrations higher than 3.12microg/ml. These results suggest that thionin Thi2.1 antimicrobial peptide could be use in the treatment of bovine mastitis.     

鳄龟血液抗菌肽生物活性研究

为探讨鳄龟血液抗菌肽初提物的生物活性,采用纸片法和固体培养基连续稀释法对其进行抗菌效果检验,结果表明:分离纯化的血液抗菌肽对G-细菌和G+细菌均有不同程度的抑制或杀灭作用,但不同的微生物对其敏感性不同。其对致病性嗜水气单胞菌、葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌的最小抑菌质量浓度分别为12.5,25,50,50,200μg/mL。鳄龟血液抗菌肽具有①耐热性:将其沸水浴5 min后仍然具有极强的抗菌活性,沸水浴10 min后其抗菌活性减弱;②耐酸性和不溶血性:pH值为6.0,5.0,4.0,2.5时,鳄龟血液抗菌肽对嗜水气单胞菌均有抑菌活性,当pH值下降至2.5时其抑菌圈最小。     

黄芪提取物对常见致病菌的体内外抑菌活性测定

为了研究黄芪提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌的抑菌活性,采用试管二倍稀释法,测定黄芪提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌活性;采用相同浓度致病菌灌胃小鼠后,分别用黄芪提取物灌胃治疗,测定小鼠十二指肠、空肠、回肠和盲肠中肠道菌群数量,以确定黄芪提取物的体内抑菌活性.结果表明,无论是在体外还是在体内,黄芪提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均具有抑制作用,对大肠杆菌的抑制作用最强,对沙门氏菌的抑制作用最弱;且通过灌注黄芪提取物,显著降低了各种致病菌致病后小鼠的死亡率.通过研究可以得出,黄芪提取物对常见的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌具有较明显的体内外抑菌作用.     

牛肺泡表面活性蛋白A的分离纯化及抗菌活性分析

旨在分离纯化牛天然肺泡表面活性蛋白A(SP-A)和分析其抗菌活性,首先通过共价交联法制备出可特异吸附SP-A的麦芽糖-Sepharose(MS)胶粒,然后用MS胶粒从牛肺泡洗出液中吸附牛SP-A,从而得到牛SP-A.SDS-PAGE和Western blot检测表明,牛SP-A单体的相对分子质量为30 ku,二聚体为6...     

蒲公英提取物联合多种抗生素对奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的体外协同抑菌实验

为研究蒲公英提取物联合多种药物对奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的体外协同抑菌效果,以期应用于临床,减少抗菌药的使用量,降低细菌耐药性和兽药残留。试验选取3种来源(河北,东北,北京)的蒲公英提取物,通过高效液相色谱仪对3种不同来源的蒲公英提取物的主成分及含量进行测定并分析,选取后期试验所需的蒲公英提取物来源。并应用微量肉汤稀释法测定多种抗生素对金黄色葡萄球菌的MIC值(最小抑菌浓度),随后测试蒲公英提取物与抗菌药物联合用药,是否对金黄色葡萄球菌具有协同效果。试验结果表明,不同来源的蒲公英提取物主成分含量差异较大,含有单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸,但含量比例不同。随之测得不同来源蒲公英提取物对金黄色葡萄球菌的敏感程度也有差异,临床用药前有必要进行药敏试验科学精准的选择更合适的药物。蒲公英提取物与金霉素、恩诺沙星、阿莫西林、氨苄西林、头孢噻呋、头孢喹肟等联合用药,对金葡菌的体外抑菌实验有良好的协同作用,体外能显著降低抗菌药物的用量。     

蚕蛹壳聚糖复合水凝胶的抗菌性能及对创伤的愈合作用

以蚕蛹壳聚糖、蜂蜜和明胶等为基质制备医用复合水凝胶。对以不同配比制备的蚕蛹壳聚糖复合水凝胶、单纯蚕蛹壳聚糖水凝胶、蜂蜜水凝胶的抗菌性能进行比较试验,并以大耳白兔为受试动物,采用切片法检测蚕蛹壳聚糖复合水凝胶对烫伤伤口的愈合作用。结果表明:用质量分数为0.25%的蚕蛹壳聚糖和质量分数为20%的蜂蜜制成的复合水凝胶的杀菌作用明显高于市售烧伤膏和单纯蚕蛹壳聚糖或蜂蜜水凝胶,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌24 h内的抑菌率均达到100%,且持久性好;大耳白兔烫伤伤口经0.25%蚕蛹壳聚糖+20%蜂蜜复合水凝胶处理后12 d可基本愈合,切片观察愈合的伤口表皮无溃疡,局部毛囊增生,且有新生表皮细胞生成。研究结果显示,蚕蛹壳聚糖复合水凝胶具有广谱抗菌性能,可用作创伤敷料。     

加热解晶对蜂蜜抑菌活性的影响

结晶蜂蜜加热是蜂蜜完全液化最方便的方法,控温热处理可以安全有效地液化结晶蜂蜜。该研究在45℃、55℃和65℃的不同温度下加热液化不会影响蜂蜜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的总体抑菌活性。实验结果为蜂蜜的解晶温度控制提供参考。     

大蒜挥发油对猪鸡四种常见致病菌的抗菌效果

本试验旨在研究大蒜挥发油(GO)能否作为安全优质的饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖生产.采用试管倍比稀释法研究本实验室开发的2种精制大蒜挥发油制剂(G0-Ⅰ和GO-Ⅱ),以及市售天然大蒜油、合成大蒜油对养殖生产中常见的致病性鸡大肠杆菌、鸡沙门氏菌、猪大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的体外抗菌效果.结果发现:2种制剂对供试菌都有较好抑菌作用且效果均优于天然大蒜油和合成大蒜油;精制大蒜挥发油GO-Ⅱ(含二烯丙基二硫化物(DADS)比例高)对猪大肠杆菌和鸡大肠杆菌最低抑菌浓度(MIC)为62.5 μg/mL,对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌MIC为31.3μg/mL;GO-Ⅰ对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌MIC与GO-Ⅱ相同.本研究提示GO制剂中有效成分DADS与二烯丙基三硫化物(DATS)的比例不同抗菌效果不同.     

篦齿蒿提取物的抗菌试验

为了研究篦齿蒿(Neopallasia pectinata)水提取物及醇提取物的体外抑菌作用,采用牛津杯法测定篦齿蒿各种提取物对大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,沙门菌和链球菌的抑菌圈直径。用试管2倍稀释法测定其最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC),以金黄色葡萄球菌和链球菌感染小鼠,判断其体内抗菌效果。结果表明,篦齿蒿各种提取物都具有一定的抑菌作用,尤其是对金黄色葡萄球菌,其乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物是体外抗菌的主要活性部分。篦齿蒿提取物对链球菌感染小鼠体内抗菌效果较差,对金黄色葡萄球菌感染小鼠体内抗菌成分主要集中在乙酸乙酯提取物内,对小鼠死亡保护率明显高于阴性对照组,可达75%。     

唾液乳杆菌的生长特性及抑菌作用

为了探讨唾液乳杆菌的生长特性及抑菌作用,测定2株唾液乳杆菌的生长曲线,并选用口腔变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌及金黄色葡萄球菌为指示菌,采用牛津杯法进行体外抑菌实验.结果表明:2株唾液乳杆菌分别在接种2h和4h进入对数生长期,8h进入对数生长末期,14h和16h进入稳定期;2株唾液乳杆菌菌液及代谢产物对口腔变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌及金黄色葡萄球菌均有抑菌作用,对口腔变形链球菌及牙龈卟啉单胞菌的抑菌作用强于金黄色葡萄球菌;2株唾液乳杆菌菌体及调整pH值为7.0的代谢产物没有抑菌作用;2株唾液乳杆菌的抑菌能力主要来自菌体的代谢产物,代谢产物中起抑菌作用的成分为酸或酸依赖性物质.     

银黄止咳颗粒体外抑菌和抗炎作用的试验研究

本试验旨在探索银黄止咳颗粒是否具有体外抑菌和抗炎功效。采用肉汤二倍稀释法进行体外抑菌试验;通过注射0.6%冰醋酸建立炎症早期实验动物模型,并收集腹腔液体用于检测光密度D_{590 nm}值。结果表明,银黄止咳颗粒对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎双球菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为7.8、7.8、3.9、125 mg/mL;最小杀菌浓度（MBC）分别为15.6、15.6、7.8、250 mg/mL;30、16、8 g/kg银黄止咳颗粒溶液均对冰醋酸所致小鼠毛细血管通透性增高有明显的抑制作用。     

东亚飞蝗抗菌活性物质的萃取及抗菌效应研究

试验研究东亚飞蝗成虫抗菌活性物质的萃取参数与抑菌效应。采用针刺蘸大肠杆菌菌悬液方法,以抗菌活性为指标,用杯碟法测定临床多重耐药菌的抑菌活性,确定最佳诱导时间,初步研究抗菌谱。结果表明,东亚飞蝗抗菌活性物质粗提液对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)或革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、水稻白叶枯病原菌)均有一定的抑制作用。其抗菌谱为:金黄色葡萄球>水稻白叶枯病原菌>枯草芽孢杆菌>大肠杆菌,其中以对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最明显。抗菌活性物质浓度为11.782mg/mL,蝗虫抗菌活性物质收率为8.623%。经纯化后的抗菌活性物质增强对革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的抑制作用。采用针刺蘸大肠杆菌方式可成功诱导东亚飞蝗抗菌物质的表达,尤其以针刺蘸大肠杆菌诱导后饲养24h得到的抗菌活性物质抑菌活性最强。结果表明东亚飞蝗虫体内含有抗菌活性物质可被诱导表达,其抗菌作用机理有进一步研究。     

抑制奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌的乳酸菌的筛选

为获得抑制奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌(S. aureus)的乳酸菌(LAB),本研究从新疆巴音布鲁克牧区鲜牛乳和哈萨克族乳制品奶疙瘩样品中分离培养LAB,通过传统的分离鉴定与16S rDNA基因序列测序相结合的方法鉴定LAB种类,同时以临床奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌S. aureus N2为指示菌,采用双层琼脂扩散法检测分离株的抑菌能力。通过测定生长曲线确定分离株的生长稳定期,进而利用硫酸铵沉淀法透析提取稳定期内分离株的细菌素,并检测其细菌素抑菌效价。结果显示:从样品中筛选获得5株能够抑制指示菌生长的LAB,分别为希氏乳杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌、戊糖片球菌和乳酸乳球菌亚种。生长规律曲线表明20 h^30 h为5株LAB的稳定期,此期培养液pH值维持在3.8~4.5。从培养20 h的5株LAB上清液中提取到了细菌素,经检测其具有抑菌活性,抑菌效价分别为457 IU/mL、1 023 IU/mL、676 IU/mL、1 862 IU/mL和1 023 IU/mL。本研究结果表明5株LAB通过在生长稳定期内维持较低酸性环境(pH<4.5),代谢产生细菌素对乳房炎源S. aureus发挥抑制生长作用。本研究为S. aureus性奶牛乳房炎的生物防治提供了实验依据。     

L-乳酸、D-乳酸对3种食源性致病菌的抑制作用

选用金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli ATCC 43889)、福氏志贺菌(Shigella flexneri CMCC 51334)3株常见的食源性致病菌,用于测定L-乳酸、D-乳酸的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)及最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC),并比较L-乳酸、D-乳酸对3株食源性致病菌抑菌效果差异.结果表明:L-乳酸、D-乳酸对3株食源性致病菌均有不同程度的抑制作用,金黄色葡萄球菌MIC0.1 mg/mL、MBC 3.2 mg/mL,大肠杆菌MIC 0.1 mg/mL、MBC 1.6 mg/mL,福氏志贺菌MIC 0.1 mg/mL、MBC3.2mg/mL.在所选3株指示菌浓度105～106 CFU/mL、乳酸0.2 mg/mL质量浓度下,L-乳酸的抑菌效果显著高于D-乳酸.     

不同中草药提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌效果研究

为了检测不同中草药提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌效果,选取了7种不同粉碎粒度的中草药进行试验。用水提取法制备提取液,通过微量肉汤稀释法测定各提取液的抑菌效果。结果表明,厚朴、白术、茵陈提取液对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性;细粒度的厚朴提取液对MRSA的抑菌效果比粗粒度的厚朴提取液好。由此可见,厚朴提取物对MRSA具有潜在的抗菌优势。     

艾叶挥发油体外抗菌作用研究

采用水蒸汽蒸馏提取艾叶挥发油,得到淡黄色艾叶挥发油,提取率为0．65％。用1％吐温－80乳化得到的艾叶挥发油乳剂。该乳剂稳定性好,安全可行。体外抑茵试验结果表明,艾叶挥发油对炭疽杆菌抑制作用最强,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌也有较强的抑茵作用,但对巴氏杆菌、链球菌、沙门氏茵的抑茵效果不明显;艾叶挥发油对水生生物常见病原茵大肠埃希氏茵、荧光假单胞菌、嗜水气单胞茵、产酸克雷伯菌、鱼害黏球菌、副溶血茵均有较好的抑菌效果：     

苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫内膜炎致病菌体外抑制试验

为了确定苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫内膜炎致病菌的体外抑菌活性,选取奶牛子宫内膜炎致病菌大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌为供试菌株,采用纸片扩散法、牛津杯法对2种生物碱进行了药敏试验,采用液体倍比稀释法测定了其最小抑菌浓度(MIC)。结果表明,苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫中分离的耐药性大肠埃希菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)均有一定的抑制作用。苦参碱对耐药性大肠埃希菌和MRSA的MIC分别为12.5 mg/mL和25 mg/mL,氧化苦参碱对耐药性大肠埃希菌和MRSA的MIC分别为25mg/mL和50mg/mL。