不同生境下野生铁皮石斛内生真菌多样性的初步研究

采集湖南省新宁县崀山世界自然遗产风景名胜区和广西省乐业县雅长兰科植物自然保护区这两个生境中处于生长期的铁皮石斛（Dendrobium of ficinale）的营养根,并进行分离培养。通过对分离所得的41个菌株进行形态观察和ITS序列测定相结合的鉴定,共获得内生真菌34种。对担子菌和子囊菌分别进行了系统发育树构建结果显示,子囊菌为优势种类（31种）,以炭角菌目（Xylariales）和肉座菌目（Hypocreales）的种类为主,担子菌则以胶膜菌科（Tulasnellaceae）为主。Simpson多样性指数分析结果表明,不同生境下野生铁皮石斛内生真菌的多样性都很高,且雅长的高于崀山的。     

野生与人工栽培铁皮石斛内生真菌生物多样性比较及抗炭疽病活性菌株的筛选

【目的】系统分析和比较野生与人工栽培铁皮石斛Dendrobium officinale内生真菌的多样性,并从中筛选抗炭疽病活性的菌株。【方法】利用组织块分离法分离铁皮石斛内生真菌,采用载玻片培养法和基于rRNA内转录间隔区基因(rDNA-ITS)的分子鉴定法对它们进行鉴定,采用平板对峙法筛选抗炭疽病内生真菌。【结果】从铁皮石斛中分离到236株内生真菌,其中132株分离自野生植株,104株分离自人工栽培植株,野生植株内生真菌的总定殖率(50.46%)、总分离率(61.11%)及多样性指数(2.95)均明显高于人工栽培植株(其相应数值分别为39.35%、48.14%和2.49);筛选到34株对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides具抑制活性的内生真菌菌株,其中菌株F102(蜡孔菌Ceriporia sp.)、F27(硬孔菌Rigidoporus sp.)、F103(蚁巢伞菌Termitomyces sp.)和F122(伏革菌Peniophora sp.)的抑制效果较好,抑菌率分别为93.06%、88.20%、87.48%和84.57%。【结论】野生与人工栽培铁皮石斛内生真菌的生物多样性和类群结构具有明显差异,并且其中蕴含着丰富的抗炭疽病活性菌株,这为人工栽培铁皮石斛药材品质的改良及其炭疽病的生物防治奠定了基础。     

铁皮石斛促生内生真菌的筛选与鉴定

从铁皮石斛根中分离得到37株内生真菌,经过与组培苗共生筛选,获得9株促生菌,其中3株真菌对铁皮石斛的鲜质量增长率、根数增长率和芽数的促生效果最好。采用形态学观察和ITS序列测定相结合的方法对这9株促生菌进行鉴定。经形态学观察,初步鉴定出2株,均为瘤菌根菌属。根据rDNAITS序列分析显示,2株与Epulorhizasp．的相似性分别为100％和96％,1株与Guignardiacamelliae的相似性达100％,1株与MycosphaereUacruenta的相似性为99％。另外5株促生真菌分类地位尚不能确定,但这5株菌株与登录号为EU482263、GQ996178、AM901831、GU566294和GU566256的序列相似性分别达96％、95％、99％、98％和100％。     

铁皮石斛内生真菌的分离鉴定及其促宿主生长作用

利用微生物学传统分离培养方法从野生铁皮石斛根部分离内生真菌,依据形态学和真菌18SrDNA ITS序列分析对菌株进行分类,并采用正交设计法优化菌丝体液体培养基,考察发酵液对铁皮石斛组培苗生长的影响,以期为人工种植铁皮石斛提供优良菌肥。结果显示,共分离到4株内生真菌,其中TPSH1、TPSH2、TPSH3为镰刀菌属(Fusarium),TPSH4为柱霉属(Scytalidi-um)。优化后确定培养液的组分为:麦麸25g/L,土豆20g/L,蔗糖10g/L,1/2MS。菌株发酵液分别喷施铁皮石斛组培苗8周后,与对照(1/2MS)相比,以TPSH4菌株液体发酵8d,对铁皮石斛生长促进作用明显,成活率提高30.43%,植株高度增加了31.21%,鲜质量增加40.61%。TPSH4为具有促宿主生长作用的新菌株,其发酵液可作为菌肥,用以促进人工栽培铁皮石斛的生长。     

2种栽培环境对铁皮石斛内生细菌多样性的影响

  目的  揭示不同栽培环境对铁皮石斛Dendrobium catenatum内生细菌群落结构的影响,解析与石斛多糖含量存在潜在关联的功能菌种。  方法  针对温室人工基质培养和仿野生立木附生培养2种栽培体系下的铁皮石斛C9品系根、茎、叶等各部组织内生细菌,采用Illumina测序平台的Miseq进行高通量测序分析其菌落结构和多样性,同时利用逐步回归法分析内生细菌分布与组织多糖质量分数的关联性。  结果  铁皮石斛在2种栽培环境不同组织中的菌群结构差异显著（P < 0.05）,附生立木仿野生环境比温室环境下物种丰富度更高。同时,根部所含分类操作单元（OTUs）数量最多（112~630个）,叶部则最少（28~73个）。其中,厚壁菌门Firmicutes（16.7%~34.9%）、拟杆菌门Bacteroidetes（8.7%~35.6%）和变形菌门Proteobacteria（15.9%~42.0%）的OTUs占优势。从菌种生理功能上看,固氮相关的菌种如弗兰克菌科Frankiaceae在树培环境下相对丰度更高,推测可能受树培寡氮环境的影响使固氮菌富集。逐步回归分析结果显示:不动杆菌Acinetobacter在根、茎、叶不同组织中的相对丰度与多糖质量分数变化关联度最大,其次为假单胞菌Pseudomonas。  结论  铁皮石斛内生细菌资源相当丰富,而栽培方式影响菌群分布,且与石斛多糖质量分数具有关联性。     

铁皮石斛根系促生内生真菌的筛选

[目的]开展铁皮石斛根系促生内生真菌的筛选,为铁皮石斛的批量化生产提供生物防治基础。[方法]采用组织分离法对铁皮石斛根系内生真菌进行分离纯化,再通过单一回接试验将已分离内生真菌回接到铁皮石斛组培苗中,40 d后观察铁皮石斛根系生长情况,60 d后统计成活率。通过铁皮石斛根系生长指标,筛选出对根系促生作用最显著的内生真菌。[结果]从铁皮石斛根系中共分离得到21株内生真菌,筛选出8株优势促生根系内生真菌,其中回接菌株F5的铁皮石斛组培苗生根率最高,达99.00%,回接菌株F14的铁皮石斛苗成活率达100.00%,为对照组的395%。[结论]该研究成功解决了铁皮石斛移栽成活率低的难题。     

不同内生真菌对铁皮石斛幼苗生长的效应

为弄清齿瓣石斛促生真菌对铁皮石斛幼苗生长的促生效应,利用2种从齿瓣石斛根中分离筛选获得的促生菌根真菌,采用注射器注射接种法分别将单一菌剂及混合菌剂接种到松树皮基质上与铁皮石斛幼苗进行共生培养,分析2种真菌及其不同接菌方式对铁皮石斛株高及生物量等生长指标的影响。结果表明:共生培养130d后,与对照组相比,FDdS-5接种组对铁皮石斛幼苗叶长、株高及干重具有显著促进作用,FDdS-9接种组对叶数、根数、分蘖数、根长、株高、茎粗、鲜重及干重具有显著促进作用,混合菌剂(V_(FDdS-5)∶V_(FDdS-9)=1∶1)接种组对根数、叶长、根长、株高、茎粗、鲜重及干重具有显著促进作用,且与单菌株接菌组相比,混合菌株接种对株高的促生作用为协同效应,在茎粗、鲜重及干重指标上表现为累加效应。齿瓣石斛促生真菌同样能促进铁皮石斛幼苗的生长,混合接种有可能更大地发挥微生物的效能。     

铁皮石斛内生真菌的研究进展

铁皮石斛是国家珍稀药用植物。自然状态下,只有真菌与种子或根形成共生关系后,才能正常地萌发和生长发育。研究铁皮石斛内生真菌对挽救这一濒危物种具有重要的意义。该文对铁皮石斛内生真菌的多样性和促生作用的研究进展进行综述,为进一步研究提供参考。     

内生真菌对铁皮石斛种苗生长的影响

为研究内生真菌对铁皮石斛种苗生长的影响,并筛选出有利于铁皮石斛种苗生长发育的内生真菌。该研究从金钗石斛根部分离、筛选和鉴定得到3种内生真菌,将其分别配制成体积分数20%、40%和60%的液体菌剂,对铁皮石斛种苗进行接种试验。在温室栽培条件下共培养150 d后,调查统计各处理组铁皮石斛种苗生物量,并利用石蜡切片法显微观察真菌侵染情况,以及重分离真菌鉴定。结果表明,菌株FC6和FC8对铁皮石斛种苗的生长有明显的促进作用,且均能与铁皮石斛种苗形成菌丝团共生结构,菌株FC9则不能。通过对铁皮石斛种苗根部重分离的真菌鉴定,确定重分离得到了原接种真菌;菌株FC6和FC8能够侵入铁皮石斛种苗的根部组织,并在其皮层细胞中扩展、定殖,形成良好的共生关系。其中,菌株FC6对铁皮石斛种苗促进效果最佳。     

我国铁皮石斛资源遗传多样性研究进展

铁皮石斛是我国传统的药食兼用植物,具有生津、止渴、镇痛、消除水肿等功效。概述我国铁皮石斛种质资源表型遗传多样性和分子遗传多样性方面的研究,以期为未来铁皮石斛种质资源的育种和综合利用提供参考。     

铁皮石斛RRT家族全基因组鉴定及表达分析

多糖是药用植物铁皮石斛(Dendrobium officinale)的主要成分之一。鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ鼠李糖转移酶(rhamnogalacturonⅠrhamnosyltransferase, RRT)在Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖的合成中起重要作用。利用生物信息学在全基因组水平鉴定出4个铁皮石斛RRT家族基因( DoRRT1、 DoRRT2、 DoRRT3、 DoRRT4),通过逆转录定量PCR检测该基因家族在不同组织和胁迫下的表达情况。结果表明：在系统发育上DoRRT1、DoRRT3被聚为一组,DoRRT2、DoRRT4被聚为一组;DoRRT蛋白均为亲水蛋白质,可定位于高尔基体;DoRRT蛋白的α-螺旋和无规卷曲较多;4个DoRRT蛋白均有O-FucT保守结构域;组织表达显示 DoRRT1、 DoRRT2、 DoRRT4在根、茎、叶中均有表达,且在地上部的转录水平较高;胁迫表达表明 DoRRT2、 DoRRT4在高温胁迫下表达显著下调, DoRRT2在PEG模拟干旱条件下表达显著下调,说明 DoRRT2、 DoRRT4参与非生物胁迫响应。以上结果为深入研究DoRRT的生物学功能提供数据...     

霍山石斛生物碱的提取及铁皮石斛的鉴别

采用超声波辅助酶法提取霍山石斛中的生物碱，通过对固液比、超声时间、超声功率、酶解时间、复合酶（纤维素酶和果胶酶1∶1等活力混合）质量分数的单因素试验和正交试验，确定提取最佳的条件；通过气相色谱-质谱法对霍山石斛中生物碱的组成成分进行分析；通过傅里叶变换红外光谱及二阶导数变换谱图快速鉴定霍山石斛和铁皮石斛。结果表明，当固液比为1:40（g·mL^-1），超声时间为20 min，超声波功率为200 W，复合酶（纤维素酶和果胶酶1∶1等活力混合）添加量1.5%，酶解时间1.5 h为提取条件时，提取效率最佳，生物碱得率为0.053%。根据气相色谱-质谱法检测结果可得知，相对于铁皮石斛，霍山石斛的石斛碱和6-羟基石斛次碱为其特殊生物碱。二阶导数变换谱图可更直观地通过二者峰形状、个数和强度的不同来区分。因此，可以将气相色谱质谱联用和傅里叶红外光谱结合在一起来高效鉴定霍山石斛与铁皮石斛。     

山苍子（Litsea cubeba）可培养内生细菌的多样性

【目的】研究山苍子可培养内生细菌的多样性。【方法】利用添加植物组织浸提液的营养琼脂培养基分离山苍子根、茎、叶及果实中的可培养内生细菌,采用16S rDNA序列鉴定法对分离获得的山苍子可培养内生细菌进行鉴定。同一组织内,对16S rDNA序列及形态完全一样的菌株合并冗余,用Clustalx对分离得到的菌株16S rDNA进行排序,构建NeighborJoining系统进化树,并计算Jaccard指数和多样性指数。【结果】 共分离得到52株山苍子可培养内生细菌（根23株、茎8株、叶7株、果实14株）,分属于芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、Paenochrobactrum、普罗威登斯菌属（Providencia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Lysinibacillus共7个属的16个种,其中芽孢杆菌属细菌40株,与Bacillus tequilensis、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）3个种最接近的内生细菌占分离细菌株数的69.2%;根及果实中的可培养内生细菌数量及种属均最丰富,其多样性指数高于茎、叶;叶与果实可培养内生细菌的Jaccard指数最高,达0.56,其余均较低。【结论】山苍子可培养内生细菌在植株内部的分布既有种属特异性,又有器官相似性。     

铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛Dendrobium officinale可溶性酸性转化酶基因SAI,分析该基因生物学信息及时空表达特异性。【方法】基于同源序列克隆铁皮石斛SAI基因c DNA全长,采用生物信息学方法进行序列分析,并采用qRTPCR进行组织特异性表达分析。【结果】铁皮石斛SAI基因全长为1 595 bp,c DNA编码区1 368 bp,Genbank登录号为KU598852。该基因编码455个氨基酸,蛋白相对分子质量为50 700。NCBI BLASTx分析表明,该基因氨基酸序列与柑橘Citrus unshiu酸性转化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高,达77%,与其他植物酸性转化酶基因的相似性均高于68%。聚类分析表明,铁皮石斛SAI基因与玉米Zea mays液泡转化酶基因、甘蔗Saccharum officinarum SAI基因亲缘关系最近。该基因编码的蛋白质属于非跨膜结构的亲水性热稳定蛋白,定位于液泡中。SAI基因在2年生铁皮石斛的茎中表达量最高,3年生的叶中表达量最低。【结论】成功克隆铁皮石斛液泡酸性转化酶基因,该基因在铁皮石斛不同组织不同生育时期的表达量差异较大。     

遮阴对铁皮石斛生长与品质的影响

为了明确铁皮石斛农艺性状和糖类成分之间的相互关系,为铁皮石斛种植和新品种选育提供理论依据,探讨了遮阴对铁皮石斛农艺性状与糖类成分积累的影响,测定遮阴条件下铁皮石斛农艺性状和糖类成分的变化情况,并对农艺性状与糖类成分进行相关性分析、多元回归分析和通径分析。结果表明：遮阴组的叶长、叶宽、纤维素、半纤维素显著小于对照组,而茎粗、生物量、可溶性多糖含量、甘露糖含量、甘露糖/葡萄糖值显著大于对照组;对生物量负向影响最大的是叶数（-0.840）;对可溶性多糖含量正向影响最大的是茎长（0.864）;对甘露糖/葡萄糖值负向作用最大的是茎长（-1.230）,其次是茎粗（-0.427）。可见遮阴处理能显著提高铁皮石斛甘露糖含量以及甘露糖/葡萄糖值,减少粗纤维的积累,从而促进了石斛茎粗的生长和生物量的积累。因此,可将遮阴处理适时应用于铁皮石斛人工种植中,生产中也可以通过控制茎长、茎粗等性状指标来筛选高品质、高产量的铁皮石斛品种。     

茅苍术叶片可培养内生细菌多样性及其促生潜力

对江苏省道地药材茅苍术叶片可培养内生细菌的多样性及其固氮、解磷、解钾、产生长素的能力进行研究.依据菌落形态的不同,共分离得到52株内生细菌.能正常传代培养的45株内生细菌经ARDRA分析后归入14个聚类簇,簇内菌株的BOX-PCR指纹图谱相似度不高,在属水平上显示出茅苍术内生细菌丰富的多样性.各聚类簇代表菌株16S rDNA的序列分析表明分离得到的内生细菌与泛菌属、微杆菌属、短杆菌属、农杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属细菌亲缘关系相近,优势内生细菌与假单胞菌属细菌亲缘关系相近.45株能正常传代培养的内生细菌中,有10株能够在无氮培养基上正常生长,具固氮潜力.使用nifH基因通用引物对其基因组进行扩增后,除ALEB 33外,其它9株内生细菌均可获得与nifH基因片段大小相近的条带.分别使用NBRIP培养基和蒙金娜有机磷培养基筛选后获得19株和15株能够溶解磷酸钙和卵磷脂的内生细菌,其中ALEB 43溶解无机磷的能力最强,达(251.43±6.55) mg/L;ALEB 4A溶解有机磷的能力最强,达(23.63±1.46) mg/L.部分内生细菌溶解无机磷的能力与其产酸能力呈正相关,而菌株溶解有机磷的能力却无此相关性.通过硅酸盐培养基的筛选,获得具有解钾潜力的菌株24株.43株内生细菌能够将色氨酸转化为生长素,其中ALEB 44产生长素的能力最强,达(268.44±10.12) μg/mL.本研究首次揭示了江苏省道地药材茅苍术体内丰富的内生细菌资源及其促生长潜力,对进一步阐述茅苍术与内生菌之间的相互关系具有重要意义.     

大蒜鳞茎中抗番茄灰霉病内生菌的筛选及其防治效果

【目的】筛选拮抗番茄灰霉病的内生菌菌株,研究其生防效果,为开发有应用潜力的微生物农药奠定基础。【方法】用平板对峙法从大蒜鳞茎内筛选具有拮抗作用的内生菌,测定拮抗菌株对番茄离体叶片、果实、胚根和盆栽植株灰霉病的防治效果,以及对7种常见病原真菌的抑菌活性。【结果】从分离纯化的63株候选菌株中获得了22株具有一定抑菌活性的内生菌,其中有4株内生菌(D6,D10,D21,Y3)对番茄灰霉病有显著的抑制效果,抑菌率最高可达77.5%。4株拮抗菌均有较强的抑菌活性,对番茄离体叶片、果实和胚根上番茄灰霉病菌的生长抑制率最高分别达92%,71.13%和70.3%;对盆栽植株番茄灰霉病菌的抑制率最高可达96.2%;这4株菌对西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、玉米弯孢病菌(Curvularia lunata)、烟草赤星病菌(Alternaria longipes)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav.)和棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporun f.sp.vasinfectum)均有一定的抑菌活性,抑制率最高达83.1%。【结论】大蒜鳞茎中的内生菌对番茄灰霉病有明显的抑制作用,这为内生菌在番茄灰霉病防治方面的应用提供了理论依据。     

铁皮石斛SEP3基因的生物信息学分析及敲除载体的构建

SEP3(SEPALLATA3)基因是MADS-box家族中的一员,在花器官的形成和发育过程中具有重要作用.为了解SEP3基因在铁皮石斛(Dendrobium officinale)中的成花转变机理,从铁皮石斛转录组序列中获得一个SEP3基因序列,并命名为DoSEP3.预测其编码区长度为354 bp,预测编码117个氨基酸.DoSEP3蛋白相对分子质量13457.87 Da.其不稳定系数为60.53,亲水性的平均值为-0.121,是不稳定的亲水性蛋白,主要在内质网和细胞核中起作用.二级结构主要以α-螺旋为蛋白质最大量的结构元件,跨膜区分析推测DoSEP3蛋白质具有一个跨膜区.进一步的氨基酸比对显示,铁皮石斛DoSEP3蛋白与金钗石斛SEP3蛋白亲缘关系最近,可能具有类似的功能.基于生物信息学分析,利用CRISPR/cas9技术构建铁皮石斛基因敲除载体,并使用农杆菌介导法进行遗传转化,且已获得阳性原球茎,可为后续的SEP3基因表达研究奠定基础.     

铁皮石斛两个DEAD-box RNA解旋酶基因克隆及特征分析

为获得铁皮石斛DEAD-box RNA解旋酶(RH, RNA Helicase)基因并进行表达及序列分析,利用RACE从其叶片cDNA中分离RH基因,对编码蛋白相关理化特性进行生物信息分析;采用MEGA 6.0构建系统进化树;借助定量PCR技术检测基因表达特性。结果表明:分离到铁皮石斛两个DEAD-box RH基因 DoRH1和 DoRH2(GenBank注册号KT957555和KT957556),全长为1 648 bp和1 851 bp,各编码1条由428和499个氨基酸组成的肽链,编码蛋白相对分子质量分别为48 206和55 432,等电点5.51和8.65; DoRH1和DoRH2蛋白均包含3个保守的RH结构域和多个基元,无信号肽或跨膜域,预测均定位在细胞核;两个基因与植物DEAD-box RH家族基因相似性高达80%以上; DoRH1、 DoRH2分别聚在拟南芥、水稻、大豆和雷蒙德氏棉DEAD-box RH家族基因进化树的Ⅲ、Ⅳ支; DoRH1和 DoRH2表达模式不同, DoRH1在根、茎、叶中表达量无显著差异, DoRH2在根中的相对表达量为叶中的3.26倍,茎与叶中无差异...