泰国斗鱼Dmrt1基因的部分cDNA克隆及表达分析

Doublesex和Mab-3相关转录因子1(Dmrt1)隶属于DMRT家族,在脊椎动物性别决定、性别分化和性腺发育中具有重要作用。利用RACE克隆技术从泰国斗鱼脑中克隆Dmrt1基因的部分cDNA序列,分别采用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测Dmrt1基因的组织分布和胚胎发育过程的表达变化。试验结果显示,克隆的泰国斗鱼Dmrt1基因的部分cDNA序列长为1037 bp,其中开放阅读框长为798 bp,编码265个氨基酸残基;进一步构建Dmrt1系统进化树,结果显示,泰国斗鱼与龟壳攀鲈亲缘关系最近;半定量PCR和实时荧光定量PCR结果显示,Dmrt1基因的表达具有明显的组织特异性及性别差异,在雄性个体中,Dmrt1基因在精巢和脾脏中特异表达,而在雌性个体中,Dmrt1基因在心脏中高表达,其次在脑、垂体、脾脏、肌肉、肾脏和肠道中也有少量表达,但未在性腺和肝脏中表达。在胚胎发育过程中,Dmrt1基因在受精卵的表达水平最高,而在原肠胚至心跳期表达量较低。Dmrt1可能在调控泰国斗鱼的雄性个体的生殖发育过程中发挥着重要作用。     

中华鳖StAR基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

摘要 为探索StAR基因在中华鳖（Pelodiscus sinensis）性腺发育过程中的作用,利用RACE技术克隆获得中华鳖StAR基因全长cDNA,采用Real-time PCR分析其在不同组织及胚胎不同发育时期的表达情况,并制备多克隆抗体,采用western blot检测StAR在不同组织的表达,通过免疫组化对其在细胞中的表达进行定位,同时检测芳香化酶抑制剂来曲唑处理雄性中华鳖后StAR在精巢中的表达情况。结果显示：该基因全长2377bp,开放阅读框903bp,编码300个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化分析表明,中华鳖StAR与龟类亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,StAR基因在精巢中表达量最高,显著高于其他组织;StAR基因于中华鳖胚胎发育16期已有表达,20期表达量最高,提示StAR可能参与中华鳖早期性腺分化;来曲唑处理的中华鳖精巢中,StAR表达量显著降低。本研究利用原核表达系统构建中华鳖StAR基因原核重组表达载体,经蛋白纯化后免疫小鼠,获得中华鳖StAR多克隆抗体。Western blot检测结果显示StAR在不同组织的表达量与荧光定量结果基本一致。免疫组化结果显示,StAR蛋白在卵巢间质细胞、精巢的间质细胞,精原细胞及胞质中表达。研究表明,StAR基因可能参与中华鳖性腺发育过程。     

芳香化酶抑制剂对暗纹东方鲀CYP19A、DMRT1基因表达及性腺分化的影响

采用组织学和分子生物学方法,研究了投喂芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)后暗纹东方鲀(Takifugu obscures)初孵仔鱼CYP19A、DMRT1基因表达以及性腺的组织学变化,以期进一步了解P450芳香化酶(P450arom)在鱼类早期性别分化过程中的作用。RT-PCR结果显示,对照组样品CYP19A和DMRT1表达显示性二态,雌性表达CYP19A基因,雄性表达DMRT1基因。LE处理组在性别分化期间,雄性样品单一表达DMRT1,雌性样品则同时表达CYP19A和DMRT1。qRT-PCR结果显示:LE处理组雌性仔鱼CYP19A基因表达被显著抑;虽然在仔鱼出膜后22d(dph)的表达水平高于9 dph,但仅为同日对照组的2.11%。LE处理组雌性样品22 dph时DMRT1基因表达量上调,至150 dph时达对照组雄性水平。55 dph的性腺组织学结果表明,LE处理可导致暗纹东方鲀稚鱼原始卵巢退化,并向功能性精巢发育。150 dph的LE处理组性腺均为精巢,并与对照组精巢发育同步。结论认为,暗纹东方鲀性腺分化期间P450arom是卵巢形成和维持发育所必须的,抑制P450arom活性可导致雌性暗纹东方鲀发生雄性化逆转。     

拟穴青蟹PHGPx基因的克隆及其表达分析

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(Phospholipid hydroperoxide Glutathione Peroxidase, PHGPx)是GPx基因家族的重要一员,能特异地清除磷脂和胆固醇等氢过氧化物,在机体抗氧化、抗凋亡、抗炎症以及雄性性成熟等过程中发挥着重要的作用。本研究从实验室拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)转录组数据库中筛选出该基因的EST序列,利用SMART-RACE 技术克隆得到该基因的全长cDNA。经Blast 比对后,其与丰年虾(Artemia franciscana)的PHGPx氨基酸序列一致性最高,达到69%。同时系统进化树分析表明,该基因与其他物种的PHGPx(GPx4)聚为一支,而与GPx1、GPx2等亚型距离较远,故命名该基因为Sp-PHGPx。实时定量PCR结果显示,Sp-PHGPx在成熟青蟹雌雄各组织中均有不同程度的表达,其中精巢的表达量最高;且在雌雄相同组织中,雌性性腺的表达量显著低于雄性;而在鳃和心脏中的表达量显著高于雄性。在性腺不同发育阶段,Sp-PHGPx在卵巢发育过程中的表达量差异不显著;而在精巢发育过程中,其表达量在精子细胞期(T2期)显著高于精母细胞期(T1期)和成熟精子期(T3期),同时也显著高于卵巢发育各时期的表达量。在LPS应激下,鳃和肝胰腺中Sp-PHGPx的表达量分别在6h和12h显著上调;H2O2应激下,鳃中的表达量在3 h显著升高,肝胰腺中的表达量在被检测的各时相中无显著差异。以上结果表明,Sp-PHGPx可能在免疫防御反应以及精巢的发育和成熟等过程中发挥着重要作用。     

大黄鱼sox9a/b基因的克隆与表达分析

为探究sox9基因在大黄鱼性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆得到大黄鱼sox9a和sox9b 2个基因,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析其在雌雄个体不同组织和不同发育阶段的表达规律,并检测了其在17β-雌二醇处理后的遗传雄性和17α-甲基睾酮诱导处理后遗传雌性幼鱼中的表达变化。结果显示,大黄鱼sox9a c DNA全长2 442 bp(NCBI登录号:MH996431),包含476 bp 5′UTR、466 bp 3′UTR、1 500 bp ORF,编码499个氨基酸。大黄鱼sox9b cDNA全长为2 199 bp (NCBI登录号:MH996432),包含335 bp5′UTR、415 bp 3′UTR、1 449 bp ORF,编码482个氨基酸。qRT-PCR分析显示,sox9a基因主要在性腺、眼、脑、肝脏中表达,精巢中的表达量显著高于卵巢;sox9b在大黄鱼各组织中广泛表达,但以精巢中表达量最高,而卵巢中只有痕量表达。在鱼苗性腺发育初期,sox9a/b的表达量都维持在较低水平;随着鱼苗长大,sox9a/b的表达量在84 dph、123 dph 2次达到高峰,随后开始下降,10 mph后又逐渐上升。17β-雌二醇处理能够显著下调遗传雄性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达,17α-甲基睾酮处理则显著上调遗传雌性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达。研究表明,sox9a/b基因与大黄鱼性别发育和分化过程密切相关,对大黄鱼精巢的发育与维持起重要的调控作用,而且两个基因的功能可能具有一定程度的分化。     

半滑舌鳎Shh基因的克隆与表达及甲基化分析

通过RACE方法获得半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Hh基因家族的Shh基因,该基因全长1 922 bp,其中5′UTR 266 bp,3′UTR 360 bp,ORF1 296 bp,编码431个氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为47.28 k D,理论等电点6.95,具有Hh基因家族特有的保守结构域。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Shh与牙鲆的同源性最高,为82%,与其他鱼类同源性为74%~81%,与非洲爪蟾的同源性为61%,与人和鼠的同源性为63%~64%。甲基化结果显示,Shh基因在1龄卵巢中的甲基化程度普遍低于雄鱼与伪雄鱼精巢。基因表达分析显示,Shh基因在胚胎期的囊胚期表达显著高于其它时期(P0.05),在雌雄成鱼8个组织器官均表达,在雌性性腺分化的关键期孵化后50 d,雌性性腺中表达量较前期升高,且显著高于同时期雄性性腺中的表达(P0.05),在雄性性腺分化的关键期80~95 d,Shh基因在雄性中的表达水平显著升高(P0.05),在8月龄、1龄及2龄雌鱼性腺中表达显著高于雄鱼与伪雄鱼。本研究表明,半滑舌鳎Shh基因在进化中高度保守,与胚胎分化、组织器官形成、雌雄性腺分化及性腺发育密切相关。     

栉孔扇贝Cf-dmrt4-like基因的克隆、序列特征及表达分析

DMRT家族是一类转录因子,在性别决定与分化、器官形成等早期胚胎发育中起重要的作用。本研究采用简并PCR扩增和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从栉孔扇贝(Chlamys farreri)精巢中克隆得到1个全长为2312bp的dmrtcDNA序列,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)1110bp,编码369个氨基酸,具有dmrt基因家族共有的DM保守结构域。同源比对和系统进化分析结果显示,其为Cf-dmrt4-like基因。半定量RT-PCR结果显示,该基因从受精卵至匍匐幼虫各发育时期均有表达,卵裂期表达量较高;在雄性成体的鳃和精巢以及雌性成体的外套膜、鳃、肾和闭壳肌中表达,但卵巢中未见表达。qRT-PCR检测不同发育时期的精卵巢,以成熟期精巢表达量最高。由此推测,栉孔扇贝Cf-dmrt4-like基因参与个体的早期发育,并在两性成体中发挥着不同的作用。     

三角帆蚌kinase X基因的克隆及功能初探

三角帆蚌是我国特有的淡水育珠蚌,在养殖业中占有重要地位,在实际养殖过程中,雄性个体有着明显的产珠优势,因此对性别决定的相关研究至关重要。研究发现Sox9基因在许多物种中起到性别决定的作用,kinase X基因是蛋白激酶(PKA)合成中至关重要的基因,而Sox9基因很可能受到PKA激酶的调控。实验通过RACE法克隆kinase X基因的全长cDNA序列,使用荧光定量PCR的方法检测该基因在2龄雌雄三角帆蚌各组织中的相对表达量,利用RNA干扰技术研究干扰链对kinase X基因及下游基因Sox9基因表达的影响。结果显示,kinase X基因全长1 652 bp,编码430个氨基酸;荧光定量PCR结果显示,kinase X基因在雄性性腺中表达量最高,雌雄间差异极显著;RNA干扰结果显示,合成的干扰链均对kinase X基因有着一定的干扰效率,其中干扰链1的干扰率最高,在雌性中的干扰率为83.1%,雄性中为81.9%,同时干扰链1干扰后Sox9基因的表达量在雌性中下降了90.3%,雄性中下降了56.6%,推测这两个基因可能参与性别决定过程。本实验为三角帆蚌性别决定和雄性单性化育种研究提供理论基...     

中华鳖SOX9基因在胚胎期性腺中的表达模式及在性逆转中的表达变化

SOX9基因在脊椎动物性别决定和性腺分化中扮演重要的调控作用。从mRNA和蛋白水平分析中华鳖SOX9基因在不同组织中的差异性表达、在胚胎性腺和成年睾丸中的细胞定位以及在性逆转中的表达变化,研究SOX9基因在中华鳖性别分化中的调控作用。Real-time PCR结果显示,SOX9基因在中华鳖雄性性腺中特异性表达。免疫荧光染色分析显示,SOX9蛋白在雄性18期胚胎性腺中开始表达,随着性腺的发育,SOX9蛋白定位于性腺Sertoli前体细胞细胞核中;而在雌性胚胎性腺并未见其表达。此外,在雌激素诱导的雄性向雌性性逆转胚胎中,SOX9基因显著下调,而在芳香化酶抑制剂诱导的雌性向雄性性逆转胚胎中,SOX9基因表达则显著上升。研究表明,SOX9基因为中华鳖雄性特异性基因,参与雄性性腺的发育过程,可能在中华鳖早期性别分化过程中起调控作用。     

半滑舌鳎 Gadd45g3 基因的克隆与表达分析

生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45(growth arrest and DNA damage inducible protein 45,Gadd45)基因在胚胎发育和性别决定中起重要作用。本研究通过RACE方法在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆得到了1个Gadd45g同源基因,命名为Gadd45g3。该基因全长1 147 bp,编码155个氨基酸残基。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Gadd45g3与其他鱼类Gadd45g-like的同源性为79%~88%,与硬骨鱼和高等脊椎动物的Gadd45g同源性为58%~67%。对多个物种的Gadd45g同源基因的CDS区进行Ka/Ks分析,发现Ka/Ks均小于0.3。FISH结果显示,半滑舌鳎Gadd45g3基因位于常染色体上。实时荧光定量PCR结果显示,Gadd45g3在雌雄成鱼的脑中都有很高的表达,说明其参与了神经发育;在成熟性腺中,Gadd45g3的表达具有精巢特异性,说明Gadd45g3是性别相关基因;而在不同发育时期的性腺中,Gadd45g3的表达量在孵化后20 d的雄性仔鱼中显著高于同龄雌鱼(P0.05),但在孵化后95 d的雌雄仔鱼中均有高表达,说明在半滑舌鳎性别决定和性腺发育中起着重要作用。     

养殖银鲳性腺发育规律和性类固醇激素变化

为掌握养殖银鲳的性腺发育规律及其与性类固醇激素水平的关系,本研究采用组织切片技术和酶联免疫吸附法(Elisa),观察养殖条件下银鲳的精巢与卵巢发育特征和血清中性类固醇激素的周年变化,并分析性腺成熟指数(GSI)、肝重指数(HSI)和肥满度(CF)与性腺发育的关系。结果显示,养殖银鲳雌鱼1龄即可发育成熟,成熟卵巢呈一对""形的囊状结构。11月份有近一半个体发育至III期,33.3%已发育至IV期,12月—翌年1月越冬期间约2/3退化至II期,3月又迅速发育至IV期,4月份达到V期并产卵,5月份产卵结束卵巢进入恢复期IV期。银鲳精巢属小叶型,III期精巢出现小叶腔,IV期精巢出现精子,精巢发育速率快于卵巢,即"雄性早熟",7月龄约20%个体可达到性成熟,越冬时退化至III期,3月重新发育,精子分批成熟排精。雌鱼GSI值为0.19%~12.89%,HSI为0.97%~2.30%,CF为2.30~3.08 g/cm~3,雄鱼的GSI为0.08%~2.62%,HSI值为0.73%~1.83%,CF为2.11~2.80 g/cm~3,GSI值在V期时达到最大,HSI和CF值则于IV期达到峰值。雌鱼血清中雌二醇(E2)周年表达水平为23.27~59.13 pg/m L,雄鱼为15.90~36.20 pg/m L,雌鱼的睾酮(T)为14.57~68.67 nmol/L,雄鱼的T为18.62~66.49 nmol/L,E2水平与HSI值呈现显著正相关关系,T表达水平与GSI值呈现显著正相关关系。研究表明,银鲳血清中性类固醇激素含量与精巢和卵巢的发育密切相关,可作为了解养殖银鲳性腺发育的重要指标。     

拟穴青蟹Sp-Sox14基因在胚胎发育和性腺发育过程中的表达

为了解Sox14基因在拟穴青蟹胚胎发育和性腺发育过程中可能起到的调控作用,实验从青蟹性腺转录组数据库中得到全长为2558 bp的Sp-Sox14 c DNA序列,该序列编码一个包含427个氨基酸的蛋白,包含一个HMG-box。进化树分析表明,Sp-Sox14与其他节肢动物的Sox14亲缘关系较近。实时定量PCR结果显示,Sp-Sox14在成蟹雌雄各组织中均有不同程度的表达,其中在卵巢和雄蟹心脏中的表达量最高。在胚胎发育过程中,SpSox14在复眼色素形成期的表达量显著高于其他时期。在性腺不同发育阶段,Sp-Sox14在卵黄发生前期(O2)的表达量显著高于卵巢其他发育阶段;而在精巢发育过程中,其表达量在成熟精子期(T3)高于精母细胞期(T1)和精子细胞期(T2)。推测其参与卵巢的前期发育以及精子成熟等过程。整胚原位杂交结果显示,Sp-Sox14在青蟹胚胎复眼色素形成期阳性信号定位于头部以及鄂足附近,在近孵化期定位于复眼附近,幼体孵出期则在头部仍有少量信号,暗示其与青蟹神经器官的形成以及体节附肢的发生有关。     

Involvement of FGF9/16/20 subfamily in female germ cell development of the Nile tilapia, Oreochromis niloticus

Fibroblast growth factors (FGFs) have been proved to participate in a wide variety of processes, including growth, differentiation, cell proliferation, migration, sex determination and sex differentiation. The roles of FGF9/16/20 subfamily members in the gonadal development of teleost fish have not yet been reported. Three FGFs (16, 20a and 20b) of the FGF9/16/20 subfamily were cloned from the Nile tilapia by RT-PCR and RACE. Phylogenetic, bioinformatic and syntenic analyses demonstrated that these cloned FGFs are genuine FGF16, 20a and 20b. Our analyses further supported the non-existence of FGF9 ortholog and the existence of two FGF20 paralogs in teleost genomes. Tissue distribution analysis by RT-PCR demonstrated that FGF16 was expressed in a wide range of tissues including the testis and ovary, FGF20b in the brain, pituitary, intestine and ovary, but not in the testis, while FGF20a in the brain, pituitary and spleen, but not in the gonad. These results were consistent with the Northern blot analysis. The expression profiles of FGF16 and FGF20b during normal and sex reversed gonadal development were investigated by real-time PCR. Both showed much higher expression in the XX ovary and 17 beta-estradiol induced XY ovary compared with the XY testis and fadrozole and tamoxifen induced XX testis, with the highest in both sexes at 120?dah. Strong signals of FGF16 and FGF20b were detected in phase II oocytes by in situ hybridization. These data suggest that FGF9/16/20 subfamily is involved in the early oocyte development of the female.     

不同倍性鲫鲤MeCP2基因分子克隆及时空表达分析

为了探寻不同倍性鱼生殖育性的表观遗传调控规律,实验基于不同倍性鲫鲤精巢的转录本信息库设计引物克隆了不同倍性鲫鲤的MeCP2基因。序列比对结果发现,在远缘杂交的过程中基因组发生了遗传重组和变异。基于序列公共部分设计引物,通过半定量PCR和实时定量PCR的方法分析了MeCP2基因在不同倍性鱼发育过程中的时空表达特征。结果还发现,MeCP2基因在所有组织中都有表达,但在脑组织中的表达量最高;纵向对比性腺的发育过程,MeCP2基因的表达量会随着性腺发育成熟而下降;横向对比不同倍性鱼的性腺发育,MeCP2基因在三倍体鱼卵巢中的表达量明显高于二倍体和四倍体鱼,但在精巢中的表达量随鱼的倍性增加而增加。研究表明,MeCP2基因的表达与不同倍性鱼的卵巢发育密切相关,这为研究鱼类生殖不育的分子机理及其在水产育种上的应用奠定了坚实的基础。     

半滑舌鳎HIRA基因部分cDNA序列克隆及表达分析

为研究HIRA基因在半滑舌鳎胚胎发育中的作用及其组织差异表达,以半滑舌鳎为研究对象,采用同源克隆策略从其精巢中分离了长度为764bp的HIRA部分cDNA序列,该片段编码254个氨基酸,具有5个wD结构域。对氨基酸进行比较发现,半滑舌鳎HIRA与比较物种的氨基酸序列具有很高的同源性,与红鳍东方纯亲缘关系最近。实时定量PCR分析发现,HIRA mRNA在多细胞期到原肠胚期的表达量较高,表明HIRA对胚胎发育起重要作用;HIRA在不同组织中表达差异显著,其中在性腺中表达最高,推测HIRA在维持性腺的功能方面有一定作用。     

皱纹盘鲍脯氨酰内肽酶的分离纯化及性质

脯氨酰内肽酶(Prolyl Endopeptidase,PEP)广泛分布在动植物和微生物体内,参与细胞生长和代谢调控。PEP在哺乳动物生殖器官的生长发育过程中起着重要作用,但贝类PEP与性腺发育是否有关尚未有相关报道。本研究以皱纹盘鲍为对象,采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)在性腺检测到有最高的基因表达量和较高的酶活性。通过硫酸铵分级沉淀和连续柱层析,从皱纹盘鲍性腺中分离纯化得到分子量约为82 ku,等电点约为5.5的PEP,其最适温度和最适pH分别为25 °C和6.0,在15~25 °C和pH 5~8能够保持较高的酶活性。利用LC/MS/MS分析纯化蛋白,得到182个氨基酸残基,与皱纹盘鲍脯氨酰内肽酶一致。圆二色谱分析显示,温度对PEP二级结构有较大的影响,拟合热变性温度为51.4±0.2 °C。为了进一步探究PEP在鲍鱼性腺发育过程中的作用,对不同发育时期(生长初期、前期、中期和后期)的雌雄鲍鱼,采用免疫印迹(Western Blot)和qRT-PCR分析性腺中PEP的蛋白和基因表达水平。结果表明,PEP在雄性和雌性性腺的各个时期均能被检测到,在雄性性腺的成熟中期和雌性性腺的成熟后期表达量最高。PEP在鲍鱼性腺不同发育时期时表达量的差异表明其可能参与到性腺发育的过程。