过氧化氢作用下东北红豆杉悬浮培养细胞中蛋白表达差异的研究

 东北红豆杉悬浮培养体系中加入一定浓度的过氧化氢,染色结果表明,过氧化氢可以诱导植物细胞发生过敏反应。应用蛋白质双向凝胶电泳技术,比较过氧化氢处理细胞与正常细胞的蛋白质组差异,分析过氧化氢对东北红豆杉细胞蛋白质表达的影响。结果表明,过氧化氢(3.5 mmol/L)处理48 h后的样品中有12个新增的差异蛋白点,而在对照中有1个特异蛋白点。这些差异蛋白可能与过氧化氢的作用及细胞发生过敏反应有关。     

几丁质酶与大豆抗胞囊线虫关系初步研究

 几丁质酶作为病原物和寄主植物相互作用中的一种重要蛋白质,已成为在植物抗病虫害研究中的热点。线虫卵壳及表皮的主要组成成分是几丁质,与真菌病原物一样,植物被线虫侵染时,可产生几丁质酶^[1]。     

小麦FtsH2蛋白与WYMV CP互作研究

 小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)是马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,主要危害冬小麦。实验室前期以WYMV外壳蛋白(coat protein,CP)为诱饵,通过酵母双杂交筛选小麦cDNA文库,发现FtsH2蛋白部分片段与WYMV CP互作。FtsH2蛋白是AAA蛋白酶家族成员,参与植物叶绿体光损伤修复和类囊体发育进程。本研究利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术进一步对FtsH2蛋白全长与WYMV CP进行互作验证,并鉴定互作结构域;利用荧光蛋白标记技术研究FtsH2蛋白与CP的亚细胞定位。实验结果表明FtsH2蛋白全长与CP互作;两者互作的关键结构域包含FtsH2蛋白低复杂区、跨膜区及AAA结构域和WYMV CP的中段区域(61-293 aa)。FtsH2蛋白单独表达时定位在细胞质、细胞核和叶绿体;CP单独表达时定位在细胞质;两者共同表达时亚细胞定位均没有发生明显变化,且主要共定位于细胞质中。WYMV CP与小麦FtsH2蛋白的互作可能会干扰植物绿叶体的发育和功能。本研究对了解WYMV的症状形成机制具有一定意义。     

小麦FtsH2蛋白与WYMV CP互作研究

 小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)是马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,主要危害冬小麦。实验室前期以WYMV外壳蛋白(coat protein,CP)为诱饵,通过酵母双杂交筛选小麦cDNA文库,发现FtsH2蛋白部分片段与WYMV CP互作。FtsH2蛋白是AAA蛋白酶家族成员,参与植物叶绿体光损伤修复和类囊体发育进程。本研究利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术进一步对FtsH2蛋白全长与WYMV CP进行互作验证,并鉴定互作结构域;利用荧光蛋白标记技术研究FtsH2蛋白与CP的亚细胞定位。实验结果表明FtsH2蛋白全长与CP互作;两者互作的关键结构域包含FtsH2蛋白低复杂区、跨膜区及AAA结构域和WYMV CP的中段区域(61-293 aa)。FtsH2蛋白单独表达时定位在细胞质、细胞核和叶绿体;CP单独表达时定位在细胞质;两者共同表达时亚细胞定位均没有发生明显变化,且主要共定位于细胞质中。WYMV CP与小麦FtsH2蛋白的互作可能会干扰植物绿叶体的发育和功能。本研究对了解WYMV的症状形成机制具有一定意义。     

大丽轮枝菌及激素处理后棉花酵母双杂交文库的构建

大丽轮枝菌是引起棉花、马铃薯等重要作物黄萎病的土传病原真菌,其分泌的胞外蛋白是侵染寄主的重要毒力因子,因此研究胞外蛋白与寄主的相互作用具有重要意义。本研究旨在构建高效的棉花酵母双杂交cDNA文库,并通过已知大丽轮枝菌效应子VCR1互作蛋白的筛选来评价构建文库的质量。分别采用大丽轮枝菌及茉莉酸甲酯、水杨酸和乙烯处理海岛棉‘海7124’以诱导其抗病基因表达,混合RNA样品构建酵母双杂交cDNA文库,文库滴度达1.18×10⁸ cfu/mL,检测重组率100%,插入片段在300~2000 bp之间。以效应子VCR1为诱饵筛选获得27个潜在互作蛋白,并进一步确证了1个与VCR1互作的靶标蛋白。本研究构建的酵母双杂交文库将为筛选与大丽轮枝菌效应子互作的蛋白及后续互作机理研究提供重要的研究基础。     

实时荧光定量PCR在植物害虫研究中的应用

实时荧光定量PCR技术作为一项新兴技术,以快速、准确定量、便捷等优点广泛应用于科学研究各个领域,越来越受到人们的重视。近年来,随着实时荧光定量PCR技术的发展和深入,大大提高了植物害虫的研究水平。本文结合了最近几年来应用于鉴定和研究植物害虫的情况,同时也介绍了在植物病原线虫和害螨研究中的应用,综合论述了实时荧光定量PCR技术在植物害虫研究中的应用。     

稻瘟病菌效应蛋白MoIEEP1功能初探

由稻瘟病菌引起的稻瘟病是全球最严重的植物真菌病害之一, 严重威胁水稻生产安全?效应蛋白是病原菌与植物对抗过程中分泌产生的一种蛋白质, 可作为毒力因子促进侵染或作为无毒因子触发防御反应?本研究对实验室前期筛选到的在稻瘟病菌侵染早期诱导表达的效应蛋白(infection-induced expression effector protein 1, MoIEEP1)进行了功能验证与分析?结果表明: MoIeep1 在稻瘟病菌侵染初期8 h表达量最高; 信号肽和亚细胞定位分析验证该蛋白N端含有17个氨基酸的信号肽且在水稻原生质体中呈明亮点状的定位信号, 初步推测该定位信号为过氧化物酶体或线粒体等细胞器; 与野生型菌株Guy11相比, MoIeep1 基因敲除突变体菌丝生长无明显差异, 但其致病性受到影响?以上研究结果为进一步探究该蛋白质的作用机理打下良好基础, 也为揭示其他效应蛋白在稻瘟病菌侵染水稻过程中的功能提供新的理论依据?     

野油菜黄单胞菌效应蛋白AvrXccC与拟南芥BIK1在植物体内相互作用

 AvrXccC是野油菜黄单胞菌Xcc8004的一个III型分泌效应蛋白。前期研究发现AvrXccC在拟南芥rar1突变体上发挥毒性功能,并且抑制植物的先天免疫反应。但是,AvrXccC在植物体内的毒性靶标还不清楚。本研究发现AvrXccC与植物体内的蛋白激酶BIK1发生特异的相互作用。然而,在拟南芥原生质体中,AvrXccC 并不能抑制鞭毛蛋白诱导的BIK1迁移,表明AvrXccC不是通过抑制BIK1的磷酸化来发挥功能的。有趣的是,AvrXccC可以在体外直接被BIK1磷酸化,我们推测AvrXccC可能作为BIK1的底物从而干扰了鞭毛蛋白诱导的先天免疫反应。     

大丽轮枝菌侵染抗感棉种的组织学过程观察

 棉花黄萎病是一种极难防治的土传性真菌病害,研究病原菌侵染棉花的组织学过程对致病机理解析和抗病资源利用具有重要意义。本研究利用绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌系统研究了其对抗病棉种海岛棉7124和三裂棉、感病棉种军棉1号和戴维逊棉的侵染过程。结果表明,大丽轮枝菌对抗/感棉种的初始侵染没有明显差异,接菌5 h后,分生孢子均能吸附在感病和抗病棉种的根表面。但侵染过程存在显著差异,侵染感病棉种中病原菌3~5 d到达皮层,5~7 d达到维管束,随后迅速扩展繁殖,侵染14 d后即完成系统侵染,并开始产生黄萎病症状;而病原菌侵染抗病棉种,5~7 d才侵入皮层,7~10 d到达维管束,14 d后仍无法扩展,病原菌的定殖与发展受到限制,无法形成系统侵染,较少形成黄萎病症状。本研究通过绿色荧光蛋白标记大丽轮枝菌对抗/感棉种的侵染过程研究,为大丽轮枝菌致病机理研究和抗性资源利用提供了强有力的理论依据。     

烟草叶片接种野火病菌后蛋白质表达差异

为了解烟草受野火病菌侵染后蛋白质表达变化情况,探讨烟草品种的抗病机制,本研究对烟草抗病品种‘K346’叶片进行人工接种,在接种后0～72h内分9次在接种点周围取无病原菌叶片组织提取叶片总蛋白,利用双向电泳技术分析接种处理叶片与未处理叶片的蛋白质表达差异,并选取6个减量表达蛋白点和4个增量表达蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱分析及数据库搜索鉴定,结果表明,6个减量表达蛋白包括参与植物呼吸代谢途径的ATP合成酶CF1α亚基、ATP合成酶CF1α链以及参与植物能量代谢循环途径的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶相关蛋白;4个增量表达蛋白包括参与植物氨基酸代谢途径的谷氨酰胺合成酶、参与糖类和碳循环相关途径的高等植物光系统II氧复合物中Psbp A链蛋白、叶绿体景天庚酮糖-1,7-二磷酸酯酶和光捕获叶绿素a/b结合蛋白。经过蛋白质功能分析,推测烟草是通过加速植株生长、促进抗病相关糖和蛋白的表达、增强氨基酸代谢以及植株自身蛋白的修复等方式来提高抗病性。     

大麦条纹花叶病毒中国株编码βC蛋白可以自身相互作用

以分别含有BSMV-CH基因组3个组分ds-cDNA全长的pMD-α、pMD-β和pMD-γ质粒为模板,PCR扩增BSMV-CH编码各蛋白基因,克隆至酵母双杂交载体,检测各蛋白是否存在自身激活特性,用酵母双杂交分析BSMV-CH编码蛋白之间的相互作用情况,测定β-半乳糖苷酶活性确认蛋白在酵母体内的作用,Western-blot分析蛋白的体外相互作用。结果表明成功克隆到BSMV-CH编码蛋白基因,并正确克隆至酵母双杂交载体,酵母双杂交检测未发现BSMV-CH编码蛋白之间的相互作用,但确定BSMV-CH编码的βC蛋白可以自身相互作用,体外可以单体或二聚体形式存在。     

植物根结线虫基因组学研究进展

根结线虫是世界农业生产中危害最大的植物病原之一,目前仍缺乏安全有效的防治措施。深入揭示寄生线虫与植物之间互作的分子机制,利用生物技术进行抗性育种被认为是最有前景的抗线虫策略。在根结线虫基因组学研究方面,目前已经构建了北方根结线虫AFLP遗传连锁图谱,南方根结线虫和北方根结线虫基因组测序也已完成;基因组的注释和比较基因组学分析,较全面地描述了根结线虫的遗传组成;以差异表达分析和比较基因组学为主的方法鉴定了大量的重要基因;以RNA干扰、植物转化和蛋白互作为主的根结线虫基因功能研究也取得了一些进展。本文就根结线虫基因组学研究予以综述,并进一步探讨其研究方向和可持续抗线虫新策略的发展前景。     

压力探针技术原理及其在植物水分关系研究中的应用

现代压力探针主要分为高等植物细胞压力探针、根压力探针、木质部压力探针和取样压力探针4个变种,并形成了相关的理论体系,广泛应用于植物生理学及其相关领域的研究中。现代压力探针技术不仅可用于高等植物细胞和组织水平水分关系、水和溶质的相互作用关系的研究,还可进行根木质部负压的测定及高等植物活体单细胞内含物的取样研究等。未来更可借助取样压力探针与微量分析技术的结合,将高等植物单细胞内的水分关系和代谢过程定量联系起来;或可试图拓宽木质部压力探针测定的压力范围,进一步研究和验证内聚力-张力学说的理论和机制。     

The Application of Flow Cytometry and Fluorescent Probe Technology for Detection and Assessment of Viability of Plant Pathogenic Bacteria

Conventional methods to detect and assess the viability of plant pathogenic bacteria are usually based on plating assays or serological techniques. Plating assays provide information about the number of viable cells, expressed as colony-forming units, but are time-consuming and laborious. Serological methods, such as the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunofluorescence microscopy (IF), can be performed in a shorter timespan than most plating assays, but they do not discriminate between live and dead cells. Flow cytometry (FCM) in combination with fluorescent probe technology is a rapid, sensitive, and quantitative technique to detect microorganisms and assess their viability. Quantitative information on the presence and viability of plant pathogenic microorganisms is valuable for risk assessment regarding disease transmission and disease development. FCM has been applied successfully in the fields of food microbiology, veterinary science, and medical research to detect and distinguish between viable and non-viable bacteria. The aim of this review is to show the potential of FCM and fluorescent probe technology for the field of plant pathology.     

Novel cytopathological structures induced by mixed infection of unrelated plant viruses

ABSTRACT When two unrelated plant viruses infect a plant simultaneously, synergistic viral interactions often occur resulting in devastating diseases. This study was initiated to examine ultrastructural virus-virus interactions of mixed viral infections. Mixed infections were induced using potyviruses and viruses from other plant virus families. Novel ultrastructural paracrystalline arrays composed of co-infecting viruses, referred to as mixed virus particle aggregates (MVPAs), were noted in the majority of the mixed infections studied. When the flexuous rod-shaped potyvirus particles involved in MVPAs were sectioned transversely, specific geometrical patterns were noted within some doubly infected cells. Although similar geometrical patterns were associated with MVPAs of various virus combinations, unique characteristics within patterns were consistent in each mixed infection virus pair. Centrally located virus particles within some MVPAs appeared swollen (Southern bean mosaic virus mixed with Blackeye cowpea mosaic virus, Cucumber mosaic virus mixed with Blackeye cowpea mosaic virus, and Sunn hemp mosaic virus mixed with Soybean mosaic virus). This ultrastructural study complements molecular studies of mixed infections of plant viruses by adding the additional dimension of visualizing the interactions between the coinfecting viruses.     

Advances and prospects in potato virology with special reference to virus resistance

Knowledge of the nucleotide sequences in the genomic nucleic acid of several potato viruses has enabled the open reading frames to be identified. These open reading frames are expressed by a variety of strategies, to produce proteins with functions in virus nucleic acid replication, virus particle production, cell-to-cell transport of virus and virus transmission by vectors. The activity of such proteins depends on their interactions with other viral or non-viral materials.Several other biological properties of plant viruses can also be related to individual viral gene products. For example, in plants co-infected with a specific pair of unrelated viruses, one virus can benefit from an ability to use the gene product of the second virus in replication, cell-to-cell transport or transmission by vectors. Similarly, different host resistance genes are targeted against viral replicase, movement protein or coat protein. Thus it is becoming possible to relate gene-for-gene (or more accurately, viral gene domain-host gene) interactions to events at the molecular level. Genetically engineered resistance to plant viruses likewise can be targeted against individual viral genes, and probably also against viral regulatory sequences. Such transgenic resistance seems likely to be as durable as conventional host resistance but durability should be improved by producing plants with combinations of resistances of different kinds, either conventional or genetically engineered, or both.     

稻瘟病菌CAAX蛋白酶MoRce1的功能研究

 蛋白质的翻译后异戊烯化修饰(CAAX修饰)能够介导真核生物中许多重要蛋白质的亚细胞定位以及蛋白与蛋白间的相互作用。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引致的稻瘟病是水稻最重要病害之一,造成全球水稻严重减产。为深入了解稻瘟病菌致病机理,更好地防控稻瘟病,我们研究了异戊烯修饰是否影响稻瘟病菌的生长发育和致病性。首先从稻瘟病菌基因组数据库中鉴定到一个稻瘟病菌的异戊烯蛋白酶MoRce1,同源比对发现MoRce1保守结构域在各物种之间变化较大,猜测在不同物种中该蛋白可能出现了功能分化。经同源重组方法敲除MoRCE1基因,发现MoRCE1缺失突变体在胁迫培养条件下细胞壁完整性明显缺陷,但是对营养生长、产孢、萌发以及致病性没有明显影响,说明MoRce1蛋白可能通过参与稻瘟病菌细胞壁合成相关蛋白的异戊烯化修饰进而影响该菌细胞壁的完整性,其具体机制还有待深入研究。     

基于TaqMan MGB探针的葡萄茎枯病菌实时荧光PCR检测方法

 葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物。带菌植物材料是病害传播的重要载体,准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行口岸检疫措施及研究病害防控措施的有力工具。根据葡萄茎枯病菌及其近似种的细胞骨架蛋白(Actin)基因序列差异,设计并合成1对引物和1条特异性TaqMan-MGB探针,建立了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测方法。通过对反应体系的优化,确定了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR最佳反应条件:引物终浓度为0.6 μmol·L^-1,探针终浓度为0.6 μmol·L^-1。灵敏度试验结果显示,最低检测限为总DNA含量20 pg(20 μL反应体系)。此方法快速灵敏,整个反应1 h即可完成,检测过程完全闭管,无需PCR产物后续处理,为快速检测葡萄茎枯病菌提供了重要参考。该方法用于口岸疑似菌株检测,可成功检测出葡萄茎枯病菌。本研究建立的基于TaqMan MGB探针的荧光定量PCR检测方法为葡萄茎枯病菌的早期快速检测监测提供了有力工具。