Duddingtonia flagrans冻干制剂厚壁孢子优化培养及其杀线虫幼虫剂量研究

【目的】探究捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans冻干制剂厚壁孢子的批量培养方法及其对线虫幼虫的毒杀剂量。【方法】通过玉米粒或大麦粒培养基的单步培养法,以及先在含有0.05%琼脂粉的沙氏葡萄糖肉汤培养基中培养7d后继而转接到玉米粒或大麦粒培养基的双步培养法,以培养3~5周后洗脱的每克固体培养基中的厚壁孢子数为依据,对D.flagrans的最优培养方法进行筛选;然后使用最优培养法培养D.flagrans厚壁孢子并将其冻干后用于体外杀线虫幼虫试验,研究D.flagrans冻干制剂的杀线虫幼虫剂量。【结果】培养基质不同时,D.flagrans的菌落颜色有一定差异,玉米粒培养基中的菌落颜色呈微黄色,而大麦粒培养基中的菌落呈白色;D.flagrans的适宜培养时间为3周。采用单步培养法时,玉米粒培养基培养的厚壁孢子数量为2.4×10~5个/g,大麦粒培养基培养的厚壁孢子数量为3.2×10~5个/g;而采用双步培养法时,玉米粒培养基培养的厚壁孢子数量为3.0×10~5个/g,大麦粒培养基培养的厚壁孢子数量为3.5×10~5个/g。D.flagrans冻干制剂杀线虫幼虫剂量的阈值为每克粪便4×10~5个D.flagrans厚壁孢子,相应对线虫幼虫的杀虫率为95.2%。【结论】采用双步培养法培养厚壁孢子并将其制备成冻干制剂,在D.flagrans生物防治寄生性线虫病方面有较好的应用前景。     

捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌CIMHI株捕食特性研究

报道了首次从国内土壤中分离出的捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌 CIMHI 株(Arthrobotrys oligosporaStrain:CIMHI)对马线虫三期幼虫捕食活性、捕食效力以及杀虫机理。研究表明该菌株生长环境对其捕食活性有很大影响。其捕食活性在20℃、有氧环境、玉米粉浓度相对较低且菌丝较稀疏的培养基中最强,菌株的捕食活性是在马线虫三期幼虫体内存在的可以诱导少孢节丛孢菌 CLMHI 产生捕食线虫性器官的物质以及虫体运动刺激下产生的。其杀虫机理是通过菌株产生的收缩或不收缩的菌环粘性茵网菌丝,菌结等捕     

温度和pH对捕食性线虫真菌分离株少孢节丛孢菌生长的影响及生物学特性观察

为了观察捕食性线虫真菌少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)的生长及pH值和温度对该菌生长的影响,试验将分离株少孢节丛孢菌丝接种于0.4g/L玉米粉琼脂培养基(CMA)中,分别置15、20、25、30、35℃恒温箱中培养,又将菌种分别接种到pH值为5.5、6.0、6.5、7.0的0.4g/L玉米粉琼脂培养基,每天定时观察菌株的发育情况,测量菌丝生长长度.结果表明:A.oligospora在pH值为5.5~7.0的环境下均能生长,其中以pH为6.0时生长速度最快;在温度为15~35℃时均能生长,其中以25℃时菌丝生长速度最快.此外,对真菌分离株生物学特性进行了描述和图片说明,特征为:分生孢子梗无色、直立、不分枝、分隔,分生孢子丛状着生、无色、具1个隔、梨形至倒卵形,捕食线虫的器官为三维粘性网.上述结果为进一步研究A.oligospora的生物学特性及批量化培养奠定了重要基础.     

棉花黄萎病菌菌丝生长和产孢量的影响因素研究

研究不同温度、pH值以及碳源、氮源对棉花黄萎病菌菌丝生长速率和分生孢子产生量的影响。结果表明,在0~33℃下,供试菌株均能生长,最适温度为25℃;在pH值为3~10时均能生长,最适pH值为5~8;葡萄糖作为碳源时,该病菌在培养基平板上生长最快,分生孢子的产生量最大;氮源以硝酸钠为最佳,其次为脲。硫酸铵作为氮源时菌丝生长速率低于无氮源对照,菌落不形成微菌核,产孢量小,这说明硫酸铵为氮源时不利于病菌菌丝生长及微菌核和分生孢子的形成。     

捕食线虫性真菌—少孢节丛孢菌口服生物制剂安全性试验

为研究少孢节丛孢菌口服生物制剂的安全性,将20只6月龄绵羊分成4组,前3组分别灌服含有1.0×105、1.0×106、1.0×107少孢节丛孢菌分生孢子口服生物制剂,第4组为对照组灌服灭菌的生理盐水,灌服后连续30d观察绵羊的各项临床指标;并在7d后每组分别剖检2只绵羊,无菌采集绵羊各器官组织,进行组织切片和少孢节丛孢菌的分离鉴定;另外,将12只感染捻转血矛线虫后的绵羊分成3组,灌服3个不同剂量的生物制剂后测定其对粪便中线虫的捕食活性。结果表明,绵羊的精神状态、食欲、饮水、体温、粪便、增量正常;绵羊肝脏、脾脏、肾脏、肠道淋巴结等组织器官没有出现病理变化;也未从上述组织中分离出少孢节丛孢菌;3个不同剂量的生物制剂均可显著降低绵羊粪便中的幼虫数量。研究结果证实,少孢节丛孢菌口服生物制剂安全有效,无毒副作用。     

捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）CIMH1株形态学研究

捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌CIMH1株在不同发育时期有菌丝和孢子两种形态。只有在捕食对象－活的线虫幼虫存在条件下，该菌株才能产生捕食性结构－菌环、菌网等。菌环、菌风孢子具有一定的形态学特征。     

红麻线粒体基因NAD3和COB的RNA编辑与表达分析

以红麻细胞质线粒体近等基因系UG93A(不育系)、UG93B(保持系)及UG93A×福红992(恢复系)的F1代为材料,研究花药线粒体基因NAD3和COB的转录与表达。结果发现,在3种供试材料中,基因NAD3的CDS区在DNA水平和RNA编辑水平上均无差异;不育系与保持系的COB基因DNA编码序列无差异,但在RNA水平上发生了编辑,8个位点的编辑均发生于密码子的第一或第二位碱基,且导致氨基酸种类变化,主要为亲水性氨基酸转变为疏水性氨基酸;COB基因在UG93A中的RNA编辑频率低于UG93B;NAD3和COB基因在3种材料中的转录本大小基本相同,但在表达水平上表现为不育系显著低于保持系和F1代。由此推测NAD3和COB基因在红麻花药发育过程中有着重要的作用。     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

食线虫性真菌弯孢节丛孢菌的分离及捕食线虫过程的观察

【目的】从牛羊相关联的基质中分离食线虫性真菌弯孢节丛孢菌Arthrobotrys musiformis并进一步观察该分离株对捻转血矛线虫Haemonchus contortus 3期幼虫和秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的捕食过程。【方法】用诱饵平板技术分离弯孢节丛孢,然后借助扫描电镜观察弯孢节丛孢对捻转血矛线虫3期幼虫和秀丽隐杆线虫作用的动态过程。将该菌分离株NPS045接种在表面铺有纤维素膜的20 g·L-1水琼脂平皿中培养4 d后并加入试验线虫,于2种线虫捕捉后不同时间段取样观察。【结果】电镜观察结果显示,加入试验线虫后5 h该菌产生捕食结构并开始捕捉2种线虫;弯孢节丛孢对捻转血矛线虫3期幼虫于捕捉后22 h刺入角质层,56 h虫体有侵入性菌丝长出,68 h消化完全;秀丽隐杆线虫于捕捉后14 h刺入并明显皱缩,19 h虫体严重皱缩,24 h消化完全。【结论】从1 502份与牛羊相关的样品中分离出17株弯孢节丛孢菌,其在总样品中的检出率为1.13%。     

不同碳、氮源对球孢白僵菌生长及产孢的影响

为白僵菌规模化生产和开发利用,以含碳量8g.L-1的葡萄糖、含氮量0.29g.L-1的蛋白胨及无机盐为固体基础培养基,用蔗糖等3种碳源(酵母膏等4种氮源)分别等量取代基础培养基中的葡萄糖(蛋白胨),研究了不同碳、氮源对5株球孢白僵菌菌株的菌丝生长和产孢的影响。结果表明,葡萄糖或麦芽糖对菌株B70、B72和B76的生长和产孢明显优于其它碳源,相对于无机氮源,有机氮更利于上述菌株孢子的形成。菌株B76在生物量和产孢上对氮源的利用表现出明显的选择性,硫酸铵显著促进菌丝的生长,而玉米浆更利于孢子形成,其生物量及产孢量分别为645.7mg.菌落-1和3.6×109孢子.菌落-1。菌株B246、B252在研究设定的碳氮营养条件下,产孢量明显低于其它菌株,但多糖类可溶性淀粉作为碳源或硝酸钠为氮源显著促进了菌株的生长,菌丝生长旺盛,以硝酸钠为氮源菌株B246、B252生物量最高,分别达1 188.6mg.菌落-1和1 180.5mg.菌落-1,表现出对碳氮源利用的特异性。     

华山松蓝变真菌(Leptographium qinlingensis)的生物学特性研究

【目的】秦岭细粘束孢(Leptographium qinlingensis)是华山松大小蠹成虫携带的致病性真菌,在华山松大小蠹入侵健康华山松后,于寄主韧皮部和木质部边材组织与细胞内发育,分解树脂道泌脂细胞和薄壁细胞,进而影响华山松树脂代谢和水分代谢。对秦岭细粘束孢的生物学特性进行研究,可为华山松大小蠹的综合防治提供理论依据。【方法】通过室内抑菌试验,测定不同温度(5,10,15,20,25,27.5,30和35℃)、培养基(PDA、麦芽汁、察氏和PDA+华山松韧皮部浸提液)、pH值(4.0,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0和8.0)、水势(-0.2,-0.5,-1.0,-1.5,-2.0和-2.5 Mpa)和松针汁(华山松、油松、白皮松、云杉)对秦岭细粘束孢菌丝和孢子发育的影响,并比较了氧化铜、甲霜灵、甲基托布津、代森锌、链霉素和多菌灵6种杀菌剂的抑菌活性。【结果】秦岭细粘束孢菌丝生长的适宜温度为20~30℃,菌丝最适生长温度为27.5℃,产孢最适温度为20℃;该菌在麦芽汁培养基中生长和产孢最好;菌丝生长和孢子发育的适宜pH为4.0~6.5,以pH值5为最佳;在高水势环境下生长较好,菌丝体生物量随培养基水势的降低而不断减少;在添加华山松针叶汁的PDA培养基中,菌丝生长和产孢最好;代森锌、甲基托布津、甲霜灵和氧化铜均有较强的抑菌作用,其中以代森锌效果最明显。【结论】初步探明了秦岭细粘束孢菌丝生长和产孢的最适温度、培养基、pH值和培养基水势;进一步证明了秦岭细粘束孢对寄主华山松营养的高度选择性;筛选出了对秦岭细粘束孢抑菌效果较好的杀菌剂。     

加利利链霉菌AF1产孢条件的优化

【目的】筛选加利利链霉菌(Streptommyces galilaeus)AF1菌株孢子的最佳培养条件。【方法】利用固体发酵法,首先采用单因素试验对培养加利利链霉菌(Streptommyces galilaeus)AF1菌株的固体产孢基质大米、玉米粉、木薯渣、黄豆粉、麸皮、麦片进行筛选,然后研究培养时间、温度、料液比、接种量、外加碳源、外加氮源对加利利链霉菌AF1产孢量的影响。在单因素试验的基础上,采用正交试验对AF1菌株的产孢条件进行优化。【结果】筛选的最佳固体产孢基质为大米。优化得到的最佳培养条件为培养温度28℃,培养时间6d,接种量10%(每20g大米接种2mL孢子悬液),初始料(g)液(mL)比为1∶1,葡萄糖添加量1.5%(质量分数),蛋白胨添加量1.5%(质量分数)。在最佳培养条件下,加利利链霉菌AF1产孢数可达3.87×109 g-1,比优化前提高了29%。【结论】在优化培养条件下得到的加利利链霉菌AF1产孢水平高,能适应大规模培养接种体的要求。     

马缨杜鹃炭疽病病原菌生物学特性及防治药剂筛选

目的 探明贵州百里杜鹃自然保护区马缨杜鹃Rhododendron delavayi炭疽病菌Colletotrichum fioriniae生物学特性,并筛选出有效药剂。方法 采用菌丝生长速率法测定马缨杜鹃炭疽病菌生物学特性;选用二氰蒽醌、吡唑醚菌酯、 溴菌腈、丙环唑、苯醚甲环唑、肟菌·戊唑醇、四霉素、乙蒜素、蛇床子素及宁南霉素对该病原菌的室内毒力进行测定;选择作用机制不同、抑菌活性较高的2种药剂按不同比例复配,测定其对马缨杜鹃炭疽病菌菌丝的联合毒力。结果 病原菌在5~35 ℃、pH 5~11均能生长,最适温度为25 ℃,最适生长pH为8,最适碳源为葡萄糖和可溶性淀粉,最适氮源为蛋白胨,最适培养基为PSA。室内毒力测定结果表明,所选药剂对病原菌菌丝生长均有一定抑制作用,其中,肟菌·戊唑醇、吡唑醚菌酯、四霉素、苯醚甲环唑和丙环唑抑制效果较好,EC₅₀分别为0.102、0.118、1.107、1.202和2.101 mg/L;其次为蛇床子素,EC₅₀为6.803 mg/L。选用四霉素与苯醚甲环唑进行混配,结果表明不同配比对病原菌的联合毒力较单剂均具有协同增效作用,增效最佳配比为7 ∶ 3,共毒系数(Co-toxicity coeffecient, CTC)达584.56,明显高于其他配比;配比为6 ∶ 4和8 ∶ 2 时,对应CTC均在500以上,仅次于最佳配比。结论 马缨杜鹃炭疽病菌的生长受温度、pH、培养基成分、碳氮源影响明显。四霉素和苯醚甲环唑不同比例复配活性增效明显,可选择7 ∶ 3复配比例进行田间防治。     

油料植物红皮糙果茶与油茶叶片光合特性研究

为探明油料植物红皮糙果茶（Camellia crapnelliana Tutcher）光合作用日变化体征,为其科学栽培提供理论依据, 采用Licor-6400便携式光合作用测定仪测定红皮糙果茶和油茶（Camellia oleifera L.）的光合生理特性及环境因子的日变化,并进行分析研究。结果表明,在晴天条件下红皮糙果茶净光合速率曲线呈双峰状,自9:10至13:10期间有一个长达4 h的高效光合平台期（19.7～20.2 μmol·m^-2·s^-1）,最大值为20.2 μmol·m^-2·s^-1。气孔导度日变化与油茶相似呈单峰曲线于13:10达到峰值0.22 mmol·m^-2·s^-1,但其蒸腾速率整体高于油茶。油茶无明显光合“午休”现象,净光合速率最大值出现在中午11:10,为20.1 μmol·m^-2·s^-1。相比之下红皮糙果茶光合作用时间较长,总光合产率较高。     

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。     

深绿木霉对青蒿的促生作用

为了研究深绿木霉对青蒿的促生作用,用深绿木霉菌丝体和孢子分别施用于苗期和成株期的青蒿,统计比较各项生长发育指标和生理指标.结果表明:与清水对照相比,深绿木霉菌丝体和孢子均能显著促进青蒿幼苗生长,但对大田成株青蒿没有显著促生作用.深绿木霉适合作为青蒿苗肥,部分替代化肥.     

米槁根部内生促生真菌筛选及其促生特性研究

【目的】筛选米槁(Cinnamomum migao)根部内生促生真菌菌株,探究其对米槁幼苗生长生理的影响。【方法】从贵州省黔南布依族苗族自治州的祥乐村、坝碰村和平艾村采集米槁鲜根,分离纯化得到内生真菌,利用透明圈法对所得菌株进行促生作用研究,将所得菌株接种至蒙金娜无机磷固体培养基、解钾固体培养基及King液体培养基进行促生能力测定,筛选促生能力强的菌株;再将筛选所得菌株分别回接至米槁幼苗,以接种等量空白培养基为对照,培养180 d后测定幼苗的生长生理指标。【结果】从米槁根部分离纯化得到41属177株内生真菌,利用透明圈法筛选得到16株具透明圈的真菌;促生能力测定结果表明,球毛壳菌（Chaetomium globosum）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、深绿木霉（Trichoderma atroviride）及深色有隔内生真菌（Acrocalymma vagum）4株菌株具有较高促生潜力。接种试验结果表明,球毛壳菌能显著促进米槁幼苗对钾的吸收,哈茨木霉能显著促进过氧化氢酶(CAT)活性及幼苗对磷的吸收,深绿木霉能显著促进米槁幼苗苗高及地下部分的生长,深色有隔内生真菌能显著促进幼苗SOD活性。4种促生菌对米槁幼苗的促生作用不同,其中促生菌的产IAA能力与米槁幼苗的生长显著相关,溶磷、解钾能力与PPO活性呈显著负相关（P<0.05）。【结论】球毛壳菌、哈茨木霉、深绿木霉及深色有隔内生真菌对米槁幼苗生长均有促进作用,但不同菌种对米槁幼苗生长发育的作用机理不同。     

1株间座壳属真菌抗松材线虫的活性

筛选对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)有致死作用的内生真菌。从苦楝(Melia azedarach)健康组织(茎、叶、果实)中分离纯化内生真菌,菌株采用摇瓶培养,发酵液和菌丝体分别用乙酸乙酯萃取制备胞外和胞内代谢产物,采用浸渍法进行杀线虫活性筛选。共计分离纯化31株内生真菌,其中菌株J352-03的发酵液对松材线虫有显著的毒杀活性,在2 mg·mL^-1质量浓度下处理48 h,菌株J352-03胞内、胞外的次生代谢产物对松材线虫校正死亡率均达到100%,LC₅₀值分别为0.46 mg·mL^-1、0.42 mg·mL^-1;对松材线虫卵的孵化抑制率分别为66.54%、76.04%,松材线虫体内三磷酸腺苷酶(ATP酶)、过氧化氢酶(CAT)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著低于对照组。菌株J352-03经形态学与rDNA-ITS序列分析鉴定为间座壳属一未知种Diaporthe sp.。综上所述,菌株J352-03对松材线虫有良好的生防潜力,具有进一...     

土壤中棒束孢菌的生物多样性及对黄曲条跳甲的活性

目的 调查国内部分地区不同土壤中棒束孢属Isaria真菌的多样性分布,测定其对黄曲条跳甲Phyllotreta striolata的生物活性,促进棒束孢菌对黄曲条跳甲的生防应用。方法 从福建、广东、广西、云南、贵州、湖南、湖北、河南、河北等地的不同生境中采集土壤样品,通过选择培养基分离纯化棒束孢菌株,根据形态学和分子标记鉴定菌种,采用多样性指数与优势度指数评价生物多样性;采用浸虫法测定棒束孢菌株对黄曲条跳甲成虫的生物活性。结果 从200余份土壤样品中分离得到棒束孢属真菌41株,优势菌种是爪哇棒束孢Isaria javanica,有34株,优势度指数为0.829;玫烟色棒束孢I. fumosorosea有5株,粉棒束孢I. farinosa和环链棒束孢I. cateniannulate各1株。林地物种丰富度最高,多样性指数为1.121,休耕地、果园、耕地和草地的多样性指数范围为0~0.349;林地种间分配最均匀,优势度指数为0.468,休耕地、果园、耕地和草地的优势度指数范围为0~0.159。生测结果表明,大部分供试的棒束孢菌株对黄曲条跳甲都有一定活性,玫烟色棒束孢IfH6102菌株对黄曲条跳甲的活性最高,在处理黄曲条跳甲成虫11 d后,其校正死亡率达60.89%。结论 棒束孢菌在我国土壤中分布广泛,林地生境中的物种多样性最丰富,棒束孢菌具有防治黄曲条跳甲的应用潜力。