鹦鹉禽多瘤病毒陕西株VP1基因的克隆及荧光定量PCR检测方法的建立

为了解鹦鹉禽多瘤病毒(APV)陕西分离株(SX-2018株)VP1基因的分子特征,并建立可用于临床的快速灵敏的APV检测方法,本研究通过PCR扩增了SX-2018株VP1基因序列,并与22株国内外参考株进行了核苷酸同源性比较和遗传进化分析。结果显示:扩增的SX-2018株VP1基因全长为1 032 bp,与其他APV分离株核苷酸相似度为99.1%～100.0%;遗传进化分析显示SX-2018株属于CladeⅡ分支。设计针对VP1基因的特异性引物(209 bp)并构建其相应的质粒标准品,以不同浓度的该质粒标准品为模板扩增并绘制了标准曲线,通过条件优化建立了APV SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法仅特异性扩增APV,与鹦鹉其它常见病毒无交叉反应,特异性强;对质粒标准品检测的最低浓度达5.4×101拷贝/μL,为常规PCR的100倍;组内组间变异系数分别小于0.5%、1.5%,重复性好。利用该方法与常规PCR方法对疑似APV感染的30份样品进行检测并比较,结果显示:建立的APV SYBR Green荧光定量PCR检测方法与常规PCR的符合率为86.67%,且阳性检出率高于常规PCR。本研究为我国鹦鹉APV的分子流行病学调查提供了参考数据,为在鹦鹉群中开展该病的筛查提供了有效的技术手段。     

山东省3家鹦鹉养殖场多瘤病和喙羽病的病原检测与序列分析

2018年山东省某养殖场发生大量幼龄鹦鹉死亡事件,疑似为病毒感染。为探寻病因,开展了该场及省内另外两个鹦鹉养殖场的流行病学调查。利用PCR技术对临床样品中提取的DNA或RNA进行检测,结果发现新城疫与禽流感病毒均呈阴性,而禽多瘤病毒(APV1)与鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)呈现为强阳性,由此推断此3个鹦鹉养殖场存在APV1和PBFDV感染,平均病毒检出率分别为67.9%与71.4%,共感染检出率率为58.0%。对阳性样品进化全基因分析发现:区域内的PBFDV流行毒株同源性高,与该地区早期报道的毒株亲缘关系较为接近;APV1的VP1基因同源性较高,与欧洲分离毒株亲缘关系较为接近,说明我国流行的APV1或来源于进口鹦鹉。本研究警示,需要加强鹦鹉疾病防控,严格鹦鹉进出口检疫,并制定和健全标准的鹦鹉病检疫程序。     

PCR结合斑点杂交技术检测鹦鹉喙羽病病毒方法的建立及应用

鹦鹉喙羽病(PBFD)是鹦鹉目前最常见的疾病,对鹦鹉养殖业危害极其严重。根据鹦鹉喙羽病毒(PBFDV)基因片段的克隆和序列分析,设计合成1对特异性引物,以CP基因为模板,经PCR扩增获得830 bp的核苷酸DNA,并用DIG标记DNA,制备用于检测PBFDV的特异性核酸探针。用该核酸探针对疑似感染PBFDV的鹦鹉病料进行斑点杂交检测,并对鉴定为阳性的PBFDV进行全基因组扩增和测序分析。结果显示,利用PCR结合斑点杂交技术检测PBFDV,特异性强、敏感度高,具有可重复性。鉴定为阳性的2株PBFDV全基因组序列之间同源性为100%,与已报道序列的同源性为81.5%～98.9%。本研究为我国开展PBFDV感染的分子流行病学调查和临床诊断提供了一种敏感、特异的检测方法。     

一株禽多瘤病毒的分离鉴定及其VP1基因序列分析

从陕西某养鸟场发病鹦鹉幼雏体内分离到1株禽多瘤病毒(201808SX株),该病毒能在7日龄SPF鸡胚上繁殖,并呈现明显的胚体病变。通过克隆测序,获得了禽多瘤病毒(201808SX株)VP1基因全基因序列。同源性分析表明,201808SX分离株与不同地区不同时间APV分离株的VP1基因核苷酸同源性均较高,不低于99.4%,与2006年日本分离株、2009年中国潍坊分离株、2018年中国山东分离株和2018年中国C4-15分离株等同源性最高,均为100%。遗传进化分析表明,201808SX分离株在遗传进化上与2006年日本分离株、2009年中国潍坊分离株、2018年中国山东分离株、2018年中国C4-15株、2010年波兰分离株和2016年葡萄牙分离株处于同一小分支,均属于CladeⅡ分支。这是国内首次报道,将临床病料组织上清经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚成功地分离到APV,这为BFD的研究和防控奠定基础。试验结果也首次证实陕西地区虎皮鹦鹉中存在APV感染,丰富了国内APV流行的基础数据。     

蜜蜂KBV和APV病毒RT-PCR检测技术研究

根据蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus．KBV)和急性麻痹病毒(Acute paralysis virus，APV)的RNA聚合酶基因序列，参照Don Stoltz报道的引物KBV1、KBV2，美国农业部提供的引物DC62F、DC682R，对美国农业部惠赠的标准KBV和APV的RNA聚合酶基因片段，以及2001—2002年收集到的中国21个省市的180份疑似KBV和APV病蜂RNA聚合酶基因片段进行RT—PCR。对以KBV1、KBV2和DC62F、DC682R为引物扩增出的RNA聚合酶基因片段进行克隆、转化，并对克隆结果测序，证明其可靠性。建立了用分子生物学方法检测蜜蜂KBV和APV病毒的技术，有一定的应用前景。检测结果表明：到目前为止，我国蜜蜂群中未发现KBV和APV病毒病。     

鹦鹉幼稚病PCR诊断方法的建立与应用

建立一种鹦鹉幼稚病(BFD)PCR诊断方法,为临床快速确诊鹦鹉幼稚病提供技术手段。参考GenBank中公开的BFDV基因组序列,设计了2对用于阳性质粒构建引物和1对检测引物,采用套式PCR从临床疑似病料中扩增BFDV VP1基因,构建VP1基因阳性质粒,以阳性质粒为模板,优化检测引物扩增体系与条件,进行灵敏度试验、特异性检测和临床样品检测,挑选3份不同地区阳性样品测序验证。结果显示,成功构建了BFDV VP1基因阳性质粒pGEM-T-VP1,建立的PCR检测方法检测下限为105.8copies/μL。用该方法检测时仅能以pGEM-T-VP1为模板扩增到目的条带,检测5种常见禽病毒均为阴性。应用建立的方法对75份疑似病料进行检测,结果19份为阳性,阳性率为25.3%。测定了3株不同地区BFDV流行毒株VP1基因片段序列,比对分析发现核苷酸序列同源性为99.4%～100%,在基因进化树上这3株病毒处在一个独立的分支上,显示出一定的地域特征。成功建立了一种灵敏度高、特异性好的BFD PCR诊断方法,应用于临床诊断显示出良好效果。     

我国大陆地区首例鹦鹉喙羽病的诊断及其致病病毒C1基因的序列分析

2008年7月末,我国青岛即墨地区患病的虎皮鹦鹉幼雏出现体重下降、脱羽和羽毛变形萎缩、鸟喙变形及胸腺结构变异等症状,怀疑为鹦鹉喙羽病(PBFD)。利用PCR对濒死鹦鹉进行鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)的检测,并对扩增的C1基因进行了测序与分析。结果表明,有两只检测为PBFDV阳性,B last分析发现,QD-CN08株与GenBank中已发表的PBFDV分离株C1基因同源性为82%~93%,进化树分析表明与日本的毒株有比较近的亲缘关系。结合临床症状、流行病学特征和实验室诊断,确诊为鹦鹉喙羽病,此病为中国大陆首次报道。     

用地高辛标记核酸探针检测猪细小病毒的研究

根据猪细小病毒(PPV)基因组序列,设计引物克隆了PPV YK株保守序列NS1基因,将NS1基因纯化,利用地高辛标记制备了NS1基因PCR产物探针和克隆NS1探针,两种核酸探针的标记都达到了0.1 pg/μL。特异性试验结果表明,这两种探针都能与PPV DNA发生特异的阳性杂交,而与对照的PRV、PCV、PRRSV和HCV的核酸杂交呈阴性。敏感性试验结果表明,克隆NS1探针敏感度为0.5 pg/μL,NS1基因PCR产物探针敏感度为1 pg/μL。综上所述,这两种DIG标记探针特异性强,敏感性高,可用于PPV的检测。     

依赖于核酸序列恒温扩增技术快速检测副溶血性弧菌方法的建立

为建立副溶血性弧菌的快速检测方法,本研究采用依赖于核酸序列恒温扩增(NASBA)技术,以副溶血性弧菌的tlh基因为扩增的靶基因设计特异性引物和探针,建立可快速扩增副溶血性弧菌的NASBA方法.特异性和灵敏度试验结果表明:该NASBA方法对副溶血性弧菌的最小检出量为5.1×102 cfu/mL,高于普通PCR方法,而且与其他种属的菌无任何交叉反应.此外,本研究将副溶血弧菌扩增产物采用通用型核酸扩增物快速检测板进行检测,实现了特异性强的快速副溶血弧菌的检测.该方法对仪器要求低,具有良好的应用前景.     

核酸探针检测犬瘟热病毒方法的建立和初步应用

根据犬瘟热病毒（CDV）基因序列的结构特点,在其编码核衣壳蛋白的高度保守基因区内,设计合成一对特异性引物.以RT-PCR技术从CDV基因中扩增出了一段长度为430 bp的核苷酸cDNA,并制备出地高辛标记的CDV核酸探针.特异性检测结果表明,该探针能与CDV标准株和地方分离株核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV、MV等病毒的核酸杂交反应均为阴性.敏感性检测结果表明,该探针对CDV的检出量可达到0.1 pg.用所制备的核酸探针对某宠物诊所疑似犬瘟热病例进行临床诊断初步应用试验,表明该标记探针完全可用于CDV的临床检测.     

Development and Preliminary Application of a Semi-nested PCR Assay for Detection of Chicken Parvovirus

In order to set up and optimize a semi-nested PCR for rapid detection of chicken parvovirus (ChPV), three specific primers were designed according to conserved sequences of NS 1 gene of ChPV. The specificity and sensitivity of ChPV semi-nested PCR were tested, and the assay was applied to detect 48 clinical samples. The specificity and sensitivity tests showed that this semi-nested PCR was only sensitive to ChPV for amplifying specific band of 186 bp and it could detect 5.62 fg/μL of ChPV DNA, without any sensitivity to other viruses, such as Newcastle disease virus, H9 subtype avian influenza virus, Marek's disease virus, infectious laryngotracheitis virus and infectious bronchitis virus. 48 chicken samples were detected and the positive rate was 16.67% (8/48). The results of our study demonstrated that the optimized semi-nested PCR could be a method that was suitable for clinical detection of ChPV.     

鸡细小病毒半巢式PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、特异、灵敏的检测鸡细小病毒（chicken parvovirus,ChPV）的方法,根据ChPV的保守基因NS1设计了3条特异性引物,建立并优化了能快速检测ChPV的半巢式PCR方法,对其进行特异性和敏感性试验,并用所建立的方法对48份临床样品进行了检测。特异性和敏感性试验结果显示,建立的半巢式PCR只对ChPV敏感,扩增产物为186 bp的特异性条带;其最低能检测到5.62 fg/μL的ChPV DNA;而对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒不敏感。临床检测结果显示,同时对48份临床样品进行检测,检出率为16.67%（8/48）,提示广西区内鸡群存在ChPV感染。本研究建立的ChPV半巢式PCR方法适用于ChPV的临床检测。     

1型、2型牛病毒性腹泻病毒通用RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测1型、2型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的通用RT-PCR方法,根据GenBank上收录的64株1型、2型BVDV以及1株猪瘟病毒(CSFV)的全基因组序列,应用Primer 6.0软件设计针对5'-UTR区域的1型、2型BVDV特异性通用引物对,扩增目的片段,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性试验及利用该方法开展临床样品检测。结果显示:扩增的目的片段长度约为302 bp;该方法的灵敏度为2.09×102 copies/μL,无非特异性扩增,且重复性良好。对采自山东省发病牛场的13份鼻腔棉拭子和9份牛血清临床样品进行检测,发现有8份鼻腔棉拭子和8份血清为BVDV阳性,随机抽取4份阳性样品送测序,发现3份样品毒株为1型BVDV,1份样品还需进一步鉴定。本研究建立的RT-PCR方法可实现对1型、2型BVDV核酸的特异性检测,也可用于该病的流行病学调查研究。     

小反刍兽疫实时荧光PCR检测方法的建立及应用

以小反刍兽疫病毒N基因序列为靶基因,通过设计引物及TaqMan探针建立快速检测小反刍兽疫的荧光PCR方法.在线BLAST分析结果表明:所设计的引物特异性强,可区分小反刍兽疫病毒及牛瘟病毒感染;所建立的方法检测线性范围为1～1×106拷贝质粒DNA,灵敏度可达10拷贝质粒DNA,是常规PCR法的100倍.应用所建立的方法对32份采自西藏疫区的组织样品进行检测,说明疫情在西藏没有扩散.     

Development of a Duplex PCR Assay for Detection of Avian Influenza Virus and Chicken Parvovirus

In order to establish a method to simultaneously detect avian influenza virus (AIV) and chicken parvovirus (ChPV),two pairs of specific primers were designed according to the sequences of AIV M gene and ChPV NS gene in GenBank. The duplex PCR assay was established by optimizing the reaction conditions.The tests showed that this method had high specificity, could simultaneously detect AIV and ChPV and no specific band was amplified for other subtypes avian pathogenic virus. The sensitivity result showed that the lower detection limit of this method was 100 fg. The results of 159 clinical samples were consistent with the sequencing results of PCR positive product. The double PCR methods for detection of AIV and ChPV established in this study had the characteristics of good specificity and high sensitivity, which was of great significance to the prevention control of AIV and ChPV.     

禽流感病毒与鸡细小病毒二重PCR检测方法的建立

为建立一种能同时鉴别诊断禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）和鸡细小病毒（chicken parvovirus,ChPV）的检测方法,本研究根据GenBank中AIV的M基因和ChPV的NS基因保守序列,分别设计并筛选出两对特异性引物,用于AIV和ChPV的检测。通过优化反应条件,建立了AIV和ChPV二重PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异好,能同时检测AIV和ChPV,对其他常见的禽病病原体均未反应;该法对AIV和ChPV的检测下限均为100 fg;对159份临床样品检测结果与PCR阳性产物测序结果一致。本研究建立的AIV和ChPV二重PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高的特点,对AIV和ChPV的防制具有重要意义。     

以鸡毒支原体pvpA基因序列建立的套式PCR检测方法

本试验以GenBank中登录的鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)的特异性黏附蛋白pvpA基因序列为目标,用两对引物对鸡毒支原体DNA进行套式PCR扩增,建立套式PCR扩增体系,并进行了套式PCR的敏感性和特异性试验。结果显示,应用该PCR方法对MG DNA的检出限为0.18 pg/μL;以鸡常见细菌、病毒DNA为模板进行PCR扩增,均未扩增出条带,说明该方法特异性强,适用于临床对MG早期感染的检测。     

Design, validation, and absolute sensitivity of a novel test for the molecular detection of avian pneumovirus.

This study describes attempts to increase and measure sensitivity of molecular tests to detect avian pneumovirus (APV). Polymerase chain reaction (PCR) diagnostic tests were designed for the detection of nucleic acid from an A-type APV genome. The objective was selection of PCR oligonucleotide combinations, which would provide the greatest test sensitivity and thereby enable optimal detection when used for later testing of field materials. Relative and absolute test sensitivities could be determined because of laboratory access to known quantities of purified full-length DNA copies of APV genome derived from the same A-type virus. Four new nested PCR tests were designed in the fusion (F) protein (2 tests), small hydrophobic (SH) protein (1 test), and nucleocapsid (N) protein (1 test) genes and compared with an established test in the attachment (G) protein gene. Known amounts of full-length APV genome were serially diluted 10-fold, and these dilutions were used as templates for the different tests. Sensitivities were found to differ between the tests, the most sensitive being the established G test, which proved able to detect 6,000 copies of the G gene. The G test contained predominantly pyrimidine residues at its 3' termini, and because of this, oligonucleotides for the most sensitive F test were modified to incorporate the same residue types at their 3' termini. This was found to increase sensitivity, so that after full 3' pyrimidine substitutions, the F test became able to detect 600 copies of the F gene.     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠序列地高辛探针的制备和应用

根据GPV H1株核苷酸序列，设计了扩增VP1-VP3基因非重叠序列的1对引物，对其结构蛋白VP1与VP3非重叠核苷酸序列进行PCR扩增，将PCR产物纯化、回收后制备出GPV VP1-VP3基因DIG标记核酸探针，其标记效率达到0．1pg／μl。特异性检测结果表明，该探针能与GPV不同毒株核酸发生特异性杂交，而与对照的DPV、GPMV等病毒的核酸杂交反应均为阴性；敏感性检测结果表明该探针对GPV的最低检出量为0．032ng。上述试验结果表明该探针可以用于GPV感染临床病料的检测。     

Establishment and Application of Real-time Quantitative PCR Assay for Detection of Classical Swine Fever Virus

A Real-time quantitative PCR assay for detection of classical swine fever virus (CSFV) was developed using the specific probe and primers designed basing on the E2 gene of CSFV. The Real-time quantitative PCR assay was established using the total RNA of CSFV as template. The specificity, sensitivity and repeatability of the assay were tested, and samples taken from clinic suspicious CSFV infected pigs had been testified by the established assay. The results indicated that the Real-time quantitative PCR assay was successfully established, and showed a good linear relationship at a template range of 10¹ to 10⁶ copies/μL with a coefficient correlation of 0.999; The specificity of the assay revealed that amplifications were showed on CSFV samples, but other pathogens had no amplifications; The sensitivity of the assay was 10 copies/μL nucleic acid and 1 TCID₅₀/mL virus; Meanwhile,19 positive samples were detected, which were consistent with results of CSFV detected by Nested RT-PCR, cloning and sequencing. The eatablished Real-time quantitative PCR assay was specific, sensitive rapid and suitable for early detection and epidemiological study of CSFV.