草鱼小肽转运载体PepT1基因的克隆与表达特征

采用同源克隆和RACE技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PepT1基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为2 762 bp,包含141 bp的5′UTR序列,479 bp的3′UTR序列,2 142 bp开放阅读框,编码713个氨基酸;草鱼与鲫(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)的核苷酸同源性分别为77.6%和74.0%,氨基酸同源性分别为78.0%和76.7%;与其他物种的核苷酸同源性为53.9%～59.1%,而氨基酸的同源性为57.2%～61.8%。经预测,其编码蛋白的分子量为79.29 kD,等电点为5.87,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的11个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守;系统进化分析表明,草鱼PepT1基因与鲫鱼和斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-time PCR技术检测了该基因的时空表达,结果显示,PepT1在草鱼前肠组织表达量最高,其次是肌肉组织;草鱼出膜7 d后PepT1 mRNA表达量相对稳定;昼夜节律研究发现,肠道PepT1基因夜间的表达量较白天高。本研究旨在为小肽转运载体PepT1介导肠道转运小肽调控草鱼对饲料蛋白消化吸收的分子机理提供理论基础。     

草鱼C1qC基因的克隆及表达分析

为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)诱导后,草鱼C1qC基因在鳃、皮肤、肌肉、肝、中肾、心脏、头肾等组织中的mRNA表达水平均显著上调。在草鱼胚胎发育的各个阶段都能检测到C1qC mRNA的表达,说明该基因可能在草鱼胚胎和鱼苗的免疫反应和早期发育中起重要作用。本研究将为今后在草鱼免疫功能方面深入研究C1qC基因提供基础资料。     

草鱼NADPH氧化酶2个调节亚基cDNA的克隆及表达特征

为了解草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NADPH多酶复合体的基因结构及其在机体的防御体系中的功能,利用RT-PCR结合RACE-PCR的方法,克隆草鱼NADPH氧化酶的2个调节亚基p40phox和p47phox的cDNA,对其编码的氨基酸序列进行了同源性比较和功能域分析,同时对这两个亚基在草鱼不同组织中的差异性表达进行分析。结果显示:p47phox亚基cDNA序列全长为1 589 bp,开放阅读框长度为1 233 bp,编码410个氨基酸;p40phox亚基cDNA序列全长为2 103 bp,开放阅读框为1 068 bp,编码355个氨基酸。这两个亚基编码的氨基酸序列与其他鱼类的同源性在68%~96%,具有其它鱼类类似的PX,SH3,PB1和PC功能域。组织差异性表达分析结果表明:2个调节亚基在草鱼胸腺、心脏、头肾、鳃、肠、肝、肾、脾和皮肤组织中均有表达,在不同组织中的表达强度略有差异,在心脏、胸腺中表达水平最高,在肝脏中表达水平较低,但是不同组织之间的表达水平差异不显著(P>0.05)。     

草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达

根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。     

草鱼TLR9基因全长cDNA的克隆及特征分析

采用同源克隆及快速扩增cDNA末端技术,从草鱼鳃组织中克隆了Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)基因的cDNA全长。序列分析表明,草鱼TLR9 cDNA全长3 468 bp,编码1 058个氨基酸,其中包括18个氨基酸组成的信号肽、16个富含亮氨酸重复结构域(leucine rich repeat,LRR)、1个跨膜区和1个TIR结构域(Toll/IL-1 receptor)。该蛋白的分子量为121 921 u,等电点为8.80。氨基酸序列的同源性分析显示,草鱼TLR9与鲤TLR9的同源性最高(85%),依次为斑马鱼(82%)、大西洋鲑(55%)、虹鳟(55%)。在系统发生树上,草鱼TLR9首先与鲤科的鲤和斑马鱼聚类。通过半定量RT-PCR检测可知,草鱼TLR9在被检测的15个组织中都有表达,其中在鳃中的表达最高,其次为血、头肾等。这些结果为进一步深入研究TLR-9的功能及开发草鱼免疫增强剂奠定基础。     

草鱼NK-lysin基因的克隆、原核表达与活性分析

为研究草鱼抗菌肽NK-lysin基因的组成结构、在组织中的表达差异及其抑菌活性,实验根据已知鱼类NK-lysin基因保守区序列设计上下游引物,采用RT-PCR和RACEPCR技术克隆草鱼NK-lysin基因(Cinkl),RT-PCR进行各组织间的表达分析,并构建Cinkl成熟肽的原核表达载体,采用琼脂糖孔穴扩散法检测重组蛋白的抑菌活性。结果显示,Cinkl c DNA全长768 bp,编码121个氨基酸;基因组DNA全长3 361 bp,包含4个外显子和3个内含子。经多序列比对分析和结构域预测表明,Ci Nkl氨基酸序列具有SAPLIP家族的特征:含有6个保守的半胱氨酸和saposin B蛋白结构域,与斑马鱼Nklc、Nkld的相似性分别为57.98%和63.03%。构建NK-lysin氨基酸序列系统进化树,发现Ci Nkl与斑马鱼Nklc、Nkld聚为一支。RT-PCR检测结果显示,Cinkl m RNA在所有检测的草鱼组织中均有表达,在脾脏中表达量最高,心脏、鳃、中肾和头肾的表达量次之,皮肤、脑、肝脏和肠有微量表达。p ET-28b-MBP与Ci Nkl成熟肽序列构建的原核表达质粒在宿主菌Rosetta(DE3)表达出约57 ku的可溶性融合蛋白,利用Ni-NTA His·Bind树脂进行纯化,Ci Nkl重组蛋白对G–细菌如大肠杆菌M15株、嗜水气单胞菌,以及G+细菌如金黄色葡萄球菌均具有抑菌活性。基于草鱼NK-lysin的组织表达特征和重组蛋白的抑菌活性,推测NK-lysin在草鱼的先天性免疫防御中发挥调节作用。     

草鱼褪黑激素受体Mtnr1基因克隆及组织表达分析

为了探究褪黑激素受体(melatonin receptor,Mtnr1)基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)中的表达模式和功能,采用RACE技术从草鱼组织中克隆获得Mtnr1基因的6个亚型(Mtnr1Aa、Mtnr1Ab、Mtnr1Alike、Mtnr1Ba、Mtnr1Bb和Mtnr1C)的cDNA序列,采用ProtParam、TMpred、NetPhos、NetNGlyc、Singal4.1及Phyre2等在线软件对Mtnr1基因的6种亚型进行生物信息学分析。同时,通过实时荧光定量PCR检测6种亚型在不同组织中的表达。结果显示,Mtnr1基因6个亚型cDNA全长分别为2045、2036、2031、2799、2535和2477 bp,分别编码350、351、344、356、347和361个氨基酸。6种亚型均由7个跨膜结构域、NRY结构域、CYICHS结构域和NAXXY结构域及G蛋白偶联受体结合位点组成,同时含有多个磷酸化位点和糖基化位点。Mtnr1基因6个亚型蛋白均由20种氨基酸组成,均属于稳定的亲水性蛋白。氨基酸序列比较分析发现,6种亚型与其他鱼对应的亚型同源性很高,分别为93.1%~99.4%、84.8%~95.2%、82.8%~96.8%、90.1%~97.5%、79.7%~98.3%和90.6%~95.6%。邻接法构建系统进化树显示,6种亚型均与鲤科(Cyprinidae)鱼类聚为一支,与鲤鱼(Cyprinus carpio)、鲫鱼(Carassius auratus)和斑马鱼(Danio rerio)亲缘关系最近。此外,6种亚型mRNA在草鱼肝脏、心脏、鳃、脑、肌肉、前肠、中肠、后肠和肾脏9个组织中均有表达,其中,Mtnr1Aa和Mtnr1Ba基因分别在脑和肾脏中表达量最高,表明Mtnr1Aa和Mtnr1Ba可能在草鱼的神经调节和免疫反应中发挥重要作用。     

草鱼免疫球蛋白M重链基因的克隆及表达

用RACE-PCR方法扩增出草鱼免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM) 分泌型的重链全长cDNA.其cDNA全长为1 940 nt,包含5'非编码区20 nt,3'非编码区189 nt,开放阅读框1 731 nt,编码576个氨基酸.序列比对分析表明草鱼IgM与鲤的相似性高达68%,与斑马鱼、斑点叉尾鱼回、鳜以及大西洋鳕的相似性分别为61%、43%、33%和30%.ClustalX比对结果显示:草鱼IgM中存在半胱氨酸和色氨酸的保守位点.进化分析表明,草鱼IgM与斑马鱼的IgM聚为一枝.荧光定量PCR显示草鱼IgM的mRNA主要在头肾、中肾和脾脏中表达,表明了这三个免疫器官是IgM表达的主要场所.     

草鱼α-淀粉酶基因组织表达特征和早期发育的表达谱

为获知α-淀粉酶(α-amylase,AMY)在鱼体内的组织分布以及在鱼类早期发育过程中的特征,从消化酶的角度阐明鱼类对糖的利用机理,实验在获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)α-淀粉酶基因编码区序列的基础上,应用实时定量PCR(real-time PCR)检测了草鱼α-淀粉酶基因在不同组织和早期发育不同时期的相对表达量。序列分析结果显示:草鱼的α-淀粉酶的ORF框长1 539 bp,编码512个氨基酸,氨基酸同源性比对发现草鱼α-淀粉酶与其它物种的同源性很高,且在关键活性位点处均保守,其中与斑马鱼(Danio rerio)α-淀粉酶氨基酸的同源性最高,为92%,与人的同源性最低,为72%。对血液、心脏、肝胰脏、肾、肌肉、脑、前肠、中肠、后肠9个组织定量分析结果显示:草鱼α-淀粉酶基因在肝胰脏中的表达量最高,在前肠、中肠和后肠能检测到明显的表达,在心脏和肾脏仅能检测到微弱的表达。早期发育定量分析结果显示:从未受精卵到神经胚都没有检测到α-淀粉酶基因的表达,从器官形成期开始检测到微弱的表达,一直到出膜后48 h表达都很微弱,出膜72 h之后表达量升高较明显。对组织分布和早期发育的定量研究结果分析表明:肝胰脏并不是草鱼生成α-淀粉酶的唯一场所,在肠道中也有α-淀粉酶的合成;从出膜72 h仔鱼开口摄食之后,α-淀粉酶基因表达量增加得较明显,推测摄食能够促进α-淀粉酶基因的表达。     

草鱼Stefin克隆表达、纯化及活性特征鉴定

文章克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Stefin c DNA全长序列,全长294 bp,编码97个氨基酸,无二硫键,N端存在高度保守的Gly(3、4)残基及QXVXG(45~49)序列,比对结果显示其氨基酸序列与Burton's mouthbrooder(Haplochromis burtoni)Stefin A1一致性最高,为47.5%。进化树分析表明草鱼Stefin A与Burton's mouthbrooder(Haplochromis burtoni)、southern platyfish(Xiphophorus maculatus)、Colisa chuna(Trichogaster chuna)、lamprologini(Neolamprologus brichard)、elephant shark(Callorhinchus milii)及bicolor damselfish(Stegastes partitus)Stefin A聚为一类。将构建的原核表达载体Stefin-Pet30a转入E.coli BL21,以1 mol·L-1IPTG诱导表达重组Stefin蛋白,而后经梯度尿素洗涤和镍亲和层析纯化,并分别利用SDS-PAGE和TSK-GEL G2000SWxl高效液相色谱检测诱导及纯化效果,SDS-PAGE结果显示重组Stefin蛋白得到高度纯化,最终呈现相对分子量11.4 k D的单一条带;其在高效液相上保留时间25.98 min处亦呈单一活性峰,纯度为96.28%。以荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)测活法鉴定重组草鱼Stefin对鲤鱼组织蛋白酶B、L的抑制活性,发现该重组蛋白对二者均体现了明显的抑制活性。     

草鱼生长激素cDNA基因的克隆及序列分析

通过反转录PCR技术，从草鱼脑垂体的总RNA中获得一特异cDNA片段，经克隆后测序，结果表明，该片段长633bp，与报道的草鱼生长激素基因相比，有10个碱基的差异，而推导的蛋白质仅1个氨基酸残基的差异，推测为草鱼生长激素cDNA基因。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成纤维细胞生长因子8的cDNA克隆及特征分析

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象,利用RACE技术克隆了草鱼成纤维细胞成长因子8(Fibro-blast Growth Factor8,FGF8)cDNA序列。实验结果显示,草鱼FGF8 cDNA序列长度为887 bp,其中5′-非翻译区长100 bp,3′-非翻译区长157 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,编码210个氨基酸的前体蛋白,包含22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。利用已知的FGF8序列绘制系统发育树,发现草鱼与两种鲤科鱼(班马鱼、墨西哥脂鲤)聚为一簇,显示亲缘关系很近,而与其它脊椎动物如两栖类、鸟类、哺乳类的亲缘关系则相对较远,这与形态分类学的结果一致。此外,还通过生物信息学分析,揭示了草鱼FGF8的分子结构特征。     

氯氰菊酯暴露对草鱼4种器官组织结构的影响

通过氯氰菊酯对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)幼鱼(9.30±0.48)g的急性毒性实验及对鳃、肝、肾、脾的组织学研究,探讨了随着氯氰菊酯浓度的增加以及暴露时间的延长草鱼组织结构损伤的变化趋势.结果显示:氯氰菊酯对草鱼种的48 h-LC50和96 h-LC50分别为55.21μg/L和25.00...     

诺氟沙星在草鱼体内的残留规律研究

研究了多剂量混饲口灌给药方式下,诺氟沙星在草鱼体内的残留消除情况。结果显示：以每千克鱼体重10 mg连续5d混饲给药后,停药后第12天在草鱼肌肉中未检测到药物,此时血清、肝脏和肾脏中的药物浓度分别降为（0.0287±0.0015）μg/mL、（0.0181±0.0042）μg/g和（0.0369±0.0037）μg/g,均低于0.05μg/mL或0.05μg/g。因此初步建议在（19±1）℃水温条件下,以每千克鱼体重10 mg连续5 d混饲给草鱼诺氟沙星,休药期至少为最后一次给药后的12 d。     

饲喂蚕豆的草鱼肠道细菌群落的PCR-DGGE 分析

为探讨饲喂蚕豆（ Vicia faba）对草鱼（ Ctenopharyngodon idellus）肠道菌群的影响,采用PCR-DGGE技术比较了饲喂蚕豆的草鱼（脆肉鲩组）及饲喂配合饲料的草鱼（普通草鱼组）肠道微生物菌群的异同。结果显示, DGGE图谱上出现了20条明显条带,表明脆肉鲩组及普通草鱼组肠道中均存在大量细菌群落。对这20条条带测序后,获得了其中17条条带的序列,这17条条带中有9条是尚未被培养的细菌。经分析发现,这17条条带分属于变形菌门（ Proteobacteria ）、放线菌门（ Actinobacteria ）、厚壁菌门（ Firmicutes ）、拟杆菌门（ Bacteroidetes ）及未分类的细菌,其中变形菌门为两组肠道的优势菌。实验还发现,饲喂蚕豆对肠内容物菌群的影响大于对肠壁菌群的影响。结果表明,饲喂蚕豆不改变草鱼肠道菌群的种类,但对肠道菌群的相对丰度有一定影响。     

草鱼-淀粉酶基因5，侧翼序列克隆与分析

应用PCR和Genome Walking技术克隆获得长度为168 bp的草鱼（Ctenopharyngodon idellus）-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列和2 063 bp的5'侧翼序列。将草鱼-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列与已知几种鱼类-淀粉酶基因外显子Ⅰ序列比对,相似度为68%~86%。将草鱼-淀粉酶基因5'侧翼序列进行生物信息学分析,确定了其转录起始区域及转录起始位点（TSS）;在TSS上游30 bp处有1个TATA-box,-58 bp处有CCAAT-box;在5'侧翼序列中还发现有GATA-1、OCT-1、GR、HNF-3、AP1和SP1等转录因子结合位点。草鱼-淀粉酶基因5' 侧翼序列的克隆,为进一步研究不同食性鱼类-淀粉酶基因侧翼序列的差异、鱼类-淀粉酶基因的表达、功能及调控机理奠定基础。     

草鱼胰岛素样生长因子_基因克隆及序列分析

采用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从草鱼肝脏的总ＲＮＡ中扩增出胰岛素样生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）基因序列,定向克隆至质粒pUC18,测宇了该基因序列,推导期编码的蛋白序列,克隆的cDNA序列编码包括Ｂ,Ｃ,Ａ,Ｄ和Ｅ五个区域的１７个氨基酸,与鲤ＩＧＦ－Ｉ成熟肽比较,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为９３．８％和９７．１％,E区域分析结果表明,所克隆的草鱼ＩＧＦ－Ｉ序列属于ＩＧＦ－ＩＥa-2亚型。     

草鱼成熟脂肪细胞总RNA提取方法研究

获得高质量的RNA是逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern blot以及转录组测序(RNA-Seq)等分子生物学研究的基础,由于草鱼脂肪细胞中油脂含量较高,从中提取高质量RNA存在困难。本研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成熟脂肪细胞为材料,通过增加离心和抽提次数等方式对传统总RNA提取方法进行优化,采用琼脂糖凝胶电泳、核酸定量分析及基因扩增等方法验证所得RNA的完整性、纯度及质量。结果表明,经此方法提取的草鱼成熟脂肪细胞总RNA的A260 nm/A280 nm比值在1.95到2.00之间,28S和18S条带完整,草鱼LPL和β-actin基因扩增条带清晰。认为采用本方法获得的草鱼脂肪细胞RNA样品质量较高,能够用于后续分子生物学研究。     

博斯腾湖草鱼生长特征的研究

根据2014年8月采集的33尾标本对博斯腾湖草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的生长特征进行研究。以鳞片为年龄和生长退算材料,研究结果显示:博斯腾湖草鱼体重与体长表现为异速生长,关系式为W=0.0444SL~(2.8322)。用退算体长拟合的von Bertalanffy生长参数为:SL_8=103.7664 cm,k=0.1385/y,t_0=-0.0542 y。体重生长参数为:W_8=22.7674 kg,k=0.1385/y,t_0=0.0027 y。生长特征指数为3.16;生长拐点年龄为7.5龄,拐点时体长和体重分别为67.3 cm和6.6 kg。与1979年和2000年种群相比,受饵料供给不足的制约,博斯腾湖草鱼生长速度明显下降。草鱼增殖管理措施的制定应以恢复沉水植物资源为目标,具体措施包括:减少草鱼的投放量,草鱼最小捕捞规格降至3 kg,提高草鱼的捕捞强度和捕捞量。