坛紫菜不同色素突变体的初步研究

初步探讨了坛紫菜Porphyra haitanensis褐色、褐绿色、翠绿色、红棕色、棕褐色、桔红色和紫色7种色素突变体的子一代叶状体形态特征、生长及4种主要色素含量的变化.3～4cm长的不同色泽幼苗经20d培养后的结果显示:(1)各色素突变体从长度、宽度、鲜重量和细胞厚度方面较野生坛紫菜均具有显著优势;在培养时间内,各色素突变体的长度日增长量均显著高于野生型坛紫菜;褐绿色、棕褐色和红棕色突变体在鲜重日增重率上表现出明显的优势,在第11～15天所有色素突变体的平均日增重率均高于野生型;(2)红棕色、棕褐色和紫色突变体的总藻胆蛋白含量明显高于野生型.紫色突变体的藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量均为最高,其中藻红蛋白、别藻蓝蛋白含量为野生型的3倍.叶绿素含量均无明显变化.本研究结果为有效利用坛紫菜的不同色素突变体进行种质改良奠定了良好基础.     

坛紫菜品系间杂交分离色素突变体及其特性的初步研究

以野生选育的坛紫菜(Porphyra haitanensis)为母本,诱变选育全棕红的品系为父本进行杂交实验,从杂交子代大量叶片中,筛选出1株褐黄色素突变体、1株翠绿色与野生色相嵌的嵌合体和1株褐绿色与野生色相嵌的嵌合体。通过酶法分离突变体的营养细胞,单性生殖获得丝状体;分别使丝状体成熟并放散壳孢子,然后单株培养和筛选获得褐黄、翠绿和褐绿色子代叶状体。实验进行50 d。结果:(1)褐黄色突变体藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量低;孢子囊枝的细胞较小,且大量形成时间比亲本晚15 d;幼苗培养初期日平均生长量仅为(1.22±0.28)cm,当叶片长到60 cm左右时生长优势逐步凸显,日平均生长量可达(7.50±1.18)cm;(2)翠绿色丝状体容易成熟,发育方式特殊,营养藻丝不经过藻丝加粗阶段,直接由球形细胞发育成孢子囊枝和壳孢子囊;翠绿色叶状体藻红蛋白含量低,仅有(5.513 0±1.049 6)mg/g(干品);叶状体生长快速,60 cm长的藻体日平均生长量高达(11.95±2.33)cm;(3)褐绿色突变体藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蛋白这3种色素蛋白和叶绿素的含量均较低;藻丝细胞短且细,叶状体生长速度较慢。     

坛紫菜人工色素突变体的诱变与分离

坛紫菜叶状体经一定剂量的^60Cos-γ射线辐射再培养一段时间后,出现了少量色素体颜色发生变异的细胞,它们呈点状无规则地镶嵌在野生型细胞中。培养3周后,色素变异细胞分裂并形成了不同颜色的细胞块,其颜色呈桔红、桔黄、浅黄褐、浅红、紫红、紫褐、黄绿、绿色等。在辐射剂量0～1100Gy范围内,叶状体上色素变异细胞块的出现频率随着辐射剂量的增加而增加;但辐射剂量增至1．400Gy时,色素变异细胞块出现的频率反而下降,说明1100Gy是合适的辐射剂量。在同一个叶状体的不同部位上色素变异细胞块出现的频率足不同的,从基部到稍部,随着部位的上移而逐渐增加。用酶解法把含色素变异细胞的叶状体细胞单个分离出来并进行离体培养,在它们的再生体中,出现了多种单色的色素突变叶状体,从中分离到tan(红褐色)、bor(深桔红色)、ceb(紫红色)、hon(枯草色)、cac(深黄绿色)等不同颜色的纯色突变体。从各单色突变体中分离出来的丝状体,其颜色与各自的叶状体相同。各突变体的丝状体成熟后,放散的壳孢子长成单色的F1叶状体,其颜色与各自最初的母体叶状体相同,说明所得到的上述突变体是稳定的色素突变体。     

坛紫菜两种Hsp90基因的克隆及表达特征分析

以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆获得了坛紫菜的两条Hsp90基因序列:PhHsp90-1和PhHsp90-2。序列分析结果表明,PhHsp90-1序列全长2 572 bp,包含一个2 427 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含809个氨基酸,分子量为90.2 ku,等电点为4.79,属于Hsp90内质网亚家族(登录号:KF732651);PhHsp90-2序列全长2 510 bp,包含一个2 280 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含760个氨基酸,分子量为86.2 ku,等电点为4.81,属于Hsp90细胞质亚家族(登录号:KF732652)。基因表达水平的定量分析结果表明,高温和失水胁迫对两条PhHsp90基因的表达水平均有显著影响,但在表达模式上存在明显差异。高温胁迫不同时间水平下,两条PhHsp90基因的表达均表现为先上调后下调的趋势;而在失水胁迫下,当失水率小于60%时,两条基因的表达水平均没有发生显著变化,但当失水率大于60%时,两条基因的表达水平均显著上调,说明两条PhHsp90基因均在应答高温胁迫和高度失水胁迫中发挥着重要作用。     

坛紫菜两种小分子热激蛋白(sHSP)基因的克隆及表达特征分析

小分子热激蛋白(sHSP)不仅在应激条件下高效表达,而且在正常状态的细胞中也广泛存在,参与一些重要细胞生理活动的调节。为研究坛紫菜应答高温和失水等逆境胁迫的分子机制,本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE或直接PCR扩增,克隆获得了坛紫菜两种sHsp的全长基因：PhHsp22和PhDnaJ。序列分析结果表明,PhHsp22序列全长857 bp,包含一个519 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含172个氨基酸,分子量为19.1 kDa,等电点为5.24(收录号：KM102540);PhDnaJ序列全长1616 bp,包含一个1290 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含429个氨基酸,分子量为46.1 kDa,等电点为6.43,属于Hsp40亚家族(收录号：KM102541)。基因表达水平的定量分析结果表明两个基因在高温胁迫不同时间水平和不同失水胁迫程度下的表达均呈现出一致的表达模式,即在胁迫初期表达水平显著上调,但随着胁迫的持续,这两个基因的表达水平开始逐渐下调。说明这两个基因在逆境胁迫下的表达可能存在一个反馈调节机制。     

坛紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)家族基因的克隆及表达特征分析

6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)是植物海藻糖合成的关键酶,在植物逆境胁迫应答中发挥着重要的作用.实验以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE技术克隆获得坛紫菜的3条TPS基因序列:PhTPS1,PhTPS2-1和PhTPS2-2.序列分析结果表明,PhTPS1(收录号:KM580358)序列全长3 557 bp,包含一个3 462 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 153个氨基酸,分子量为124.2 ku,等电点为6.73,属于TPS Ⅰ亚家族;PhTPS2-1(收录号:KM519457)序列全长4 264 bp,包含一个4 044 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 374个氨基酸,分子量为145.2 ku,等电点为5.96;PhTPS2-2(收录号:KM519458)序列全长3 733 bp,包含一个3 324 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 107个氨基酸,分子量为120.2 ku,等电点为5.42.PhTPS2-1和PhTPS2-2属于TPSⅡ亚家族.基因表达水平的定量分析结果表明高温胁迫条件下,3条PhTPS基因的表达模式基本一致,均表现为先上调后下调,再上调的趋势;而PhTPS1和PhTPS2-1基因在中低水平的失水条件下,基因表达水平均没有发生显著变化,只在高水平失水胁迫下显著上调,PhTPS2-2基因在中高水平失水条件下,表达水平显著上调.说明PhTPS基因可能只在高度失水胁迫下发挥应激调节作用.     

低盐胁迫下坛紫菜叶状体的转录组分析

为探索坛紫菜叶状体响应低盐胁迫的分子生理学机制,本研究采用第二代高通量测序技术,分析比较在正常盐度(26,对照组)和低盐度(3,胁迫组)下培养不同时间(3、6和9 h)的坛紫菜叶状体转录组数据。结果显示,测序数据经de novo组装,获得了33 872条unigenes,平均长度为612 bp;与对照组相比,3个胁迫组分别产生了1108、1638和1881条差异性表达基因。GO功能富集分析显示,一些可能与低盐胁迫相关的重要生物过程得到了显著富集,如单分子有机物代谢过程,单糖的合成代谢和分解过程,糖质新生,有机物分解代谢过程等。KEGG代谢通路富集分析发现,低盐胁迫不同时间富集到的代谢通路存在很大差异,低盐胁迫3 h响应的差异性表达基因富集到3个KEGG代谢通路,其中2个与氨基酸合成相关,1个与光合作用相关;而低盐胁迫6和9 h的差异性表达基因则大多富集到与糖类功能相关的代谢通路。荧光定量PCR(q RT-PCR)验证结果显示,所选取的8个差异性表达基因的表达趋势与高通量测序结果相一致。上述结果说明,坛紫菜叶状体在受到低盐胁迫时,应激反应具有时间特异性,早期主要通过合成或者降解蛋白质来抵御低盐环境,随着胁迫时间延长,细胞通过改变可溶性物质的含量、减慢能量代谢等途径以抵御低盐逆境。     

短波紫外线辐照坛紫菜壳孢子制备色彩突变体的新途径

壳孢子萌发时期是坛紫菜(Pyropia haitanensis)减数分裂发生的时期,壳孢子萌发形成的最初4个细胞呈线性排列,形成减数分裂四分体,且发生遗传重组的四分体细胞可以决定叶状体的发育模式和性状分离。因此,诱变产生色彩突变的嵌合叶状体相比诱变叶状体产生的点状色块,将更易于获得突变细胞。本研究为获得坛紫菜人工色彩嵌合突变体,使用不同剂量(50、100、200、300、400、500和600 J/m2)的短波紫外线(UV-C,λ=254 nm)辐照坛紫菜壳孢子,培养数天后,在壳孢子苗中出现了色彩突变的嵌合叶状体。结果显示,低剂量(50 J/m2)的辐射促进壳孢子萌发,而辐照剂量高于100 J/m2则会抑制壳孢子萌发和分裂。辐照剂量在50~400 J/m2范围内,色彩突变体出现的频率随辐照剂量的增加而增加,辐照剂量分别为300和400 J/m2时,突变率分别达到15.22%和17.18%。其中,出现色彩突变的嵌合叶状体以2色块嵌合体和3色块嵌合体居多,4色块嵌合体最少,但辐照剂量增加至400 J/m2以上时,随着辐照剂量的增加,色彩突变体出现的频率反而下降,表明最适宜的诱变剂量为300或400 J/m2。同时,短波紫外线辐照也使色彩突变嵌合体的长宽比下降,采用生物酶解法从色彩嵌合体中分离出了单色的体细胞萌发体。本研究为坛紫菜人工色彩突变体的制备和诱变育种提供了新途径。     

坛紫菜减数分裂位置的杂交试验分析

利用坛紫菜人工色素突变体与野生型进行杂交试验,通过观察F1叶状体中是否出现颜色分离和颜色嵌合体来证明坛紫菜减数分裂发生的确切位置。以红色型人工色素突变体(SPY1和R10)作为母本,其特征:叶状体呈红色或桔红色,藻体薄而弹性差,无边缘刺;以野生型(wt)作为父本,其特征:叶状体呈棕绿色,藻体厚而富有弹性,有丰富的边缘刺。在杂交组SPY1(♀)×wt(♂)和R10(♀)×wt(♂))的F1叶状体中,均出现了2种亲本色和2种新颜色,它们分别为红色(R,母本色),野生色(W,父本色),浅红色(R′,比R色稍浅)和似野生色(W′,比野生色稍红)。4种颜色在F1叶状体上,出现了分离并形成了呈直线型排列的不同色块,从而产生了大量由2～4个色块组成的颜色嵌合体;单个嵌合体上的色块数最多为4块。在颜色嵌合体中,R和R′2种色块的藻体薄而弹性差,无边缘小刺,而W和W′2种色块的藻体厚而弹性好,富有边缘刺。在F1叶状体中,颜色嵌合体占95.2%～96.7%,单色叶状体只占3.3%～4.8%。上述结果说明,坛紫菜杂合丝状体产生的壳孢子,其萌发时进行的最初两次细胞分裂是减数分裂,它所产生的4个子细胞继续分裂,最终发育成含2～4个色块组成的颜色嵌合体;2种新颜色是由于在减数分裂的第一次分裂时发生了染色体交换和重组所产生的。本文使用的两个色素突变体,除含2个或2个以上的颜色变异基因外,还含有分别与藻体厚薄和边缘刺出现相关的变异基因,并且它们与颜色变异基因是连锁的。F1颜色嵌合体中的重组色块在3种主要光合色素和色素蛋白的含量、生长速度和成熟早晚等方面均表现出比亲本色块更好的特性,暗示利用色素突变体杂交方法有可能培育出坛紫菜的优良品系。     

高温胁迫下条斑紫菜叶状体HSP70基因的表达谱分析

采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了条斑紫菜叶状体在25℃高温胁迫下PyHSP70-1基因的相对表达量变化。定量分析显示PyHSP70-1基因表达受到高温胁迫的显著诱导。在持续高温胁迫下,PyHSP70-1表达量在8 h时达到最大,此后一直维持在较高水平,且与对照差异显著。在短暂高温胁迫结束后PyHSP70-1表达量最大,随着恢复时间的增加,其mRNA量逐渐减少,在恢复的24 h时间内,mRNA量仍然显著高于对照。结果表明PyHSP70-1是诱导型HSP,受热激诱导表达,在热激胁迫中维持细胞蛋白与膜的稳定,对细胞具有重要的保护作用。     

坛紫菜杂交品系优势的初步评价

通过坛紫菜诱变选育品系和野生选育品系间杂交,筛选出了4个经济性状优良的杂交品系(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ);杂交品系的子代表现出较大的杂交优势,既具有亲本优势,又具有超亲优势;品系Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的3～5cm幼苗经过10d培育,平均日增重量的超标优势分别达12.35%、139.78%、107.57%和173.52%;杂种优势指数达99.83%、213.07%、184.44%和243.05%;品系Ⅱ耐高温能力较强,在29℃水温中可正常生存10d以上;品系Ⅲ在4个杂交品系中生长最快,培育20d时藻体的平均长度是父本的1.29倍,总藻胆蛋白含量最高,达(103.83±0.49)mg/g干品;品系Ⅳ和Ⅴ藻体宽而薄,不易腐烂和老化,其中品系Ⅳ叶绿素含量高达(9.79±0.48)mg/g干品,比母本高46.21;从杂交品系的性状稳定性来看,品系Ⅱ的F2和F3叶状体长度生长相对稳定,品系Ⅲ的F3叶状体经过选育后,生长性能比F2叶状体更加突出。和F2叶状体相比,品系Ⅳ的F3各项指标表现出较大的稳定性。本研究为坛紫菜杂交育种的应用积累了有用资料。     

海水围塘生态栽培坛紫菜

紫菜（Porphym sp）原是生长在潮间带的岩礁上,尤其是在风浪大、潮流畅通的海区生长良好。经过多年的人工栽培,紫菜已适应于在潮间带和浅海的养殖筏架的栽培。坛紫菜（Porphyra haitanensis）作为浙江、福建海区常见的栽培藻类和重要的食用经济海藻,有近40年栽培的历史。但潮间带可以用作栽培坛紫菜的空间越来越小,必须开拓新的栽培空间。在围塘栽培紫菜则是一种新开拓的栽培方法。     

Increasing transient expression of CAT gene in Porphyra haitanensis by Matrix attachment regions and 18S rDNA targeted homologous recombination

To test whether matrix attachment regions (MARs) and 18S rDNA can influence CAT gene transient expression positively in the red algae Porphyra haitanensis, a targeting vector pHR‐CAT containing a portion of the 18S rDNA from P. haitanensis, pMAR1‐HR‐CAT containing one MAR from silkworm and a portion of the 18S rDNA from P. haitanensis and pMAR2‐HR‐CAT containing two MARs from silkworm and a portion of the 18S rDNA from P. haitanensis were constructed. With the electroporation method, the vectors were transferred into the protoplasts from the thalli of P. haitanensis. The results showed that the expression of chloramphenicol acetyl transferase (CAT) protein in transformed cells reached a maximum at 96 h after transformation. It was increased markedly with the pMAR2‐HR‐CAT compared with the pHR‐CAT or the pCAT^@3‐control vector (P<0.01), and it was increased inconspicuously with pHR‐CAT compared with the pCAT^@3‐control vector (P>0.05). It is suggested that MAR from silkworm could enhance the transient expression of foreign genes in P. haitanensis.     

琼胶寡糖诱导坛紫菜活性氧爆发

研究了琼胶寡糖诱导坛紫菜氧爆发的响应及其活性氧产生的位点。用琼胶寡糖诱导坛紫菜,以微呼吸测量系统检测坛紫菜氧消耗的变化;以对羟基苯乙酸(POHPAA)化学发光法检测坛紫菜的H2O2释放量;利用DCFH-DA染色观察活性氧在细胞上的定位;并利用实时定量PCR检测坛紫菜NADPH氧化酶基因Phrboh的差异表达;通过2-AMAC标记琼胶寡糖,观察其在坛紫菜的结合部位。结果显示,100μg/mL琼胶寡糖处理坛紫菜,出现两次呼吸爆发,分别在4min和10min左右,强度分别是基础呼吸的4倍和14.1倍;5min内出现H2O2的积累,15min达到峰值,比对照组高出近10倍。10μmol/LDPI可部分抑制H2O2的产生。3min内Phrboh的表达已上调,并持续近10min。DCFH-DA染色显示,活性氧主要产生在膜系统上。荧光标记琼胶寡糖的定位发现,坛紫菜细胞膜上存在琼胶寡糖的结合位点。综上所述,琼胶寡糖能识别细胞膜上的结合位点,并诱导坛紫菜膜系统上的H2O2爆发,H2O2的产生与NADPH氧化酶相关。     

开敞性滩涂海区坛紫菜品系引进试验

引进“杂交重组1号”与HMY2个坛紫菜品系,以本地龙沙种系为对照组,通过苗种培育、壳孢子采苗、海上栽培及采收试验,综合评估藻体生长、采收量、经济性状及柔韧性等因素,认为：HMY坛紫菜品系综合效果较好,可作为西湾滩涂坛紫菜栽培的主推品系之一。     

坛紫菜琼胶生产工艺的研究

用高温稀碱法提取坛紫菜琼胶的工艺,并以琼胶的产率、硫酸根含量及琼胶强度为技术指标,探讨了碱处理质量分数、温度和时间3个因素对各指标的影响.试验结果表明,较合适的提取条件是碱浓度4%,温度80 ℃,处理3 h.在该条件下,能得到较理想的提取产率.     

福鼎硖门湾海区坛紫菜生理性病变的初步研究

通过对福鼎硖门湾海区坛紫菜病烂情况进行调查、采样和室内培养,运用显微观察方法,研究坛紫菜生理性病变的发生和发展过程。该病主要症状为叶状体梢部颜色逐渐变浅,然后发白、烂化,无明显病灶烂孔;病理表现为叶状体梢部细胞边缘模糊,色素体变色,然后发展为细胞边缘紊乱,细胞溶解,原生质流出,细胞结构失常。病变严重的易引发细菌和原生动物二次感染,造成坛紫菜叶状体出现溃烂,最后完全解离。雨水天气是导致该病变发生的原因,采取剪除叶状体病烂部位和晴好天气延长干出时间是控制该病变的主要措施。     

坛紫菜丝状体高密度立体培育技术研究

报导了坛紫菜果孢子采苗、丝状体培育、光照调节、促熟措施、壳孢子采苗等方面的技术和经验。在340t水体中培育贝壳丝状体1 534 600片,培育出池苗种83．3 hm~2,平均每立方米水体出苗0．24hm~2,苗种销售收入106 717元,盈利42 363元。